产烷烃基因工程菌的构建

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1、北京化工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：颟{yJ日期：塑坚!：生关于论文使用授权的说明学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究牛在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全

2、部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。口非暂不公开(或保密)论文注释：本学位论文不属于暂不公开(或保密)范围，适用本授权书。作者签名：、莠匆}≯—————dL————————————————～导师签名：№日期：世’掣日期：Ⅻmf．珂。’。。。‘’。。。。。。。。。。。。。。。。。。’。。。’。。。。—。。。。。。。‘‘。。。。。。。。。。。。。。。。。。‘●。。。‘。。。。。。。。。。。。。。。。。一学位论文数据集中图分类号Q782学科分类号180．7110论文编号1001020151094密级公开学位授予单位代码100lO学位授予单位名称北京化工大学作者

3、姓名颜红学号2012201094获学位专业名称食品科学与工程获学位专业代码083200课题来源国家自然科学基金研究方向微生物基因工程论文题目产烷烃基因工程菌的构建关键词烷烃生物合成，酯酰辅酶A，脂肪醛，中链烷烃，代谢工程论文答辩日期2015-05—24爿c论文类型基础研究学位论文评阅及答辩委员会情况姓名职称工作单位学科专长指导教师刘珞副教授北京化工大学生物化工评阅人1盲审l评阅人2盲审2评阅人3盲审3评阅人4评阅人5答辩委员会主席田平芳教授北京化工大学代谢工程答辩委员1吕杰副教授北京化工大学极端环境微生物学答辩委员2李灏副教授北京化工大学系统生物学答辩委员3王文雅副教授北京化工大学生物技

4、术答辩委员4王峥副研究员北京化工大学生物化工答辩委员5注：一，论文类型：1．基础研究2．应用研究3．开发研究4．其它二．中图分类号在《中国图书资料分类法》查询。三．学科分类号在中华人民共和国国家标准(GB／T13745-?)《学科分类与代码》中查询。四．论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。摘要产烷烃基因工程菌的构建随着全世界范围内原油消耗量的激增，通过节能减排来实现可持续发展已经成为我们所必须关注的问题，因而关于如何用可再生生物质来替代化石能源，逐渐成为新生的热点课题。烷烃，是化石能源的主要组分，但迄今为止，学术界对于利用微生物这一“细胞工厂”来生产烷烃的研究仍涉及甚少。本课题利

5、用基因工程及合成生物学领域的研究方法，通过调控烷烃生物合成过程中关键酶的表达，使微生物细胞只需通过简单的代谢就可以产生烷烃，为传统石化燃料造成的排放问题、新型生物燃料不能完全替代石化燃料等问题提供了一个绝佳的解决方案。产物中十一烷的生成是本课题的一项重大突破。本课题的研究工作主要围绕以下几个方面展开：(1)烷烃生物合成途径的构建及验证；分别扩增来源于不动杆菌两种不同菌株的酰基辅酶A还原酶基因acrl／acrM，和来源于念珠藻的醛脱羰基酶基因dc，并构建成两套表达体系pETDuet．acrl—dc以及pETDuet—acrM—dc。在发酵过程中外源流加C14：0／C16：0的脂肪酸，并检测

6、最终发酵液中是否含有目标产物烷烃，以验证所构建途径的可行性。最终结果显示含有acrM和dc的代谢途径可以成功将脂肪酸转化成相应链长的烷烃，故在后续实验中对这条途径加以利用。北京化工久学硕士论文(2)以基因工程手段调控产物烷烃链长；在上述研究的基础上引入来源于月桂树的特异性硫酯酶基因UC，该基因可以使大肠杆菌体内积累以C12：0／C14：0为主的中链游离脂肪酸，并充当产烷烃代谢过程中的底物。实验结果显示，利用表达盒pETDuet．tiC—acrM．dc，成功将大肠杆菌内源积累的中链脂肪酸还原，在每克细胞干重中得到总量为6．43±0．25mg的目标产物中链烷烃，其中，十一烷的产量为2．03±

7、O．07mg·g-1，十三烷的产量为1．51±0．18mg·g一，十五烷的产量为2．89±0．37mg·g～。(3)中链烷烃的产最优化；扩增大肠杆菌内源的fadD基因，该基因控制表达的酰基辅酶A合成酶可以使细胞内积累的游离脂肪酸更多的转化为酰基辅酶A，从而为后续烷烃生物合成途径提供过量底物。实验结果显示，经f．aD调节后目标产物中链烷烃的总产量由6．43±0．25mg·g‘1提高到了8．05±0。37mg·g一，其中十一烷的产量提高