家蚕杆状病毒表达的hgm-csf的纯化及糖基化分析

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1、南开大学硕士学位论文家蚕杆状病毒表达的hGM--CSF的纯化及糖基化分析姓名：田静秒申请学位级别：硕士专业：药物化学指导教师：张耀洲2012-05摘要hGM．CSF是一种重要的造血调控因子，能诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体细胞呈集落性生长，在促进粒细胞恢复方面疗效显著，具有重要的临床应用价值。由于糖基化程度和派生细胞类型的不同，重组细胞能产生多种形式、大小不同的hGM．CSF，其分子量变化从16．50kDa。糖基化可影响hGM．CSF的药代动力学性质，抗原性和毒性，对于延长血清半衰期有很重要的作用，糖基

2、化程度高的动物细胞源的rhGM—CSF在体内稳定性方面优于酵母和大肠杆菌源的，因此纯化家蚕杆状病毒表达的hGM．CSF以及分析其糖基化有一定的研究意义。本研究首先对接种hGM—CSF的蚕蛹粉进行了Westernblot鉴定，在PVDF膜上能杂交到特异性条带，通过夹心法ELISA检测到蚕蛹粉中hGM．CSF蛋白的含量为2％o左右。而后开展了小规模纯化预实验，蚕蛹粉中含有大量的杂质及油脂，因此采用高速离心、硫酸铵分级沉淀和超滤对蚕蛹粉进行粗纯化，通过ResourceQ阴离子交换色谱能使目的蛋白得到富集，进

3、行免疫共沉淀进一步纯化目的蛋白，得到了微量较纯的hGM．CSF。家蚕杆状病毒表达的hGM．CSF不带His、GST等标签，只能采用离子交换色谱、亲和层析、分子排阻色谱等方法来达到纯化的目的，而采用亲和层析方法进行大规模纯化需要大量的抗体，因此在进行小规模纯化实验的同时，免疫新西兰雄兔制各了hGM．CSF多克隆抗体，获得了大量多克隆抗血清，并将抗体用亲和层析柱纯化，为接下来的大规模纯化实验奠定了基础。大规模实验通过高速离心、硫酸铵分级沉淀和超滤对蚕蛹粉进行粗纯化，采用DEAE阴离子交换色谱和抗体亲和层析

4、柱进一步纯化，获得了一定量(2mg)较纯的hGM．CSF，而通过这些方法的纯化，hGM—CSF的含量也由最初的2．30％。上升到了204．50％0。利用N型糖苷酶PNGaseF和EndoH对较纯的hGM．CSF进行了酶切去糖基化分析，去糖基化后的hGM—CSF在SDS．PAGE和Westernblot上显示比去糖基化前小1．2kDa，说明hGM．CSF蛋白有N型糖苷链修饰，而去糖基化后比预期的分子量还要大，可能存在潜在的0．糖基化。挖点对去糖基化前后的蛋白进行质谱检测，质谱鉴定结果为hGM．CSF蛋白

5、，SequenceCoverage达到43％。关键词：hGM．CSF，纯化，糖基化AbstracthGM—CSFisakindofimportantinducegranulocyteandmacrophagefactorofhematopoiesisregulation，whichcanprecursorcellsincolonygrowthandhasapparentcurativeeffectonthepromotionofgranulocyterecovery,thusithas1mportan

6、tvalueinclinicalapplication．RecombinantcellswerefoundtoDroducehGM-CSFinmultipleformsofvaryingsize，from16to50kDa，dependingupontheextentofglycosylationandthetypeofcellfromwhichitisderived．GIVcosylationmaYaffectthepharmakokinetics，antigenecityandtoxicityof

7、hGM．CSF,anditplaysan1mportantroleinextendinghalf-lifeoftheserum．TheinvivostabilitVofheavilvglycosylatedanimalcell-derivedrhGM—CSFissuperiortothatoftheyeastandEscherichiacoli-derivedforms．SoitmakessensetopurifyhGM—CSFexpressedbvsilkwormbaculovirusandtoan

8、alyzeitsglycosylation．Inthisstudy,firstlysilkwormpupapowderinoculatedwithhGM．CSFvimswasidentifiedbyWesternblotthatspecificbandswasdetectedonthePVDFmembralle．ThelevelofhGM-CSFproteininsilkwormpupapowderwasabout2％。detectedbvsandwic