紫杉醇对人骨肉瘤细胞凋亡及对bcl2、bax基因表达的影响

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1、紫杉醇对人骨肉瘤细胞凋亡及对bcl2、bax基因表达的影响作者：张春林，曾炳芳，董扬，张长青，眭述平，罗从风，陆男吉，高峰【摘要】目的了解紫杉醇诱导人骨肉瘤细胞的凋亡效果，以及凋亡与bcl2和bax表达之间的关系。方法用不同浓度的紫杉醇作用于骨肉瘤细胞MG63。采用胎盼蓝染色法，于细胞记数板进行活细胞率检测计算。采用光镜和电子显微镜对细胞形态改变进行观测，采用原位缺口末端标记凋亡检测法（TUNEL）和流式细胞术（AnnexinVFITCPI）对细胞凋亡进行检测。采用免疫组织化学法对凋亡调节基因bcl2和bax表达进行检测

2、。结果骨肉瘤活细胞率随着紫杉醇作用时间延长和浓度增高而降低。紫杉醇诱导骨肉瘤细胞MG63凋亡表现为典型的凋亡特征，包括：细胞形态学改变，细胞染色质浓聚，染色质新月形变，胞核碎裂等。TUNEL法检测到了细胞DNA片段的断裂。随着细胞凋亡的发生，开始出现G2/M期阻滞。紫杉醇可以降低凋亡相关基因bcl2的表达和增加bax基因的表达。结论紫杉醇可以通过时间依赖性和剂量依赖性方式，促使细胞G2/M期阻滞和抑制细胞有丝分裂，从而诱导人骨肉瘤细胞凋亡。这种凋亡可能受到凋亡相关基因bcl2低表达和bax高表达的调控。【关键词】紫杉醇；凋亡；

3、骨肉瘤；bcl2；bax　　Abstract：ObjectiveToinvestigatetheapoptosisinhumanosteosaracellsinducedbypaclitaxel,andtherelationshipbetinedbycellcountinacytometerchamber.Viabilityorphologicalterationsittingelectronmicroscope.ThepercentageofapoptosisofosteosaracellMG63easuredbyTdTme

4、diateddUTPNickEndLabelingtechnique(TUNEL)stainingmethodandfloetryusingAnnexinV/PIdoublestainingmethodafter0,24,48,72and96hoursofcultureinthepresenceorabsenceofpaclitaxel.Theexpressionofapoptosisregulatedgenebcl2andbaxmunohistochemicalstaining.ResultsAtimedependenta

5、nddosedependentcellgroorphologicalchangesofchromatincondensation,chromatincrescentformation,nucleusfragmentation.TheDNAcleavageprovedtheexpressionofapoptosisregulatedgenebax.ConclusionPaclitaxelisabletoinducetheapoptosisinhumanosteosaracellsthroughtheinitiationofG2

6、/Mphasearrestandinhibitingmitosisinbothatimedependentanddosedependentmanner.Thisapoptosismaybemediatedbydoancoulter公司。bcl2和bax单克隆抗体购自华美生物技术有限公司。　　1.2细胞培养和条件人骨肉瘤细胞MG63获得自中山大学病理系（细胞源自美国ATCC细胞库）。采用不同作用时间（24~96h）和不同浓度（0.001~1μmol·L-1）紫杉醇对骨肉瘤细胞MG63进行作用。　　1.3体外细胞生长抑制检测采用

7、0.4%(G63细胞生存能力进行评估，细胞培养48h后，被不同浓度的紫杉醇作用24~96h，然后用0.25%胰酶消化收集，采用0.4%胎盼蓝染色，于细胞记数板记数计算活细胞率。每种条件重复3次，取均值。　　1.4电子显微镜观察细胞被0.1μmol·L-1紫杉醇作用后24~96h，用胰酶消化后收集，用4%戊二醛固定，浸泡于Epon821中，用包埋液包埋，于60℃烘箱内固化72h。超薄切片机切片约50~60nm厚，用3%醋酸铀枸橼酸铅双染色，然后用透射电镜观察，并拍照。　　1.5TUNEL检测骨肉瘤细胞MG63凋亡采用原位缺口末端标

8、记（TUNEL）检测试剂盒进行检测，阴性对照为不加入荧光素标记的dUTP。细胞用光镜和荧光显微镜观察。凋亡指数（AI）用以下公式来计算：AI=凋亡的细胞数目/总的细胞数×100%。　　1.6流式细胞术检测采用流式细胞术（AnnexinVFITC