endostatin抑制人卵巢癌细胞生长及其在裸鼠皮下移植瘤中的作用

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1、Endostatin抑制人卵巢癌细胞生长及其在裸鼠皮下移植瘤中的作用刘梅梅，隋丽华，李佩玲，程丽【关键词】抑制　　【关键词】卵巢癌；移植瘤；内皮抑素；Bcl2/Bax　　0引言　　我们采用人浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞系及其荷瘤鼠为研究对象，研究Endostatin对其增殖、凋亡的影响及作用机制，为其应用于卵巢癌的临床治疗提供试验依据.　　1材料和方法　　1.1材料　　选用雌性6~8周龄BALB/c裸鼠10只，SPF条件下饲养.人浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3由北京医科大学人民医院妇产科馈赠，用RPMI1

2、640（含10g/L小牛血清）培养基于37℃,50mL/LCO2条件下培养.Endostatin购自烟台麦得津生物工程公司，置于4℃保存.抗Bcl2，抗BaxmAb及SP试剂盒购自北京中衫试剂公司.　　1.2方法　　1.2.1MTT法测定SKOV3细胞生长抑制率分组：PBS对照组（10mmol/LPBS）和实验组（0.1，1.0，5.0，10.0和15.0mg/LEndostatin）.SKOV3细胞以5×107/L密度接种于96孔板，每组设定6个平行孔，并设定空白对照.细胞贴壁培养24h后，分别加入上述不同浓度

3、的药物，作用48h后测定细胞A490值.计算Endostatin对卵巢癌细胞SKOV3生长的影响和抑制情况.抑制率=（PBS对照组A490-药物组A490）/PBS对照组A490×100%.　　1.2.2透射电镜下观察SKOV3细胞凋亡实验组SKOV3细胞作用不同时间（24，48和72h）后，消化离心，用4℃，0.25g/L戊二醛固定，0.1g/L锇酸后固定，系列乙醇丙酮脱水，环氧树脂包埋，制成超薄切片，透射电镜下观察细胞凋亡形态.　　1.2.3免疫细胞化学检测凋亡调控相关蛋白质表达的变化实验组SKOV3细胞爬片

4、培养作用不同时间（24，48和72h）后，丙酮室温固定10min，进行免疫细胞化学SP法染色.按说明书操作，DAB显色.结果判定：以细胞核和细胞质呈明确的棕黄色为阳性染色.　　1.2.4Endostatin对裸鼠肿瘤生长的影响　　1.2.4.1裸鼠皮下瘤模型的建立已培养的SKOV3细胞，使细胞浓度达到5×1010/L，从裸鼠右肩胛部近腋窝处进针，每只裸鼠注射一点，约1×107个细胞.观察接种部位有无渗出、肿瘤生长及裸鼠状况，待皮下瘤体积约100mm×100mm×100mm时分组实验.　　1.2.4.2Endost

5、atin对卵巢肿瘤的治疗作用将裸鼠随机分成治疗组和对照组，每组5只.实验组裸鼠每日皮下注射Endostatin20mg/kg，注射部位远离肿瘤形成部位，对照组以同样方法每日注射PBS.每日测量肿瘤长度和宽度，计算肿瘤体积.治疗21d后将裸鼠处死，剥离出皮下肿瘤，备用.　　1.2.5Endostatin对肿瘤组织中细胞凋亡的影响将切下的瘤组织置于0.25g/L戊二醛中，4℃固定，电镜观察瘤组织中细胞形态的改变和观察细胞是否出现凋亡小体.　　1.2.6Endostatin对瘤组织中Bcl2及Bax蛋白和mRNA表达的

6、影响常规免疫组织化学法检测瘤组织中Bcl2及Bax蛋白的表达情况.将切下的瘤组织置于液氮中，采用常规RTPCR方法观察Endostatin对Bcl2及BaxmRNA表达的影响.引物由上海生物工程有限公司合成，序列引自文献〔1〕.　　统计学处理：数据均以x±s表示，采用Studentst检验.　　2结果　　2.1Endostatin对SKOV3细胞生长的抑制作用不同浓度的Endostatin处理SKOV3细胞48h后，与对照组相比，SKOV3的生长均受到不同程度的抑制.比较A490值结果显示，细胞PBS对照组、0.

7、1，1.0和5.0mg/LEndostatin组之间差异无统计学意义（P>0.05），而10.0和15.0mg/LEndostatin组的A490值分别与前4组比较，其差异有统计学意义（P0.01）.　　2.2Endostatin对SKOV3细胞凋亡的影响在透射电镜下观察，Endostatin处理SKOV3后，可见细胞皱缩，胞核固缩，细胞质内可见线粒体嵴絮状变，出现凋亡细胞，随Endostatin作用时间延长和剂量的增加，上述变化越来越明显(图1).　　2.3Endostatin对SKOV3细胞凋亡调控相关

8、蛋白表达的影响SKOV3细胞中Bcl2和Bax蛋白表达均定位于胞质和胞核.与对照组相比，Endostatin处理后的SKOV3细胞中，Bcl2和Bax蛋白表达未见明显增强和减弱，并且在Endostatin作用时间和剂量上亦无明显相关性.　　2.4Endostatin对裸鼠皮下移植SKOV3肿瘤生长的影响Endostatin治疗组肿瘤生长缓慢，治疗15d后，肿瘤体积明显小于