鲤trap分子标记筛选及其遗传多样性分析

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1、南京农业大学硕士学位论文鲤TRAP分子标记筛选及其遗传多样性分析姓名：曲疆奇申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：董在杰201012摘要鲤TRAP分子标记筛选及其遗传多样性分析由美国农业部北方作物科学实验室Hu与Vick于2003年提出的目标区域扩增多态，t生(targetregionamplifiedpolymorphism，TRAP)也叫靶位区域扩增多样性，是一个基于PCR的标记技术。它易于建立，同时又具有重复性好、效率高等特点。相比其他分子标记技术，TRAP标记技术具有许多优势。首先它像RAPD技术一样容易建立，同时又能产生出与AFLP技术

2、相媲关的图谱。其次，TRAP标记技术能够利用生物信息工具和EST数据库信息，产生目标候选基因区多态性标记。这一技术已成功应用于许多农作物的遗传图谱构建、重要性状分子标记筛选、种质资源多样性研究扣标记辅助选择育种中。目前，在鲤遗传结构的研究中主要应用的标记有SSR标记和RAPD标记等，尚未见到应用TRAP标记技术分析鲤遗传结构的相关报道。因此，本研究将这一新型分子标记运用到鲤遗传育种研究中。针对鲤这一主要水产养殖品种设计了TRAP分子标记的反应体系。初步确定适合鲤TRAP反应体系：在15山PCR反应体系中，M92+浓度为1．5mmol／L、dNTPs浓度

3、为0．35mmol／L、随机引物浓度均为6pmol／L、固定引物浓度为10pmol／L、含DNA模板60ng、勋口DNA聚合酶1．0U。扩增反应包括：94℃4min，1个循环：94℃45s，35℃45S，72℃lmin，5个循环；94℃45S，53℃45s，72℃1min，35个循环：72℃10min，1个循环，4"C保存。运用这一优化反应体系，选取lO个多态性较好的引物组合对建鲤、黄河鲤、黑龙江野鲤、兴国红鲤和荷包红鲤等5个鲤群体进行遗传多样性进行分析。结果表明，共扩增出168个位点，其中多态性位点134个，平均多态性比率80．41％，平均多态性信息

4、含量0．29。分子变异方差分析(AMOVA)表明鲤群体遗传遗传多样性主要存在于群体内个体间(96．97％)，只有3．03％遗传变异存在于群体间。基于目标候选基因TRAP标记的聚类结果能够在一定程度上反映了鲤群体间的亲缘关系。应用TRAP分子标记对建鲤、黄河鲤和鲤改良品系进行遗传多样性分析，筛选出28个多态性较好的引物组合，共扩增出409个位点，其中多态性位点312个，平均多态性比率75．51％，平均多态性信息含量O．27。建鲤，黄河鲤和建鲤改良品系平均期望杂合度分别为0．2236，0．2261和0．2533；遗传多样性指数分别为0．2103、0．207

5、6和0．2423；群体内多态位点比例分别为65．09％、61．37％和65．22％；遗传相似度和遗传距离结果表明，鲤改良品系继承了更多建鲤的遗传物质。同时研究发现引物组合为Me7+Eml，在200bp左右，鲤改良系有一条明显鲤TRAP分子标记筛选及其遗传多样性分析的特异带，而原始亲本建鲤和黄河鲤中则没有；引物组合为Mel8+Em2，在220bp左右，黄河鲤有一条明显的特异带，而建鲤和鲤改良品系均没有．另外，针对可能与鲤生长性状相关的目标候选基因设计TRAP固定引物，利用25个TRAP分子标记对建鲤选育群体进行遗传多样性分析，同时将初步筛选出的3个与生长

6、性状相关TRAP分子标记位点对群体进行位点性状间的关联分析．结果表明，25个TRAP分子标记共扩增出353个位点，其中多态性位点230个，平均多态性比率65％，平均多态性信含量为O．28，Nei遗传多样性指数平均值为0．2193，Shannon信息指数平均值为0．3289，表明该群体遗传多样性处于中等水平。在初步筛选出的3个TRAP位点(ghlTrap04．140、4rTrap04-308、igf4Ga5—135)中，只有4rTrap04--308与体重、体长呈极显著相关(P<0．01)．本研究首次利用TRAP这一新型分子标记，初步寻找出一个可能与鲤生

7、长性状相关的功能基因位点，为鲤重要生长性状的QTL(数量性状基因座)定位和分子标记辅助育种提供了一定的依据。关键词：鲤；TRAP；反应体系；遗传多样性；生长性状；关联分析lVABSTRACTSCREENING0FTRAPMARKERSANDANALYSISOFGENETICDIVERSITYINCOMMONCARP(Cyprinuscarpio)ThenewlydevelopedTRAP(TargetRegionAmplifiedPolymorphism)wasareliable，stableandrapidPCR-basedtechnique．The

8、reareseveraladvantagesofTRAPoverotherDNAmarkert