天花粉蛋白对宫颈癌hela细胞凋亡及bax、bcl2基因表达的影响

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1、天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及bax、bcl2基因表达的影响作者：黄益玲，黄利鸣，胡火军，黎家华,张兆祥【摘要】目的研究天花粉蛋白对人宫颈癌HeLa细胞的诱导凋亡作用并探讨其对凋亡相关基因bax和bcl2表达的影响。方法不同浓度天花粉蛋白分别处理HeLa细胞24~72h后，MTT法检测细胞的生长活性,显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞周期,EM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国GIBCOBRL公司，碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）为Simga公司产品，蛋白酶K（ProtEinas

2、eK）为Merck公司产品，噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司。一抗bcl2、bax鼠抗人单克隆抗体、βactin羊抗鼠单克隆抗体、二抗HRP标记的羊抗鼠IgG及兔抗羊IgG购于SantaCruzBiotechnology公司，TCS购自上海金山制药厂。1.1.2主要仪器及设备凝胶成像仪ThermalimagingsystemFTI500为PharmaciaBiotech产品，电转移槽为BioRad公司产品，STORM(PhospherImagerSystem)购自Dynamicmolecular公

3、司。1.2方法1.2.1细胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存，培养于5%ＣＯ2、37℃湿化孵箱中。培养基MEM含10%FBS，0.1Ｕ/Ｌ青霉素,0.1Ｕ/Ｌ链霉素,取对数生长期细胞待用。1.2.2MTT法测定TCS对HeLa细胞的生长抑制作用取对数生长期的HeLa细胞接种于96孔细胞培养板中(细胞数为每孔2×104个)，12h后加入不同浓度的TCS，每个浓度设6个平行孔，继续培养24、48、72h，每孔加入5μg/mlMTT溶液20μl继续培养4h后加入200μlDMSO溶解，测定570nm处光吸收值

4、，计算细胞生长抑制率。1.2.3细胞形态学观察将处于指数生长期的HeLa细胞以不同浓度的TCS处理后，倒置显微镜下观察HeLa细胞的形态改变。1.2.4流式细胞仪DNA含量分析离心收集经TCS作用的细胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后加入75%的冰冷乙醇固定,在10000r/min条件下离心5min，去乙醇，以PBS洗涤2次，弃上清；用0.5mlPBS重新悬浮，然后加入等体积的细胞裂解缓冲液(含1％NP40，50mmol/LTrisHCl，40mmol/LEDTA，pH值7.5)室温作用5min，离心后

5、加入RNase(终浓度30μg/ml)置37℃水浴中消化30min，离心后再加人1mlPI(终浓度50μg/ml)避光染色30min，以300目尼龙网滤过，上流式细胞仪检测，Multicycles软件分析结果。1.2.5in后，以13000r/min于4℃离心20min，调整蛋白含量,加入等量2×SDSPAGE加样缓冲液，置95℃~100℃沸水中变性5min，行SDSPAGE垂直电泳,电转PVDF膜，加50g/L脱脂奶粉于4℃冷库封闭过夜（或37℃封闭1h），PBST洗膜后，分别加一抗bcl2、bax鼠

6、抗人单克隆抗体、βactin羊抗鼠单克隆抗体(均为1∶1000稀释)37℃孵育1h，PBST洗膜；加HRP标记羊抗鼠IgG及兔抗羊IgG二抗，37℃孵育1h，PBST洗膜，等量的ECL反应液A和B混合后加至膜上1min，最后Χ片显影。1.2.6统计学分析数据以±s表示，用t检验分析差异显著性，采用Pearson相关分析进行相关检验，运用SPSS10.0统计软件分析数据。2结果2．1TCS对HeLa细胞的生长抑制作用对照组HeLa细胞体外生长活跃,实验组分别经20、40、80μg/mlTCS处理24、48、7

7、2h后，细胞生长均不同程度地受到抑制，呈时间-浓度依赖性,按公式计算相对抑制率。相对抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%，结果有统计学差异（P<0.01），见表1。表1天花粉蛋白对HeLa细胞生长的相对抑制率（%）作用时间（％）TCS浓度20μg/ml40μg/ml80μg/ml24h14.12＊22.72＊51.53＊48h30.96＊41.62＊69.78＊72h41.99＊49.63＊78.95＊注：＊与对照组比较，P<0.012．2HeLa细胞的形态学改变

8、对照组HeLa细胞为多角形或梭形，贴壁牢固。经TCS处理的实验组细胞逐渐变圆,细胞体积缩小，胞浆凝缩,折光率增强,细胞膜完整但出现发泡现象,随着时间的延长悬浮细胞逐渐增多，出现细胞凋亡的特征性改变。2．3流式细胞仪检测（PI染色法）凋亡细胞在流式细胞仪直方图上出现特征性的亚二倍体峰（subG1peak），对照组细胞的自然凋亡率为(4.1±0.4)%，用不同药物浓度的TCS（20μg/ml、40μg