色氨酸酶基因工程菌的构建与表达

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1、浙江大学硕士学位论文色氨酸酶基因工程菌的构建与表达姓名：林陈水申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：张建国2002.6.1—＼塑垩查堂堡主兰垡堡壅一——摘要文1j{11。70-P≥j用PCR方法从大肠杆菌K．12中得到色氨酸酶操纵子DNA片段，该片段除带有完整的色氨酸酶基因外，还带有负责表达的启动子和调节基因，将这个DNA片段克隆到T载体上，经过测序发现其核苷酸序列与文献报道的完全一致。将含有色氨酸酶操纵子DNA的T载体的菌株在含有色氨酸的M9培养基中37℃培养能表达大量的目标蛋白，与空宿主相比其酶活只有略微的提高。七为了证明质粒上的基因能表达出有活性的色氨酸酶，将这个DNA片段

2、克隆到PET28c质粒的BamHI和HindIII位点上，使该片段受T7RNA聚合酶的启动子控制，然后转化噬菌体DE3的溶源菌BL21(DE3)。用IPTG诱导表达T7RNA聚合酶，以表达质粒上的目的基因。在葡萄糖存在的条件下，用常规方法发酵和诱导(37。C／lmMIPTG)，发现表达的蛋白质条带的分子量与理论上计算的分子量，一致。l但是发酵液中检测不到吲哚，表明虽然表达了目标蛋白，但表达的蛋白质没有酶活性。在葡萄糖存在的条件下由于分解代谢产物阻遏，基因组上的色氨酸酶基因不表达，加入IPTG只表达质粒上的基因，如果在合适条件下测得色氨酸酶活性，则可以证明质粒上的基因能表达出有活性的色氨

3、酸酶。检测发酵液中有无吲哚的形成，是定性检测酶活的最简单的办法。摸索发酵条件，如改变培养温度和IPTG浓度等，发现在30℃培养条件下，0．2mMIPTG诱导时，发酵液中的吲哚含量最高，表明低浓度的诱导剂或低温诱导有利于表达出有活性的色氨酸酶。在该条件培养得到的菌体能将吲哚、丙酮酸和氯化铵在pH9的条件下转变为色氨酸。总之，根据测序、表达的分子量和酶活性可以证明克隆到的DNA片段确实含有色氨酸酶基因。上述构建的质粒，含有两个启动子。可以分别用IPTG和色氨酸诱导表达色氨酸酶基因，本论文分别对两种诱导方法进行了发酵条件优化。用IPTG诱导表达实验结果表明：利用T7启动子在胞内能表达出有活性

4、的酶：IPTG与温度的合适组合可以得到较高活性的色氨酸酶，在0．2ram以下浓度的IPTG诱导时，37。C是最适温度，而用较高浓度的IPTG诱导，低温是表达有活性的色氨酸酶的必要条件，而且诱导时间要短。0．2raMIPTG对菌体的生长有抑制作用，在细胞对数生长期前期诱导抑制最强烈，0．1mMIPTG基本不抑制生长；临界浓度0．15raM的IPTG和浙江大学硕士学位论文37。C是比较好的组合。钙离子能提高酶活10％以上。在葡萄糖存在的条件下，用IPTG诱导的酶活是不用IPTG诱导的91倍。用色氨酸诱导时添加易利用的碳源，菌体密度显著提高，总酶活反而降低；诱导剂色氨酸是最佳碳源，酵母膏和硝

5、酸铵分别是最适有机和无机氮源。镁离子能显著提高酶活，0．01％的泡敌不影响酶活。另外，还考察了利用不同宿主表达色氨酸酶的情况，发现BL21(DE3)是最佳宿主。也比较了T载体和pET28C两种载体对生产色氨酸酶的影响。工程菌BL21(DE2I)／pET28c-TnaA的活性是到的菌体比活较用IPTG诱导的高。BL21(DE3)的2．1倍。用色氨酸诱导得然后在10LB．Braun发酵罐上观察了工程菌的发酵过程曲线，底物消耗以及酶活曲线。并利用所得的菌体做色氨酸合成实验，分别以吲哚和L一半胱氨酸、吲哚和丙酮酸以及铵盐作为底物分别合成色氨酸，产物浓度分别达到2g／L、4．2g／L。关键词：色

6、氨酸酶，基因克隆，色

7、瑟，大肠杆菌K．12、L．色氨酸，酶法生产，代谢产物抑制，L．半胱氨酸，吲哚，丙酮酸。塑婆查兰堡主堂垡笙奎ABSTRACTUsingPCRtechnology，a2．4kbDNAfragment，partoftryptopanaseoperon，containingapromoter，aregulatorgeneTnaClocateddownstreamofthepromoterandadesiredtryptopanasegeneTnaAwhichCaNbeexpressedbythepromoterfromE．colik-12，wasclonedtopMDl8

8、一Tvector．TheDNAsequenceisthesameaswhichwaspublishedonSCIENCE．ToprovethattheclonedDNAfragmentcanexpresstryptopanase，anewplasmidpET28C-TnaA，inwhichtheclonedDNAfragmentwaslocateddownstreamofT7promoteronpET28cwasconstructedandtr