利用TALEN技术在牛胎儿成纤维细胞中敲除Myostatin基因-论文.pdf

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1、遵付Hereditas(Beijing)2014年7月，36(7)：685-690www．chinagene．crl研究报告利用TALEN技术在牛胎儿成纤维细胞中敲除杨翠翠，佟慧丽，马兴红，杜巍，刘丹，杨宇，严云勤东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030摘要：肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)基因能够负向调节骨骼肌的生长和发育，牛MSTN基因突变会出现“双肌”特征。文章利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向敲除牛胎儿成纤维细胞的MSTN基因，获得敲除MSTN基因的细胞系，为制备M

2、STN基因敲除牛提供材料。构建一对MSTN基因的TALENs真核表达载体，分别采用PEI转染试剂和电穿孔法进行牛胎儿成纤维细胞的转染，测序结果表明TALEN技术可用于敲除牛MSTN基因，利用T7核酸内切酶I(T7EI)检测其突变效率，结果显示电穿孔转染的敲除效率为20．4％。通过有限稀释法，共获得10个MSTN基因敲除的细胞克隆(包括MSTAr和MSTN+)，其靶位点敲除的碱基数分别是120不等，部分会出现移码突变。出现移码突变的细胞系可用于MSTN基因敲除的转基因肉牛的制备关键词：TALENs；牛；Myo

3、statin；敲除；转染MyostatinknockoutinbovinefetalfibroblastsbyusingTALENCuicuiYang，HuiliTong，XinghongMa，WeiDu，DanLiu，YuYang，YunqinYanCollegeofLifeScience，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，ChinaAbstract：Myostatin(MSrN)cannegativelyregulatethegrowthandde

4、velopmentofskeletalmuscle，andmutationsofbovineMSTNgeneCancausea“double-muscle”featureToknockoutMsgeneinbovinefetalfibroblastbytranscrip—tionactivator-likeeffectornucleases(TALENs)andobtainMSTNknockoutcelllines，weconstructedonepairofMSTN．TALENvectorandtrans

5、fectedintobovinefetalfibroblastcellsbyPEIandelectroporation．SequencingresultsdemonstratedthatTALENwasavailableforMSTNknockout．T7endonuclease1(T7E1)wasusedforthedetectionofmu-tationefficiency．Theresultsindicatedthatknockouteficiencyofelectropomtiontransfe：o

6、rionwas20．4％，and10MSTN+／‘andMSTAr／‘cel1colonieswereobtainedvialimitingdilutionmethod．Thedeletionnumberofnucleotidesrangedfrom1to20，andsomeofthemwereframeshiftmutation，whichcouldprovidethepossibilityinproductionofMSTNknockoutcattleinthefuture．Keywords：TALEN

7、s；bovine；Myostatin；knockout；transfection收稿El期：2013-12—16；修回日期：2014—03—29基金项目：国家转基因专项(编号：2011ZX08007．002)资助作者简介：杨翠翠，硕士，专业方向：分子克隆与基因敲除。E．mail：806344748@qq．com通讯作者：严云勤，教授，博士生导师，研究方向：转基因动物。E-mail：yanyunqin@sohu．tomDOI：10，3724／SEJ．1005，2014，0685网络出版时间：20146．416

8、：11：41URL：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／11．1913．R．20140604．1611．001．html686遗Hereditas(Beijing)2014第36卷肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)属于TGF—B1材料和方法超家族，通过控制成肌细胞的大小、数量和增殖速1．1材料度来实现对肌肉生长的负调控】。MSTN在肌肉组织中特异性表达，其活性的丧失或降低均