矿质营养mo对烟草抗青枯病的影响及生理生化机理

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MasterDissertationEffectofMineralMolybdenumonTobaccoBacterialWiltCausedbyRalstoniasolanacearumCandidate：ZhengShi-yanSu[Prof．DingWeiSupervisor：lngMajor：PesticideScienceField：NaturalProductpesticideSouthwestUniversity,Chongqing，P．R．ChinaJune，2014 独创性声明学位论文题目：壁厦萱差丛Q过烟堇抗壹植痘的夏喧丛生理生丝扭堡本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了标注。对本研究及学位论文撰写曾做过贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：奸世．砥签字日期：w，厶年J6r月留日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止)。学位论文作者签名：奸也蒹、导师签名：签字日期：Ⅻ，缸年6月唔日签字日期：Vf叨年6月洁日～型团 目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IⅡ第一章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l作物青枯病的发生特点分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1作物青枯病的发生与危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～11．2青枯雷尔氏菌的致病机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．3作物青枯病的防治现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22矿质营养与植物抗病性的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．32．1植物的抗病机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．32．2矿质营养对植物抗病性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。33矿质营养与作物青枯病的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43．1si营养对茄科作物抗青枯病的影响及作用机理研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．53．2Ca营养对茄科作物抗青枯病的影响及作用机理研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63．3其它⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64选题依据及研究意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．74．1选题依据⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．74．2研究意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。7第二章烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．1土壤样品采集与处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．2测定内容与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．3数据处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况的差异性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．2烟草青枯病发病烟株根际土壤部分中微量元素之间的比值⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．3烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况的因子分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l2．4烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况的判别分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯133结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯143．1结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．143．2讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17第l节Ca、B、Mg、Mo4种元素对烟草青枯病的室内控病效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯171靛料与寅法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯、12结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯193结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23 3．1结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24第2节钼素不同用量对烟草青枯病的室内控病效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一252结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．263结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．28第3节不同方式补充钼素对烟草青枯病的室内控病效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯301材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．302结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．303结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．33第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．35第l节钼素影响烟草抗青枯病的生理生化机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一352结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．403结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44第2节Ca、B、Mg、Mo4种元素影响烟草抗青枯病的生理生化机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯46l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯462结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．463结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5l第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．53第1节Ca、B、Mg、Mo4种元素对烟草青枯病的田间控病效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯531材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．532结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．553结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．60第2节钼素不同用量对烟草青枯病的田间控病效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯621材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．622结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．633结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．69第3节不同方式补充钼素对烟草青枯病的田间控病效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯70l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．702结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7l3结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．77第六章结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯791结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．792讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．80参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯83致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91在学期间获得的研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93 摘要矿质营养Mo对烟草抗青枯病的影响及生理生化机理农药学专业硕士研究生郑世燕指导教师丁伟教授立足于作物健康栽培的理念，从营养．病理学角度出发，采用室内与田间验证相结合的方式，通过调查、测定青枯病发病与健康烟株根际土壤营养状况，根外增施钼素等不同矿质元素后青枯病的发病情况、烟草农艺性状以及烟株体内防御酶系指标的变化，统计分析比较健康与发病烟株根际土壤营养的差异、不同元素对烟草青枯病的控病效果；探讨营养调控措施防控烟草青枯病的可行性，从控病效果、生理生化调控途径方面明确钼素对烟草抗青枯病的影响，从植物防御相关酶角度探索其生理生化机理，以期为从增强作物自身抗病性层面解决茄科类青枯病防控难的问题提供可靠的理论与实践依据。1．初步明确土壤中有效钼、交换性钙含量偏低可能是导致连作土壤发生青枯病的主要矿质营养因子。以从重庆市烟草青枯病发生十分典型的黔江植烟区采集的177份根际土壤样品为供试材料，测定并采用t检验、因子分析、判别分析等方法分析了土壤pH、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、交换性钙和镁、有效铁、有效锰、有效铜、有效锌、有效硼、有效钼等13项指标。结果表明：土壤pH、有机质、速效钾、交换性钙、有效硼、有效钼含量偏低以及土壤碱解氮、交换性镁、有效锰含量偏高均有可能降低土壤的抑病效果，导致青枯病严重发生；烟草青枯病发病烟株根际土壤的钙镁比(4．04)明显低于健康烟株根际土壤的钙镁比(9．86)；因子分析结果显示，土壤中低水平的有效钼、交换性钙可能是导致青枯病发生流行最主要的因子：通过判别分析可知，烟株根际土壤中速效钾、交换性钙、有效钼、有机质、有效硼5个成分的含量情况可能是判别青枯病发病与否的关键因子，同时也构建了相应的判别函数。2．Mo、Ca处理对青枯雷尔氏菌具有一定的直接抑制作用，对烟草青枯病具有较好的控病效果。采用室内和田间小区试验比较了Ca、B、Mg、M04种中微量元素对烟草青枯病的控病效果。室内试验结果表明，在保证烟株正常生长营养的基础上增施Ca、B、Mg、Mo4种矿质元素对烟草青枯病均有一定的控病效果，(NI-14)6M07024"4H20处理最好，其次为CaN206"4H20处理，两者对烟草青枯病的发生均具有一定的推迟、延缓发病的作用；两处理对青枯病的室内最终控病效果依次为64．79％、57．67％，病程进展曲线下面积(AUDPC)显著低于其余处理；对青枯雷尔氏菌具有一定的直接抑制作用，最高抑菌率分别为35．93％、33．13％。田间试验结果表明，向烟草补充Ca、B、Mg、Mo4种矿质营养，对烟草青枯病均具有一定的控制作用，以Mo、Ca处理最好，两处理对青枯病的田间控病效果分别为45．28---62．17％、42．91～62．57％ 西南大学硕士学位论文(新华试验地)和48．03％～'62．23％、48．36％～61．56％(水市乡烟科所试验地)；此外，补充Mo、Ca矿质营养后烟草株高、最大叶宽、茎围、最大叶面积均显著高于对照处理，对田间烟草的健康生长具有明显的促进作用。3．进一步明确了0．20％(w／v)fNI-h)6M07024·4H20对烟草青枯病具有较好的控病效果。采用室内和田间小区试验比较了0．20％、0．10％、0．05％、0．02％4个Mo营养水平对烟草青枯病的控病效果。室内试验结果表明，在保证烟株正常生长营养的基础上，增施不同浓度的Mo营养对烟草青枯病均有一定的控病效果，0．20％Mo处理最好，对青枯病的室内最终控病效果为57．06％，可显著降低病程进展曲线下面积(AUDPC)404．17(DI)和405．21(DS)，可明显推迟、延缓烟草青枯病的发生。田间试验结果表明，向烟株补充Mo营养有利于增强烟草对青枯病的抵抗能力，以0．20％Mo处理效果最好，对青枯病的田间控病效果为46．97～58．82％(新华试验地)和51．15～63．44％(水市乡烟科所试验地)；此外，0．20％Mo处理烟株株高、最大叶长和宽、茎围、最大叶面积均显著高于对照处理，对田间烟草健康生长的促进作用明显。4．明确了以叶面喷雾方式补充Mo营养对烟草青枯病的控病效果最佳。通过比较喷雾、灌根、窝施3种方式向烟草补充Mo营养对青枯病的影响发现，在室内环境(温室)条件下，以喷雾、灌根、窝施3种方式根外增施Mo素对烟草青枯病均具有一定的控病效果，以叶面喷雾方式补充钼营养对青枯病的控病效果最佳，其可明显推迟青枯病典型萎蔫症状出现的时间、降低烟草青枯病的严重度。当对照青枯病发病率为100％时，3种补充方式控病效果依次为63．69％、59．23％、41．07％，病情指数依次比对照低38．89、36．11、25．00，病程进展曲线下面积(AUDPC)比对照低405．56、316．67、188．89(DI)和359．72、318．06、247．22(DS)；田间控病效果分别为41．82～59．63％、36．31--一58．09％、24．28～52．04％，对田间烟草各农艺指标的表现具有一定的优化作用。5．进一步明确了以叶面喷雾方式增施(NH4)6M07024·4H20营养提高烟草抗青枯病的相关生化机理。根据不同防御酶系指标的特性，采用分光光度计、酶标仪测定室内感病烟草体内相关防御酶的活性发现，在发病初期，与对照相比，0．20％Mo处理可显著提高感病烟株体内可溶性蛋白的含量和POD、CAT、PPO的活性，增强SOD和PAL活性，依次比对照增加1．64、2．62、1．34、1．21、0．76、0．67倍，可降低MDA的含量0．54倍：与Ca处理相比，Mo、Ca处理均可提高感病烟株体内可溶性蛋白的含量，分别比对照提高2．25、1．39倍；可增强感染青枯病烟株体内POD、CAT、SOD、PPO、PAL活性，依次比对照处理增加3．11、1．10、O．82、1．68、0．60倍和1．26、0．73、0．90、1．00、0．32倍；可降低MDA的含量，分别比对照低0．50倍和0．26倍。总之，采用田间与室内试验相结合的方式对钼素与烟草抗青枯病的关系进行研究发现，以叶面喷雾方式根外增施0．20％(NH4)6M07024·4H20可显著提高感病烟株体内可溶性蛋白的含量，明显增强烟草部分防御酶的活性(特别是POD、CAT、PPO)、巩固其防御机制、提高烟株的抗病性，显著降低烟草青枯病的发病率和病情指数，有效延缓青枯病的发生；同时也有利于优化烟草株高、最大叶宽、茎围、最大叶面积等农艺指标。这对从营养病理学角度解决茄科类作物青枯病防控难的问题具有重要意义。关键词：钼；矿质营养；烟草；青枯病；防御酶系 AbstractEffectofMineralMolybdenumonTobaccoBacterialWiltCausedbyRalstoniasolanacearumMasterCandidate：ZhengShi-yanAdvisor：Prof．DingWeiABSTRACTBasedontheconceptofhealthycropcultivation，thisstudy,bythewayofgreenhouseexperimentcombined、析mfieldtest．investigatedanddeterminedthenutritionstatusofrhizospheresoilaroundhealthandinfectedtobacco，theoccurrenceoftobaccobacterialwilt，tobaccoagronomictraits，andthedynamicsofdefenseenzymeactivitiesintobaccoissueafterdifferentmineralelementstreating．Then，weanalyzedthenutritiondiscrepanciesofrhizospheresoilaroundthehealthandinfectedtobacco，andthecontrolefficaciesofdifferentelementsontobaccobacterialwilt．Besides，wealsodiscussedthefeasibilityoncontrolbacterialwilt、Ⅳitllregulationnutritionmeasure，andtheeffectofmolybdenumonbacterialwiltfromcontrolefficacyandactivemechanismaspect．Thus，thisstudymayofferreliableacademicandpracticalevidenceforsolvingtheproblemofmanagementbacterialwiltfromenhancingplantnaturalresistanceperspective．1．TheresultshowedthatthelOWlevelsofactivemolybdenum(Mo)andconvertiblecalcium(Ca)mightbethemainnutrientfactorscausingbacterialwilttodevelopatcontinuouscroppingsoil．Inordertoexploretherelationshipbetweenthenutritionalstatusoftobaccorhizospheresoilandbacterialwilt，andfindoutthecrucialsoilnutritionhctorSwhicharecloselyrelatedtobacterialwilt，weregarded177soilsamplesasexperimentalmaterials，whichcamefromQianjianginChongqing．Bythemethodoft-test，factoranalysisanddiscriminantanalysis，wegotthefollowingresults．Tobegin诵m，whentherewerelowlevelsofsoilpH，organicmatter,rapidlyavailablepotassium，convertiblecalcium，availableboronandmolybdenum，andhi．ghconcentrationofconvertiblemagnesiumandavailablemanganese，tobaccobacterialwiltwouldspreadrapidly,andresultinseriouslossestotobacco．Secondly,theCa／Mgvalue(4．04)ofrhizospheresoilaroundbacterialwiltdiseasetobaccoWassignificantlylowerthantheheath’S(9．86)．Additionally,bythefactoranalysis，weconcludedthatlowlevelofavailablemolybdenumandexchangeablecalcium，intobacco·growingsoil．weretheoverridingfactorsofbacterialwilt’Soccurrenceandepidemic．Besides，byusingdiscriminantanalysis，wefoundthatthey,rapidlyavailablepotassium，convertiblecalcium，activemolybdenum，organicmatterandavailableboronintobaccorhizospheresoil，might 西南大学硕士学位论文bethekeyfactorsforwhetherthetobacco-croppingsoilwashealthornot．Furthermore，wealsoconstructedtwodiscriminantfunctions．2．ThisstudyprovedthatMoandCanutritionperformeddirectinhibitiontoRalstoniasolanacearumandcouldcontroltobaccobacterialwilteffectively．Bythemeansofgreenhouseandfieldexperiments，wecomparedthecontrolefficaciesofCa，B，MgandMonutritionontobaccobacterialwilt．111egreenhouseexperimentresultshowedthat．beingonthebasisofguaranteeingthebasicnutrition，addingapplicationofCa，B，MgandMoallperformedinhibitionagainsttobaccobacterialwilt．However,thecontrolefficacyof(NH4)6M07024·4H20treatmentwassignificantlyhigherthanothers，nextCaN206。4H20nutrition．Andtheywere64．79％and57．67％respectively．Besides，theareasunderdiseaseprogresscurve(AUDPC)ofMoandCatreatmentsweremarkedlylowerthanothers．Furthermore，thereweredirectinhibitionsforMoandCaagainstRalstoniasolanacearumthehighestrateofwhichwere35．93％and33．13％respectively．Thefieldexperimentsresultshowedthat，supplyingwithCa，B，MgandMototobaccoplant，whichwerecultivatedintobacco-growingsoilexistingnutritionunbalance，tobaccobacterialwiltwouldbecontrolledeffectively．AndthefieldcontroleffectsofMoandCatreatmentswerehigherthananyothers，whichwere45．28to62．17％，42．91to62．57％(Qianjiangxinhuaresearchsite)and48．03％t662．23％、48．36％to61．56％(QianjiangShuishiresearchsite)individually．吼at’smore，intermsoftobaccoagronomicalcharacteristics，MoandCanutritionshoweddistinctlyaccelerationinthefield，particularlyplantheight，maximumleafwidth，maximumleafareaandstemdiameter．3．Itwasfurtherverifiedinthisarticlethat0．20％(NH4)6M07024‘4H20hadapositiveeffectoncontrolbacterialwilt．Bythemeansofgreenhouseexperimentcombinedwithfieldtest，therewasaplotexperimenttobecarriedoutrepeatedly．111atwas，addingapplicationofMonutrition，whichtheratiosofw／vwere0．20％，O．10％，0．05％and0．02％respectively,fortobaccoplantindividuallywimspraying．Subsequently，therewasacomparisonbetweencontrolefficaciesofdifferenttreatments，throughinvestigating，detectingandanalyzingtheimpactofdifferentelementsonoccurrenceoftobaccobacterialwilt，tobaccoagronomicaltraitanddefensef即zymesintobaccoplant．111egreenhouseexperimentresultshowedthat，beingonthebasisofguaranteeingthebasicnutrition，thedifferentMonutrition，0．20％，0．10％，0．05％and0．02％，allperformedinhibitionagainsttobaccobacterialwilt．However，thecontrolefficacyof0．20％Motreatmentwassignificantlyhigherthanothers．Andthefinalcontroleffectof0．20％Motreatmentswas57．06％inpotexperiment．111efieldexperimentsresultsin201and2012showedthat，supplyingwithdifferentconcentrationMonutritiontotobaccoplant，whichwerecultivatedintobacco-growingsoillackingofMonutrition，wouldimprovedthetobaccoabilityofresistance．Andthefieldcontroleffectof0．20％Moagainsttobaccobacterialwiltwasthehighest，whichwas46．97to58．82％(QianjiangXinhuaresearchsite)and51．15to63．44％(QianjiangShuishiresearchsite)．What’smore，intermsoftobaccoagronomicalcharacteristics．O．20％Monutritionshoweddistinctlyaccelerationinthefield，particularlyplantheight，length，widthandareaofmaximumleafandstemdiameter．4．111eresultsofgreenhouseexperimentandfieldtestshowedthat，therewasthebestcontrolIV Abstractefficacyonbacterialwiltforsupplying(NH4)6M07024。4H20withsprayingwayfortobacco．ThroughcomparedtheeffectofdifferentwaysofsupplementMonutritionwithspray,irrigationandsocketapplicationontobaccobacterialwilt，weconsideredthat，underthegreenhousecondition，thespraytreatmentcouldcontroltobaccobacterialwilt，thecontrolefficacyofwhichwasthebest，andwhichcouldobviouslyputofftheoccurrenceofbacterialwiltandlessendiseaseseverity．Whentheincidenceofcontroltreatmentreached100％．thecontrole伍caciesoftheabove3kindsoftreatmentsontobaccobacterialwiltwere63．69％．59．23％and41．07％inturn．Andcomparedwithcontrol，theindexesreducedby38．89，36．1land25．00，theareaunderdiseaseprogresscurve(AUDPC)lessened405．56，316．67，188．89(DI)and359．72，318．06，247．22(DS)，andthecontrolefficacieswere41．82to59．63％，36．31to58．09％，24．28to52．04％，respectively．5．Inthispaper,itWasclearaboutphysiologicalandbiochemicalmechanismthathowaddingMonutritionenhancedtobaccoplantagainstbacterialwilt．AccordingtOthecharactersofdifferentlydefensiveenzymes．wedeterminedtheiractivitiesatdifferentdiseasestageingreenhouse．111eresultsshowedthat，attheearlystageofdisease，O．20％Monutritioncoulddramaticallyincreasesolubleproteincontentandtheactivitiesofperoxidase(POD)，catalase(CAT)，polyphenoloxidase(PPO)，improvesuperoxidedismutase(SOD)andphenylalnineammonialyase(PAL)，anddecreasemalonaldehyde(MDA)levelininfectedtobacc6plant；compared谢mcontroltreatment，whichraised1．64，2．62，1．34，1．21，0．76and0．67timesinturn，andreduced0．54times．Compared谢thCatreatment，MoorCatreatmentallcoulddramaticallyimprovethecontentofsolubleprotein，significantlyincreasePOD，CAT，SOD，PPOandPALactivities，anddecreaseMDAlevelininfectedtobaccoplant；comparedwithcontroltreatment，whichraised2．25，3．11，1．10，0．82，1．68andO．60times，and1．39，1．26，0．73，0．90，1．00and0．32timesinturn，reduced0．50and0．26timesrespectively．Inconclusion，throughexploringtherelationshipbetweenMonutritionandtobaccobacterialwiltbythewayofgreenhouseexperimentcombined、)lrimfieldtest．wefound0．20％(NH4)6M07024·4H20treatment，、Ⅳinlspraying，couldsignificantlyimprovethecontentofsolubleproteinandtheactivitiesofsomedefenseenzymes(especiallyPOD，CATandPPO)ininfectedtobacco，enhancethedefensemechanismandresistanceoftobacco，andlargelydecreasetheincidenceandindexoftobaccobacterialwilt，delayingthedevelopmentofbacterialwilteffectively．What’Smore，itbenefitedtooptimizeplantheight，maximumleafwidth，maximumleafareaandstemdiameter．Thus，itwillplayanimportantroleincontrolbacterialwiltfromtheperspectiveofnutrition-pathology．Keywords：MolybdenumMineralnutritionTobacco(NicotianatabacumL．)Bacterialwilt(Ralstoniasolanacearum)DefenseenzymesV 西南大学硕士学位论文VI 第一章文献综述弟一早义陬琢迎烟草青枯病是世界范围内一种毁灭性的细菌病害，已成为限制烟叶生产可持续发展的关键因子【l。21。由于受地域、气候条件、栽培条件等因素的限制，我国大部分烟区均存在严重的连作现象，特别是西南烟区。而长期种植单一的作物或品种必将引发一系列的连作障碍问题，如土壤微生态失衡、土壤酸化、部分烟草生长必需矿质营养匮乏等等【3巧】。这些问题的出现，又引起或加重许多烟草病害(尤其是土传性病害)的发生，进而给植烟区烟叶的生产造成严重的威胁睁10】。有研究指出【111，对于一些难以防控的土传病害，营养调控措施是一条值得探索的新途径：且已有研究指出[12-141，调控植物的部分必需矿质营养可有效缓解或控制番茄、天竺葵、生姜等植物青枯病的发生。此外，开展矿质营养与青枯病的关系研究，不仅符合作物健康栽培的理念，而且对如何增强作物自身抵抗病害的能力、怎样科学解决或缓解作物连作障碍等问题的研究均具有重要意义。关于矿质营养与植物抗病性的关系、矿质营养与青枯病的关系等方面是目前植物病理学和植物营养学交叉学科研究的热点，已有许多相应的研究，了解和掌握这些研究动态，对于深入研究烟草青枯病的发生与矿质营养的关系及营养调控技术的应用具有重要的意义。l作物青枯病的发生特点分析1．1作物青枯病的发生与危害青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)因其寄主、致病力、发病条件均日趋多样化，已成为限制作物高产、优质，可持续生产的主要病原菌之一。该病原菌可侵染50多个科450余种植物(其中包括烟草、番茄、辣椒、马铃薯、茄子、花生、甘薯等许多重要的经济作物)，侵染寄主后引起的植物青枯病在全世界范围内均有发生，以茄科植物受害最为严重【15‘18】。据报道n91，目前，作物青枯病已成为世界范围内分布十分广泛、危害相当严重、造成损失巨大的一种毁灭性的细菌性土传病害，是一种典型的维管束病害。另有研究指出【1’16’20】，近年来，青枯病已成为热带、亚热带及部分温暖地区作物的主要病害，且由于受“温室效应”的影响，该病原菌已逐渐向高纬度、高海拔冷凉地区蔓延，给作物(尤其是茄科作物)生产造成了严重的威胁；我国南方木麻黄、桉树、桑树等林木青枯病发生也相当严重，给林业生产也造成了严重的经济损失。1．2青枯雷尔氏菌的致病机理根据青枯雷尔氏菌的生化和遗传特征方面的研究成果，该病原菌目前已成为国际上植物病原细菌致病性研究的一个模式系统，其致病因子、致病路径、致病基因调控系统均具多态性，在侵染寄主过程中该病原菌有与寄主交换遗传物质的现象发生【l5。16】。胞外多糖(EPSI)、细胞壁分解酶(主要是果胶质酶和纤维素酶)、III型Hrp分泌系统的产物、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)以及IV型鞭毛系统(TypeIVpilussyStem)是青枯雷尔氏菌主要的致病因子，其中EPSI最为突出，它在保护细菌、促进细菌移动和定殖以及堵塞和破坏寄主 西南大学硕士学位论文导管等方面都起着重要作用【lo’21。2删。青枯雷尔氏菌可长期存活于土壤中，一般从植物根、茎部的伤口侵入(有时也能直接侵入健康植株)，进入木质部后随即扩散至植物上部[25-27]；青枯雷尔氏菌主要通过脂多糖识别寄主，然后产生大量的胞外多糖阻塞维管束，同时分泌大量的胞外蛋白酶降解植物的细胞壁，进而导致寄主植物萎蔫[15,28-29】；青枯雷尔氏菌成功定殖于木质部后，将在根的表面形成菌脓，返回至土壤(即再侵染)【301。韩菲菲在一篇综述性文章中指出[17】，青枯雷尔氏菌的致病过程主要包括两个阶段：前期该病原菌侵入细胞间隙、木质部导管并定殖，此时细菌密度较低，受PhcA负向调控，激活为青枯雷尔氏菌生长繁殖提供营养的III型分泌系统和促进病原菌运动，同时也激活产生多聚半乳糖醛酸酶(PehA)(降解寄主植物细胞壁)并通过II型分泌系统将其分泌出细胞外；后期该病原菌在寄主植物导管和相邻组织内迅速增殖并广泛分布，此时细菌密度较高，受PhcA正向调控，产生大量的胞外多糖影响或阻碍植物体内水分的运输，从而造成导管穿孔板堵塞、引起寄主植物萎蔫或死亡。同时也指出在后期青枯雷尔氏菌密度较高时IⅡ型分泌系统可能也发挥一定的作用。2002年，Salanoubat等完成了青枯雷尔氏菌GMl000菌株的全基因组测序【311，为进一步从基因水平研究青枯雷尔氏菌的致病机理奠定了扎实的基础；该菌株的基因组含有2个复制子，分别为2．1Mb的巨型质粒和3．7Mb的染色体；由于巨型质粒上携带有hrp基因簇以及编码鞭毛形成和胞外多糖合成的基因，因此其与GMl000的致病性密切相关【20】。大量研究表明【20．32。331，R．solanacearum的致病基因非常复杂，按照功能其至少可分为4大类基因：首先，涉及植物过敏性反应(HR)和确定寄主范围的基因，如arA和hrp基因；其次，编码胞外多糖和调节它们的基因(如opsA、opsB、opsC、opsD、opsE、opsG及regionI和regionII等)：第三，编码胞外蛋白酶的基因(主要是一些降解寄主细胞壁的水解酶类和调控它们的基因，如eglA、pglA、pehA、pehR等)；第四，涉及信号传导的基因(如植物信号分子生长素和乙烯以及降解植物信号分子乙烯和水杨酸等的基因)；此外，还有一些编码抗氧胁迫相关蛋白(这类分子可以消除寄主植物细胞产生的活性氧，从而破坏寄主植物的防御机理)的基因。有研究指出120|，R．solanacearum采用非常复杂的调控网络来选择寄主范围、调控其致病性，其主要由一个核心调控网络和几个与核心调控网络相关的附属调控系统构成。核心调控网络是一个由5类基因(epsR、phc、solR、w，．和XpsR)控制的涉及细胞壁降解、胞外多糖和R．solanacearum自身信号分子反应的综合体系。另有基于转录组的研究结果表吲弹”】，寄主维管束液流中的蔗糖是青枯雷尔氏菌成功侵染的营养底物；同时也进一步明确了维管束组织内菌体达到较高密度时，青枯雷尔氏菌III型分泌系统的表达不受抑制。1．3作物青枯病的防治现状青枯病的防治一直是国内外相关领域研究的热点和重点。青枯雷尔氏菌生理小种的多样性及其与寄主、生存环境之间相互作用关系的复杂性，是实际生产中对该菌进行防治十分困难的主要原因[17,20]。目前主要采用选育高抗品种、改善耕作制度、改良土壤、生物和化学药剂、综合管理等方法对其进行防控，其中生物农药防治近年来受到广泛的关注lI仉强盯J。但由于地域差异和生态条件的限制以及生防菌易受自然环境的影响难以存活、化学药剂残留严重易污染环境等因素，迄今为止对其仍无有效的防控措施。对此，探索出一条绿色、高效、环保、可2 第一章文献综述行的青枯病防控措施迫在眉睫。且已有研究者建议或采取调控植物矿质营养、维持植物营养平衡措施控制青枯病119,38]。2矿质营养与植物抗病性的关系2．1植物的抗病机制植物的抗病性是指植物避免、中止或阻止病原物侵入与扩展，减轻发病和损失程度的一类可遗传特性【39-40]。植物的抗病机制是多因素的，根据寄主植物的抗病机制可分为被动抗病机制、主动抗病机制、诱发抗病机制、避病机制和耐病机制等【4l】。其中植物的被动抗病机制是指植物受到病原物侵染前已经形成的性状所决定的抗病性，这些抗病性状包括形态学、解剖学、生理生化等方面，如覆盖于表皮细胞上的蜡质和角质的数量和质量、表皮细胞壁的结构，气孔和皮孔的形状、大小和位置，体表分泌物，体内抗性物质、酶抑制剂，以及在植物中阻止病原物扩展的厚壁细胞构成的植物组织。植物的主动抗病机制是指病原物侵入植物后激发植物表现出的防卫反应，或者在病原物侵入原有的防御结构后，寄主植物会从组织结构、细胞结构、生理生化方面表现出一系列主动的防御反应；包括诱发的结构抗性和化学抗性两种【411。前者是指寄主组织结构上的抗性反应，有细胞壁的改变、木质化、乳突的形成、木栓化和侵填体的形成等【4l抛】。后者是指寄主细胞内形成的一些抗性化学物质，主要包括植物保卫激素、解毒酶和PR蛋白的合成，以及过敏性坏死反应的产生等【431。植物的诱发抗病性是对植物预先接种微生物或在植物受到某些化学因子、物理因子处理后产生的抗病性，也称为获得抗病性。植物的避病机制是指由于时间、空间分离而减少与病原物的接触(4l】。植物的耐病机制是由生理调节能力和补偿能力而决定的植物忍耐病害的能力[4H。有研究指出H2书】，植物的的抗病性决定于植物本身的基因型和病原物的基因型，与不亲和或亲和因子相关的互作模式是目前广为接受的描述植物与病原物互作关系的遗传模式；植物抗病性包括单基因抗性和多基因抗性两种。2．2矿质营养对植物抗病性的影响Carcia-Mina研究指出[381，植物的营养水平与其防卫机制密切相关；许多矿质营养对不同作物的健康、不同病原物侵染引起的植物本能的防御反应都有着积极的影响。矿质营养不仅对植物的健康生长存在一定的影响，而且还以多种方式直接或间接地对植物的抗、感病性产生影响一】。在病原菌侵入、感染期间，寄主植物质外体中可溶性同化物(如氨基酸、糖类等)的浓度决定病原菌侵入后的繁殖速度，只有极少的病原菌能在寄主细胞内直接利用共质体中的同化物(这些化合物的种类、浓度与寄主的营养状况关系密切)。Spann等研究指出【451，矿质营养增强植物抵抗病害的机制主要表现在促进植物细胞壁加厚、形成对病原菌的机械阻隔，及促进植物本身防御机制的表现(主要是促进植物分泌或合成一些抗氧化剂、黄酮类物质、植保素等)两个方面。当前平衡施肥技术中提到的营养平衡，从植物保护的角度来讲，既要保证作物的最佳生长，又要兼顾使作物获得最大抗性(主要是抗病性)。因此，换而言之，具有最3 西南大学硕士学位论文佳营养状态的植物，其具有最强的抗病力，且植物的抗病能力随其养分浓度偏离最佳水平的程度的增加而降低，如植物缺钙和硼时，细胞膜的透性增加，叶、茎组织质外体中糖、氨基酸的浓度提高，将为病原物的侵染、繁殖提供有利条件【111。有研究指出[11,4¨71，病原物侵染寄主植物，首先是接触寄主植物根、茎、叶等器官的表皮细胞，因此植物表皮细胞的物理、化学特性对其抗／感病性有着非常重要的影响。如，植物根、茎、叶的表皮细胞中含有大量的黄酮类、酚类物质，这对植物抵抗真菌性病原物的侵染有着显著的增强作用；中量元素钙对植物体内多种防御相关酶的活性有影响，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、多酚氧化酶等，间接地影响植物的抗病性；微量元素硼对植物体内酚的代谢有一定的影响，能促进酚类植物抗毒素的形成：铜元素是酚酶的成分，直接参与植物体内酚类物质的代谢、影响植物植保素的合成，对植物抵抗真菌性病原物的侵染、孢子的萌发和生长有一定的影响。此外，植物组织的老化、木质化以及有益元素硅在植物表皮细胞层的淀积，是防止菌丝穿透和细菌性病原物侵入的机械障碍，而矿质营养能以多种不同的方式影响植物组织的木质化和硅元素的淀积【48|。综上所述，矿质营养是植物正常健康生长、发育所必需的，不仅可通过平衡施肥使植物健康生长、抗病力增强，而且大多数元素本身或其代谢产物或通过作为病原菌的营养物质或通过对病原菌产生毒害作用等直接或间接地影响病原菌的侵染和繁殖。因此，针对在病害防控中起积极作用的矿质元素，开展其对植物天然防御反应系统转录(如水杨酸、茉莉酸、乙烯调控基因的表达)以及转录后(蛋白质．酶的合成或活性)机制的影响研究具有重要的意义。研究矿质元素与植物病害相互作用的关系、机理，施肥与栽培措施相结合，将成为植物病害化学防治和生物防控等手段的一个重要补充措施。进一步研究各矿质营养(特别是中、微量营养)与不同病害的关系，怎样影响病原菌的侵染和发育及其机理，以及不同元素间的配合施用效果、与其他栽培措施的结合的效果等，对从营养病理学角度解决病害防控问题具有重要意义。3矿质营养与作物青枯病的关系Spann等研究指出[45】，任何营养的缺乏均会阻碍植物的代谢，导致植株变弱，降低植株的抗病性；如，K、Ca在形成阻碍细菌性病原菌的侵染屏障中扮演着重要的角色：K、Ca、N、B缺乏时，细菌容易侵入植物，病害发生严重；Ca以多种方式影响细菌性病害的发病率。矿质营养以多种不同的方式影响土传病害；任何一种微量营养缺乏，通常会抑制植物对土传病害的防御能力；此外，在许多情况下，矿质营养可直接影响土传病原菌。Huber等研究指出14弘50J，连作土壤营养、微生态、酸碱度等不平衡，可能是导致作物土传病害愈发严重的主要原因；而营养管理可激发植物对病害的主动或被动抗病机制。Datnoff等研究指出【511，无论是在室内还是在田间条件下，矿质营养对各种土传或气传病原菌引起的病害的发生发展均有一定的影响：且涉及在病原菌存在条件下相关元素怎样改善植物的生长发育和降低病害严重度的机制尚不清楚。目前，关于营养与青枯病关系方面的研究很多，但其主要集中在有机肥或有机土壤改良剂方面，单从某种或几种矿质元素与青枯病发生关系的研究相对较少。从矿质元素对青枯病的控病效果方面开展的研究涉及的植物有番茄、天竺葵、生姜，其中以番茄为供试对象的研4 第一章文献综述究最为普遍；研究的矿质元素有Si、Ca、B、P、N等，其中关于Si和Ca与青枯病的关系的●研究相对较多，且主要集中于国外，国内关于这一领域的报道甚少。本文系统阐述了Si和Ca营养对茄科作物抗青枯病影响的相关研究。3．1Si营养对茄科作物抗青枯病的影响及作用机理研究Dannon等第一次报道了在硅非累积植株中硅对细菌性病害的影响【l到。其研究指出，与对照相比，在水培试验中，硅处理可显著降低以病程进展曲线下面积表达的青枯病发病率26．8％(感病品种L390)和56．1％(中抗品种KingKong2)：当硅处理感病品种L390番茄植株，在接种后13d青枯病发病率为100％时，中抗KingKong2处理区在此基础上推迟了6d，并且最终发病率降低了20％；硅处理中抗KingKong2番茄植株，在接种后2d的茎部和接种5d的所有组织中，以及在抗病品种Hawaii7998处理后2d的所有组织中，细菌的数量均显著低于对照区：不同抗病品种间接种后5d中部茎中细菌种群的变化是显著的，细菌种群数量一般显著低于根部：根部硅的累积量比茎部和叶部少，接种青枯雷尔氏菌不会显著影响硅的吸收和分布；在抗病品种Hawaii7998和中抗品种KingKong2中，根部硅的含量和中部茎中细菌的数量呈负相关关系，这暗示一种诱导抗性。Diogo等研究指出【521，si诱导番茄对青枯雷尔氏菌产生抗性与细胞壁果胶多糖结构的改变有关；硅处理生长在泥炭基质上的中抗番茄品种KingKong2和抗性品种Hawaii7998后，可显著降低青枯病的发病率38．1％和100％；与空白对照相比，在接种后5天，硅处理后，在Hawaii7998的茎部和根部，以及在KingKong2的茎部中细菌种群显著减少，这暗示硅的一个诱导抗性；通过运用免疫组织化学法对茎部细胞壁进行分析发现硅调控抗病性的分子机制可能为硅诱导细胞壁果胶多糖结构改变；这些结果暗示硅处理诱导的基本抗性在细胞壁水平，黄色或棕色自体荧光仅发生在Si处理植株上，未处理的植株无荧光。Wang等研究指出【531，硅改良剂可有效控制番茄青枯病，其调控机制与土壤微生物数量的改变和土壤酶的活性有关：与空白对照相比，外源2．0mM硅处理可降低青枯病发病率19．18～52．7％：在硅处理植株中硅的吸收量显著增加，根中硅的含量比茎中高；接种青枯雷尔氏菌会显著增加土壤脲酶的活性、降低土壤蔗糖酶的活性，但是对土壤酸性磷酸酶的活性没有影响；在接种青枯雷尔氏菌的条件下，硅处理可显著增加土壤脲酶和土壤酸性磷酸酶的活性：与非处理区相比，青枯雷尔氏菌侵染后可显著降低土壤中细菌和放线菌的数量52．5％～16．5％，增加土壤真，细菌比例93．6％：在接种青枯雷尔氏菌条件下，硅改良剂处理可显著增加土壤中细菌和放线菌的数量、降低土壤中真／细菌比53．6％。Kiirika等研究指出【5训，硅和壳聚糖联合施用对番茄青枯病具有较好的控病效果，可降低青枯病发病率46．6～74．7％，在抗病品种上效果表现更明显：对接种72h后的TOM2采用微阵列芯片基因表达分析得出，番茄植株KingKon92和L390分别有204和126个基因被调控，大多数被归入防御相关、信号转导、转录等相关种类：在微阵列中，硅和甲壳素联合处理后，涉及植物逆境反应的控制翻译的肿瘤蛋白同系物以及几丁质酶和过氧化物酶等防御基因被大幅度上调；在品种KingKong2番茄植株上，硅和甲壳素处理后，青枯病发病率分别降低40％和56．6％；在L390品种上，硅和甲壳素处理后青枯病发病率分别降低26．6％和33．3％：在硅和甲壳素联合处理的KingKong2和L390番茄品种上，青枯病发病率分别降低74．7％和46．6％。5 西南大学硕士学位论文Ghareeb等研究指出【361，硅主要诱导植物缓解来自于病原菌的生物压力，主要状态将通过乙烯、茉莉酸或活性氧的种类信号途径而被调节；硅的保护角色不仅仅用它的机制特征来解释；应用荧光定量PCR追踪12个防御标记基因的表达情况可知，除了JA／ET标记基因JERF3、TSRFl和ACCO在硅诱导期间表达上调外，氧化应激压力表达基因FD-I和POD以及基本防御标记基因AGP-lg也上调：在接种青枯雷尔氏菌的植株上，硅处理通常诱导防御标记基因的表达，且在72h后达到最高水平；涉及防御反应、信号转导、对压力的响应、转录、代谢的12条基因被上调；A埘刁相似基因暗示优先诱导和限制茉莉酸信号调节上调的最高水平。Kurabachew等研究指出【551，硅处理比对青枯病的控病效果优于根际细菌短小芽孢杆菌处理：通过转录组分析得知，有174个基因被不同程度地调节，其中113个基因被上调、61个基因被下调，调控基因的功能分组暗示大多数上调基因更多涉及信号转导、防御、蛋白质的合成和代谢，然而大部分下调基因更偏向于光合作用、脂质代谢；硅处理植株比根际细菌短小芽孢杆菌处理植株具有更多的防御相关基因被调节；同时施用两个激发子有5个相关基因被下调，但是当它们被单独施用时这些基因被上调；这一结果表明在被乙烯．茉莉酸和水杨酸途径调节的基因之间有拮抗作用发生。因此，为了诱导番茄植株对青枯病具有更好的抗性，建议单独施用每个激发子，且硅处理诱导效果高于根际细菌处理。3．2Ca营养对茄科作物抗青枯病的影响及作用机理研究Yamazaki等研究指出【56-61]，Ca营养对番茄青枯病具有较好的控病效果；增加营养液中Ca浓度可减轻青枯病严重度，在抗病品种番茄苗上，同时还可减轻茎秆上的菌量；接种病原菌后，Ca浓度影响番茄幼苗的抗性，说明在接种病原菌之前，细胞壁内的钙不参与Ca的依赖抗性；高抗品种吸收更多的Ca；番茄对青枯病的抗性显著地被寄主的Ca营养状况影响；Ca与其它含不同钙浓度的堆肥或混合物或基质施用实验结果表明钙浓度越高，青枯病发病越轻。Jiang等研究指出【62]，在一定范围内，高浓度钙处理番茄植株体内过氧化氢的含量、过氧化酶和多酚氧化酶的活性越高，对番茄青枯病的控病效果越好；通过设置了0．5、5．0、20mM3个Ca营养液浓度，以不同抗性的番茄苗为供试对象，采用浸根法接种青枯雷尔氏菌进行试验，结果表明低、中、高钙浓度处理青枯病的严重度分别为100％、77．1％和56．8％；生长在高钙浓度处理中植株的高、茎粗、生物量显著好于生长在低钙浓度中的番茄苗；番茄植株根和茎中钙的浓度随营养液中钙浓度的增加显著增高；高钙浓度处理植株过氧化氢含量增加快，最高达10．86gM-f1FW，比中钙浓度处理植株增加31．32％；过氧化物和多酚氧化酶在高钙处理中有明显的增加；钙浓度、过氧化氢含量、POD和PPO活性与病害严重度呈负相关，说明这些因素在番茄的抗病性中扮演着重要的角色，同时也表明钙调控着番茄植株中过氧化氢的含量以及过氧化物酶和多酚氧化酶的活性。李洪研究不同浓度氯化钙对青枯雷尔氏菌果胶酶活性和胞外多糖的影响指出【63】，氯化钙对青枯雷尔氏菌果胶酶的活性有显著的影响，且其活性与氯化钙的浓度成反比；氯化钙对青枯雷尔氏菌产胞外多糖的总量和单产量作用不明显。3．3其它徐小洪等研究有机活性肥料不同含氮水平对烟草抗青枯病效果的影响指出mJ，在一定含氮水平范围内，青枯病发病程度随含氮水平的升高呈加重的趋势，但超过该范围，青枯病病6 第一章文献综述情指数可能呈降低的趋势，具体变化规律还有待进一步研究。Norman等研究指出【l引，亚磷酸(H3P03)灌根可有效阻止青枯雷尔氏菌1、3生理小种侵染天竺葵，且含钾盐的亚磷酸效果可能更好，而其它含磷化合物(如P205、H3P04)没有此作用。吴卫玲研究硼酸钠对青枯雷尔氏菌的影响指出【651，硼酸钠对青枯雷尔氏菌的抑菌效果与硼酸钠的浓度呈正相关关系，当硼酸钠浓度大于等于0．5mmol／L时，对烟草青枯病菌的生长与生存有显著的影响；硼酸钠对烟草青枯病菌纤维素酶和果胶酶均有抑制作用，但对胞外多糖影响不明显；此外，通过采用质谱分析法对烟草青枯病菌胞内和胞外差异蛋白进行分析发现，硼酸钠对青枯雷尔氏菌的影响可能与其自身的信号转导有关。4选题依据及研究意义4．1选题依据本研究的选题主要基于以下三个方面：首先，关于烟草青枯病防控措施(抗病品种、生物、化学防治等)的相关研究很多，但目前仍无特效的解决方法，且从营养角度开展研究的相对较少。其次，据报道，植烟土壤长期连作、施用化学肥料等，导致土壤有机质含量偏低、部分烟草生长必需矿质元素不足，可能是青枯病发生严重的主要原因；且已有研究指出，补充部分植物必需矿质营养对一些病害具有明显的延缓或控制其危害的作用。第三，开展“矿质营养对茄科作物抗青枯病的影响”研究，紧跟当前病虫害“绿色防控”的主题，符合健康栽培、安全生产的理念，有利于作物生产的可持续发展。4．2研究意义青枯病危害十分严重，每年给以烟草为代表的茄科作物生产造成巨大的损失。根据尺．solanacearum的寄主范围、生化特性，可将其划分为5个生理小种和6个生化小种。正是由于青枯雷尔氏菌的小种多样性及其与寄主、环境之间复杂的互作关系，使得抗青枯病的育种十分困难【201。此外，在青枯病发生严重的区域还常伴随着黑胫病的发生，两者混发使防治更加困难，损失更为严重。迄今为止，虽然已从烤烟抗病品种的选育、农业防治、生物防治、化学防治等方面进行了大量研究，且已取得了较大的进展，但对其仍无特效的防控措施。Hube等研究指fla,t49‘501，病害控制是遗传学控制，不仅仅涉及植物或病原菌营养地位的生理和生物化学过程的调节。植物的营养地位决定了它的组织学或形态学结构和性能，组织具有加速或降低病原物渗入和致病力的功能。病原物的致病力和生存能力也受多种营养的限制。大多数营养影响病害的潜力超过了接种体的潜力。植物营养地位和病原物错综复杂的关系，在环境中的非生物因子和微生物是动态的，通过恰当的营养管理，可降低大多数病害的严重度。研究植物营养与病害互作关系，可为降低病害严重度和改善作物生产系统提供理论依据。加之，寄主植物与病原菌之间互作的病理学是一个经过长期进化形成的非常复杂的系统。从病原菌接触植物到使其发病，是病原物识别寄主，穿透寄主植物组织、生长和繁殖，解除寄主植物防御以及植物抵抗病原菌侵入和繁殖而相互斗争的过程。这一过程包含各种信号的传递和寄主植物在形态、生理、生化、组织、细胞、分子等水平变化的过程。植物可对青枯雷尔氏菌的侵染行为产生抗性反应，抵抗青枯雷尔氏菌的进一步侵染和转移。仅研究寄主植7 西南大学硕士学位论文物病病原物间某一水平或状态下的互作机制是远远不够的，应综合细胞生物学、生物化学、分子生物学等手段进行系统的研究。明确营养元素、烟草、青枯病三者间的关系，将有助于阐明植物与病原菌相互作用的机理，建立植物防御病原菌的作用模型，促进形成更有效和更具有针对性的农作物抗病育种体系。模式研究系统的建立，对防控青枯雷尔氏菌引起的一大类细菌性病害以及黑胫病菌引起的致病疫霉类病害等均具有十分重要的意义，同时也有助于提高烟草的经济效益，促进烟叶生产的可持续发展。此外，关于土壤微生物群落结构、成分的研究司空见惯，但结合青枯病的研究鲜见报道。就营养元素与烟草的关系方面而言，科研工作者开展了大量的研究，但大部分工作均集中在烟草产量、品质或其它病害上，关于元素与青枯病关系的研究甚少，关于钼素与烟草青枯病的关系未见报道。本课题采用普通生物学方法，室内与田间相结合对营养元素、烟草、青枯病三者的关系开展研究，对青枯病模式研究系统的构建将奠定扎实的基础，对烟草青枯病的田间防控具有重要的指导意义，对目前植烟区普遍存在的连作障碍问题的解决或土壤修复技术的集成、开发也具有重要的借鉴意义。 第二章烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况分析良好的土壤生态环境是农业健康、可持续发展的基础【661。土壤营养平衡是保证作物健康生长的前提条件，尤其是在部分连作障碍非常严重的烟区；土壤中任何一种元素的缺乏或过量都可能对烟株的正常生长发育造成不利的影响，降低烟草的抗病、抗逆性，影响烟叶的产质量：保证土壤的营养平衡是促进烟草抗病、抗逆性表达，有效控制土传病害发生、流行，提高烟叶产质量的关键【6嘶引。且已有大量研究表明【3母】，我国西南植烟区土壤目前普遍存在的理化性状恶化、酸碱度不平衡、部分烟草生长必需矿质营养不足、微生态失衡等连作障碍问题，以及青枯雷尔氏菌致病力、发病条件日趋多样化可能是青枯病越发严重的主要原因。因此，保证土壤营养、微生态环境、酸碱度、有益微生物和有害微生物与烟草之间的平衡是控制土传病害发生流行的关键；明确与烟草青枯病发生最关键的土壤因子势在必行。对此，本研究以重庆市黔江植烟区为例，对在不同种植单元采集的177份土壤样品进行主要成分测定与分析，旨在为烟草青枯病的发生机理，为有效防控青枯病提供理论依据。l材料与方法1．1土壤样品采集与处理根据土壤检测农业行业标准NY厂r1121．1．2006《土壤样品的采集、处理和贮存》标准，用木制或塑料制品，于2012年10月(烤烟采收结束后)，以重庆市黔江植烟区具有代表性的种植单元为采样地点，采集健康和青枯病发病烟株根际0～20cm表土层的土壤，在同一采样单元内每5个具有同样发病特征的点的土样构成1个混合样品，采取四分法去掉多余的土壤，使每个样品1kg。各样品采集点均采用GPS定位，风干后，剔除植物残体、虫体、石块等杂物，用木槌研磨后过60目尼龙筛，装袋(自封袋)，4℃冰箱临时保存备用。土壤样品采集时间为烟叶采收结束后，同时避开雨季，保证采样地块的物理性质不受影响。共采集健康土壤样品78份，青枯病发病土壤样品99份。1．2测定内容与方法土壤样品测定指标包括pH值、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、交换性钙和镁、有效铁、有效锰、有效铜、有效锌、有效硼、有效钼等13项。其测定方法分别为：电位法测定pH值；重铬酸钾容量法测定有机质；碱解扩散法测定碱解氮；碳酸氢钠法测定速效磷：火焰分光光度计法测速效钾：原子吸收分光光度法测定有效钙、镁、铁、锰、铜、锌；姜黄素比色法测定有效硼；硫氰酸铵比色法测定有效钼【69】。1．3数据处理所有土壤有效成分相关数据均先采用Excel进行基本处理，然后再采用SPSSl6．0软件进行统计分析。9 西南大学硕士学位论文2结果与分析2．1烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况的差异性分析表2．1健康烟株根际土壤与青枯病发病烟株根际土壤的营养状况Table2-1Nutritionalconditionofrhizospheresoilaroundhealthandbacterialwiltdiseasetobacco注：表中有效含量为平均值±标准差，”表示差异极显著。Note：Thedatawel'eexpressedasthem啪4-standarddevimionfSD)．”representedhighlysignificantdifferenceatPSO．Ollevel．重庆市黔江植烟区健康烟株根际土壤与青枯病发病烟株根际土壤的营养状况如表2．1所示，从表中数据可明显看出，健康土壤与发病土壤相比，pH、有机质、碱解氮、速效钾、交换性钙、交换性镁、有效锰、有效硼、有效钼等9个指标间差异极显著，其中健康土壤pH、有机质、速效钾、交换性钙、有效硼、有效钼等指标均比发病土壤高，碱解氮、有效镁、有效锰等指标均比发病土壤低；健康土壤与发病土壤中速效磷、有效铁、有效铜、有效锌等指标间无显著性差异。说明土壤pH、有机质、速效钾、交换性钙、有效硼、有效钼含量较高以10 第二章烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况分析及土壤碱解氮、有效镁、有效锰含量较低时可能更有利于植烟土壤的健康或抑病作用的发挥：土壤中速效磷、有效铁、有效铜、有效锌等指标的含量一般都比较丰富，可能与青枯病发生与否相关性不明显。2．2烟草青枯病发病烟株根际土壤部分中微量元素之间的比值l000900800700趔A_I6005004003002001000健康土壤发病土壤土壤类型图2-1健康土壤与发病土壤部分中微量元素之间的比值Fig．2-1Theratiosofsomemineralelementsforrhizospheresoilaroundhealthandbacterialwiltdiseasetobacco注：图中大写字母表示样品部分中微量元素之间的比值在P墨0．01时的显著差异。Note：ThecapitalletterrepresentedhighlysignificantdifferenceatPS0．01level．通过方差分析可知，烟草青枯病发病烟株与健康烟株根际土壤部分中微量元素之间的比值存在极显著差异(图2．1)：其中健康烟株根际土壤钙镁比(9．86)明显高于青枯病发病烟株根际土壤钙镁比(4．04)；健康烟株根际土壤铁／硼(133．44)、锰／硼(63．67)、铁／铝(337．11)、锰／钼(160．84)比值均明显低于发病烟株根际土壤相应指标。鲁耀等研究指出【701，植烟土壤的钙镁比是衡量烟叶产质量的一个重要指标，偏高或偏低均不利于优化烤烟的各项指标。说明植烟土壤钙镁比可以作为植烟土壤是否抗青枯病的一个判断指标；在一定范围内，土壤交换性钙镁比例越高可能越有利于巩固植烟土壤对青枯病类土传病害的抑病作用；而关于诸如Fe／B、Mn／B、Fe／MO、Mll／rMo等在发病土壤与健康土壤间也存在极显著差异的指标，其在土壤抑病或烤烟生长方面扮演的角色还有待进一步研究。2．3烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况的因子分析2．3．1健康烟株根际土壤营养状况的因子分析对重庆市黔江植烟区健康土壤中pH、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、交换性钙等13项指标进行因子分析，结果如表2-2和表2．3所示。由表2．2可知，通过因子分析前面的主 西南大学硕士学位论文成分法，得出前7个因子的方差累积贡献率占原变量总方差的92．83％，基本保留了原13个变量的特征、差异和相互关系。因此，可以将健康土壤中13个组分之间复杂的关系转化成7个不相关的综合指标。为了进一步简化结构，进行方差极大正交旋转，即得到表2．3的旋转因子载荷矩阵。从表2．3各因子的载荷可看出，第1主因子主要由有机质决定，第2主因子主要由有效硼、有效锰决定，第3主因子主要由有效镁决定，第4主因子主要由速效磷决定，第5主因子主要由有效钼决定，第6主因子主要由pH决定，第7主因子主要由碱解氮决定，这样就将13个变量化为7个彼此独立的因子。由此，可将变量分为{OM}、{B、Mn}、{Mg)、{P}、{Mo)、{pH)、科)7大类。表2-2主因子的特征根、贡献率和累积贡献率(健康土壤)Table2-2Theeigenvalue、proportionandcumulativeofprincipalfactors(healthsoil)表2．3旋转因子载荷矩阵(健康土壤)Table2-3Rotatedfactorpattern(healthsoil)2．3．2青枯病发病烟株根际土壤营养状况的因子分析对重庆市黔江植烟区青枯病发病烟株根际土壤中pH、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、交换性钙等13项指标进行因子分析，结果如表2-4和表2．5所示。由表2_4可知，通过因子分析前面的主成分法，得出前7个因子的方差累积贡献率占原变量总方差的86．35％，基本保留了原13个变量的特征、差异和相互关系。因此，可以将青枯病发病土壤中13个组分之间复杂的关系转化成7个不相关的综合指标。从表2．5可明显看出，第1主因子主要由有效钼、有效钙决定，第2主因子主要由速效钾决定，第3主因子主要由有效铜、有效锌决定，第4主因子主要由有效硼决定，第5主因子主要由有机质决定，第6主因子主要由有效镁决定，12 第二章烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况分析第7主因子主要由有效锰决定。这样就将13个组分对青枯病发病土壤的贡献分为如下7大类：{Mo、Ca}、{Iq、{Cu、Zn}、{B)、{OM)、{Mg)、{Mn)。将青枯病发病烟株根际土壤的因子分析结果与健康烟株根际土壤的因子分析结果相比较，综合表2．1健康土壤和青枯病发病土壤营养状况的差异，可明显看出植烟区土壤感染青枯病后内部的营养平衡发生了很大的变化。首先，有效钼、有效钙、速效钾、有效铜、有效锌营养从健康土壤中相对次要的因子变成了青枯病发病土壤中排列第1、2、3的主因子；其次，有效硼、有机质、交换性镁、有效锰在发病土壤中所起的作用都有所降低；第三，速效磷、pH、碱解氮在发病土壤中已变为次要因子，不在7类主因子范围内。说明土壤有效钼、交换性钙、速效钾、有效硼、有机质含量偏低以及交换性镁、有效锰含量偏高可能会有利于或加重青枯病的发生，关于有效铜、有效锌的异常变化，还有待进一步研究、验证。表2_4主因子的特征根、贡献率和累积贡献率(发病土壤)Table2-4Theeigenvalue、proportionandcumulativeofprincipalfactors(diseasesoil)表2．5旋转因子载荷矩阵(发病土壤)Table2-5Rotatedfactorpattern(diseasesoil)2．4烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况的判别分析借用作物病虫害预测预报常用的判别分析方法，以土壤成分——pH值、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、有效钙、有效镁、有效铁、有效锰、有效铜、有效锌、有效硼、有效钼一一为判别因子变量(X)，依次设定为X1、X2、x3⋯⋯x13；以土壤健康与否为分类变量(y)，健康土壤用l表示、发病土壤用2表示；采用Fisher’S费雪逐步判别的方法进行逐一判别，从影响分类变量的因素中挑选出对判别贡献较大的变量，从而得到一个可靠的植烟土壤发病与否的 西南大学硕士学位论文判别模型。试验结果如下(表2．6)：F1=19．911X2+3．335X3—8．122x4+80．973X5+70．922X6—13．863X8—4．674X9+14．637X12+42．522X13—482．785F2=14．071X2+4．925X3—6．934x4+66．890X5+62．703X6～10．973X8—2．588X9—10．597Xi2+12．811X13—353．801式中：F1一健康土壤；F2一青枯病发病土壤；各判别因子变量X所代表的土壤成分见表2．6。从表2．7可明显看出，上述F。、F2两个植烟土壤健康与否的判别函数的可信度已达到98％，仅青枯病发病土壤中出现了两个错误判别，说明建立的F1、F2两个判别函数可用于植烟土壤青枯病发病与否的推断或预测预报：将待判别样品相应成分分别代入上述判别函数，最终得分较大者为测报类或判定结果。表2-6Fisher’S费雪判别函数系数表Table2．6Classificationfunctioncoemcients(Constant)表2．7判别回代统计表Table2．7Classificationresults3结论与讨论3．1结论3．1．1健康烟株与青枯病发病烟株根际土壤营养各指标间存在极显著差异14一一一㈣一一一一一～叭琊m％勉嬲讲啪滋至：一一一一～一一～一一伽NPK勖&№B№犯彤轴私‰抽m椰 第二章烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况分析通过对采自重庆市黔江植烟区不同植烟单元的177份土壤测定结果进行t检验结果表明，在pH值、有机质、速效钾、交换性钙、有效硼、有效钼含量偏低以及碱解氮、有效镁、有效锰含量偏高的有青枯雷尔氏菌存在的土壤上种植烟草，青枯病发生可能更迅速、更严重，此类土壤对有害微生物的抑制作用相对较弱；健康土壤与青枯病发病土壤中速效磷、有效铁、有效铜、有效锌含量均比较丰富，与青枯病发生与否相关性不显著。健康烟株根际土壤钙镁比(9．86)明显高于青枯病发病烟株根际土壤钙镁比(4．04)，健康烟株根际土壤铁／硼(133．44)、锰／硼(63．67)、铁／钼(337．11)、锰／钼(160．84)均明显低于发病烟株根际土壤的相应指标。3．1．2土壤中交换性钙、有效钼的含量可能是影响青枯病发生最关键的因子对健康土壤和青枯病发病土壤13项指标进行因子分析结果显示，健康土壤中有机质、有效硼、有效锰、交换性镁、速效磷、有效钼、pH值、碱解氮等成分贡献较大，发病土壤中有效钼、交换性钙、速效钾、有效铜、有效锌、有效硼、有机质、交换性镁、有效锰等指标的贡献率较大；综合健康土壤和发病土壤13项指标差异比较结果可知，只有当土壤有效钼、交换性钙、速效钾、有效硼、有机质含量比较丰富以及交换性镁、有效锰含量相对较低时，土壤的抑病作用才可能得到充分的发挥，才可能减少青枯雷尔氏菌侵染烟草的机会，从而更好地抑制青枯病的发生与流行；关于结果中有效铜、有效锌的异常变化，还有待进一步探究。3．1．3判别分析可用在土传病害与土壤因子的关系分析上对177份健康和青枯病发病土样进行判别模型构建结果表明，植烟区土壤是否有利于青枯病的发生可能主要取决于有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、交换性钙、有效铁、有效锰、有效硼、有效钼9项指标对土壤营养平衡的贡献；植烟区土壤是否有青枯病发生可依次采用Fl=19．911X2+3．335X3—8．122x4+80．973X5+70．922X6—13．863X8—4．674X9+14．637X12+42．522X13—482．785和F2=14．071X2+4．925X3—6．934x4+66．890X5+62．703x6—10．973X8—2．588X9—10．597X12+12．811X13—353．801进行判别，将待测数据代入上述判别函数，最终得分大者即待测样品为其对应的类别。3．2讨论3．2．1植烟区土壤连作障碍问题不容忽视土壤连作是目前我国大部分植烟区普遍存在的问题，尤其是西南烟区。本研究通过对采自连作烟田土壤的13项主要指标进行测定分析，结果表明连作土壤矿质营养严重不平衡，健康土壤与青枯病发病土壤相比，除速效磷、有效铁、有效铜、有效锌4项指标差异不显著外，其余指标差异均极显著。另有大量研究指出[2'7肌751，连作将增强烟草根系分泌物的自毒作用，根系分泌的酚酸类物质将引起根系细胞膜的紊乱，降低土壤中过氧化氢酶、转化酶、脲酶、中性磷酸酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶等酶的活性，影响植物体对矿物质的吸收，从而使土壤营养非均衡性变化：连作将导致土壤H+增多、pH降低，引起酸碱度不平衡，进而导致部分矿质元素富集，对根系产生毒害：连作更有利于病原微生物大量繁殖，将改变土壤微生物区系，破坏微生态环境平衡，进而引起有益微生物和有害微生物与烟草间关系恶化，使病害愈发严重。对此，只有摸清土壤营养状态、微生物区系、微生态环境与烟草间相互作用的关系，合理构建土壤营养、土壤酸碱度、土壤微生态环境、有益微生物和有害微生物与烟草间四大体 西南大学硕士学位论文系的平衡，绿色环保地解决了连作障碍问题，才可能全面推进烟叶的标准化生产，踏上“特色、优质、生态、安全”发展的新路子。3．2．2根际营养平衡是防控土传病害的关键本文首次将土壤中12种植物生长必需矿质营养成分与青枯病的发生相结合进行系统的研究，采用t检验、因子分析、判别分析等方法对待测土壤13项指标进行分析表明，根际土壤中大部分矿质营养与烟草青枯病的发生与否呈极显著相关；适当补充钼、钙、钾、硼等营养有助于巩固烟草抗病性的表达。有研究指出【11,45,76]，矿质营养调控促进植物抗性表达的机理主要是由于矿质元素进入植物体后可能参与植物一些关键的生理生化代谢途径、组织结构的形成(主要是细胞壁的加厚)以及如抗氧化剂、植保素、黄酮类物质等抗性相关物质的合成，从而在植物体内加强植物对病原菌的机械阻碍，增强植物的天然防御机制。此外，通过施肥或追施微量元素或者施用有机改良剂均可直接或间接地改变土壤微生物区系，提高土壤的抑病作用[14,38,77-80】。综上可知，根际营养的调控是控制病害发生流行的关键，在今后的相关研究中明确烟草根际土壤营养与微生物种群、区系变化间的关系也具有重要意义；当然不同元素间存在的协同、拮抗或互不影响作用问题也不容忽视，对其还有待进一步研究。3．3．3判别分析方法应用与土壤因子与病害的关系分析意义重大判别分析是作物病虫害预测预报中一种常用的数据分析方法，是根据观察或测量到的若干变量值，判别研究对象如何分类的方法。本文首次将该方法应用于土壤因子与土传病害的关系分析中，对今后相关方面研究具有重要的借鉴意义。通过判别回代统计表可明显看出，研究中判别因子变量和分类变量之间准确率达98％，说明判别分析模型可应用与土壤因子与病害的关系研究中，对从不同角度预测病害的发生与否、发生严重度，做好病虫害防控工作意义重大。16 第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果近年来，青枯病对烟草及其它作物的危害呈逐渐递增的趋势，对此已被称作烟草上的“癌症’'_一虽然科研工作者们对其防控措施开展了大量的研究，但仍无法对其进行有效控制。因此，从不同的角度对其开展研究意义重大、势在必行。且已有研究指出【l¨，对于一些用化学方法难以防控的土传病害，调控矿质营养措施可能是一条值得探究的新途径。矿质营养不仅对植物的正常生长和发育起着至关重要的作用，而且还以多种方式直接或间接地对病原物的侵染和繁殖以及寄主植物的抗病或感病性产生影响[11’4‘71。不同的矿质元素，在植物体内扮演着不同的角色；如钙在植物体内既起着结构成分的作用，可维待细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白的稳定性，也具酶的辅助功能，调控着植物体内的各种生长发育代谢活动[81-821；镁素能促进烟草叶片光合作用和生理代谢的进行【83制】；硼可影响烟草叶片膜脂过氧化程度及体内保护系统的变化以及对钾吸收【85】；钼对植物的氮代谢和光合作用均有影响，可增强植物对病害的抗病能力[86-89】。对此，本章主要通过室内试验比较Ca、B、Mg、Mo4种元素对烟草青枯病的室内控病效果，以及不同浓度的Mo素和不同方式补充钼素对烟草青枯病室内发病情况的影响，旨在为进一步研究奠定基础。第1节Ca、B、Mg、Mo4种元素对烟草青枯病的室内控病效果茄科类青枯病是目前世界范围内分布十分广泛、危害相当严重、造成损失巨大的毁灭性土传病害之一，其寄主、致病力、发病条件日趋多样化，并已有向高纬度、高海拔冷凉地区逐步蔓延的趋势【l’16．201。针对该病的防控，从抗病育种、改善耕作制度、生物或药剂防治等方面已开展了大量的研究，但至今对其仍无理想的防控措施；该病已成为茄科类作物生产可持续发展的主要瓶颈【l0'搏37】。目前，关于营养与青枯病关系方面的研究很多，但其主要集中在有机肥或有机土壤改良剂方面，单从某种或几种矿质元素与青枯病发生关系的研究相对较少。从矿质元素方面对青枯病防控所开展的研究涉及的植物有番茄、天竺葵、生姜，其中以番茄为供试对象的研究最为普遍：研究的矿质元素有硅、钙、磷、氮等，其中关于硅和钙与青枯病的关系的研究相对较多，且主要集中于国外，国内关于这一领域的报道甚少。加之，通过分析烟株根际营养与青枯病发生的关系已发现根际土壤部分元素的不足或过量与烟草青枯病的发生密切相关(相关结果见第二章)。对此，本节在室内条件下选择性地给烟草补充Ca、B、Mg、Mo4种矿质营养，其目的在于比较4种元素诱导烟草抵抗青枯病的室内控病效果，进一步明确与烟草青枯病发生关系密切的营养元素，为从营养病理学角度解决青枯病防控难的问题提供理论依据。1材料与方法1．1供试材料17 西南大学硕士学位论文1．1．1供试烟草品种供试烟草品种为云烟97(云南省玉溪中烟种子有限责任公司)，低抗烟草青枯病。试验所用烟苗统一采用烟草漂浮育苗专用基质(湖南省湘晖农业技术开发有限公司)，在昼夜温度为26／200C，相对湿度60％，昼夜光照时间为14／10h的温室条件下培育。1．1．2供试病原菌供试青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)由本实验室从采自重庆市黔江区新华乡的烟株病残体上分离、鉴定所得。试验用菌液浓度(大约107efu／mL)通过上海听瑞仪器仪表有限公司WGZ．2．XJ细菌浊度计确定。试验所用培养液参考文献[52】配制，试验过程中，在喷施4种供试元素后，各处理采用相关的盐溶液代替相应的营养，每周浇灌两次。1．1．3供试培养基试验所用NB培养基根据HB／套Ⅳ，r1156．16．2008进行配制。1．1．4供试营养元素硝酸钙(CaN206"4H20)、硼砂(H3803)、硫酸镁(MgS04"7H20)、钼酸铵((NH4)6M07024·4H20)等均为分析纯(AR)，试验过程中采用超纯水将其溶解到相应浓度。I．1．5仪器WGZ．2．XJ细菌浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司。1．2．试验设计1．2．1室内盆栽试验试验共设5个处理，每处理36株烟苗。处理l：Ca处理，全株均匀喷施0．20％(、Ⅳ／v，下同)CaN206"4H20溶液；处理2：B处理，全株均匀喷施0．20％H3803溶液；处理3：Mg处理，全株均匀喷施1．00％MgS04"7H20溶液：处理4：Mo处理，全株均匀喷施0．20％(Nil4)6M07024·4H20溶液；处理5：对照(CK)，全株均匀喷施超纯水。叶面喷施不同浓度的营养元素7d后采用伤根灌液法接种青枯雷尔氏菌，接种浓度均为6．63×107cfu／mL，20mL／株。接种处理后的烟苗放置于昼夜温度为30／27℃、相对湿度85～90％、光照14h的室温进行培养。整个试验己重复3次。1．2．2室内抑菌试验抑菌试验所用的青枯雷尔氏菌的菌种、浓度以及营养元素溶液和处理均与室内盆栽试验一致。具体操作步骤按照HB／卜Ⅳ仃1156．16．2008标准《抑制细菌生长量试验浑浊度法》进行。1．3室内青枯病发病情况调查烟草幼苗接种青枯雷尔氏菌后，每天观察烟草植株生长情况。待发现有烟草植株开始出现明显的青枯病萎蔫症状之后，每天同一时间调查记录烟株发病情况(参考CORESTA方法)【90】，直至CK处理所有供试烟株基本枯死时结束，并按公式(1)、(2)、(3)、(4)计算发病率、病情指数、控病效果和病程进展曲线下面积(AUDPC)。i室内烟苗青枯病病情分级标准(以株为单位)：0级：烟苗无发病症状：1级：l至2片叶片半萎蔫，或茎部褪绿条斑占株高三分之一以18 第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果下；2级：2至3片叶片萎蔫，或茎部褪绿条斑在三分之一至二分之一株高之间；3级：健叶1至2片，或茎部褪绿条斑在二分之一至三分之二株高处；4级：烟株无健叶，基本枯死，或茎部褪绿条斑超过三分之二株高。ii烟株发病率、病情指数、控病效果、病程进展曲线下面积(AUDPC)计算方法：发病率(铲篇×10。(1)病情指数：∑(发病株数×该病级代表值)控病效果(％)调查总株数×最高级代表值X100一(对照病情指数一处理病情指数)对照病情指数(2)X100(3)病程进展曲线下面积AUDPC=Y[(xi+Xi-I)／2](ti—ti．1)(4)公式(4)中Xi和Xi．1代表病情指数或发病率，ti和ti-l代表后一次调查与前一次调查相差的时间间隔(本文为2)t121。1．4青枯雷尔氏菌生长量测定根据liB／NY厂r1156．16．2008标准《抑制细菌生长量试验浑浊度法》，开始培养前用WGZ．2．XJ细菌浊度计分别测定各处理的浑浊度，待各处理分别培养24h、48h后再测定并记载各处理的浑浊度，根据公式．(5)计算抑菌率。抑菌率(％)=(空白对照浑浊度增加值一元素处理浑浊度增加值)／空白对照浑浊度增加值×100(5)1．5数据处理采用Excel2003对试验数据进行基本处理，计算出发病率、病情指数以及控病效果，然后采用SPSS16．0统计软件Duncan法比较分析相关数据在显著水平为0．05时的差异。2结果与分析2．1Ca、B、Mg、Mo4种元素对烟草青枯病室内发病率的影响不同元素在植物体内发挥的作用各有不同，对植物抗病能力的影响也存在着差异。根外增施ca、B、Mg、Mo4种中微量元素对烟草青枯病室内发病率有着不同程度的影响，且方差分析表明相互间差异显著(图3．1)。Mo处理青枯病发病最轻，且典型萎蔫症状出现的时间比其它处理晚2d，其次为Ca处理，对照处理青枯病发病最重；当接种后第10d对照发病率达100％时，Mo、Ca处理分别为61．11％和72．22％，分别比对照低38．89％和27．78％，其与对照差异显著；在接种后第14d，Mo、Ca处理分别为72．22％和83．33％，分别比对照低27．78％和16．67％，与对照差异显著。说明在温室条件系叶面补充4种矿质营养均可有效抑制室内烟草青枯病的扩展，均可不同程度地增强烟草抗青枯病的特性，以补充Mo营养最好，其可明显推迟青枯病典型萎蔫症状出现的时间。19 西南大学硕士学位论文霎、-一8号．量Q基．曼Q瓣堠《02468101214接种后天数Daysafterincoculation(d)图3．1不同元素对室内烟草青枯病发病率的影响Fig．3．1Theeffectofdifferenttreatmentsonincidenceoftobaccobacterialwiltingreenhouse注：折线图上的误差线表示标准偏差，n=3；不同字母表示PS0．05水平下差异显著(Duncan)；下同。Errorbarsrepresentedstandarddeviationinaboveline，n=3；DifferentlettersmeantsignificantdifferenceatO．05levelbyDuncan；Thesamebelow．2．2Ca、B、Mg、Mo对青枯病室内病情指数的影响卷暑．一基．蟹D籁靼避堠02468101214接种后天数Daysafterinoculation(d)图3．2不同元素对室内烟草青枯病病情指数的影响Fig．3—2TheeffectofdifferenttreatmentsonindexoftobaccobacterialwiltingreenhouseCa、B、Mg、Mo4种中微量元素对室内烟草青枯病病情指数的影响如图3-2所示，Mo处理青枯病病情进展最慢，出现典型症状的时间比其它处理晚2d，其次为Ca处理，对照发病最重。结合图3—1，在接种后第10d对照青枯病发病率达到100％、病情指数为81．94时，Mo、20∞如舳加∞如∞如加m0∞如舳加∞如柏如加mO 第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果Ca处理病情指数依次为29．17和34．72，分别比对照低52．77和37．22，与其余差异显著；在接种后第14d，对照病情指数为98．61时，Mo、Ca处理病情指数依次为34．72和41．67，分别比对照低63．89和56．94，与其余处理差异显著。说明在一定程度上叶面补充4种矿质营养均可有效减轻室内烟草青枯病发生的严重度，阻止青枯病的蔓延，尤其是Mo、Ca营养。2．3Ca、B、Mg、Mo对室内烟草青枯病病程进展曲线下面积(AUDPC)的影响DSD102004006008001000AUDPC图3．3不同处理室内烟草青枯病AUDPC的比较Fig．3-3ComparisonofAUDPCofdifferenttreatmentsontobaccobacterialwiltingreenhouse注：柱图上的误差线表示标准偏差，n=3；不同字母表示PSO．05水平下差异显著(Duncan)；下同。图III中AUDPC为病程进展曲线下的面积的简称，DI、DS分别代表基于青枯病发病率、病情指数计算出的病程进展曲线下的面积。Note：Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovebargraph，n=3；DifferentlettersmeantsignificantdifferenceatO．05levelbyDuncan；Thesalnebelow．TheAUDPCwasareaunderdiseaseprogresscurve，DIandDSindividuallyrepresentedtheareaunderdiseaseprogresscurveonthebasisofincidenceandindexoftobaccobacterialwiltinFig．3-3．病程进展曲线下面积(AUDPC)是衡量寄主植物抗病特性的一个重要指标。ca、B、Mg、Mo4种中微量元素处理对烟草青枯病病程进展曲线下面积(AUDPC)有着不同程度的影响(图3．3)。无论是根据青枯病发病率还是病情指数计算出来的AUDPC均以Mo处理最小，其次为Ca处理；两处理AUDPC分别比对照低300．00、244．44(基于发病率)和380．56、352．78(基于病情指数)，两者间差异不显著，但与其余处理差异显著。说明根外增施Ca、B、Mg、Mo4种元素均可不同程度地增强烟草抗青枯病的特性，以Mo、Ca处理效果最明显。2．4Ca、B、Mg、Mo对烟草青枯病的室内控病效果不同元素对植物抵抗不同病原菌的侵染有着不同的影响。由图34可知，根外增施Ca、B、21 西南大学硕士学位论文Mg、Mo4种烟草必需矿质营养对室内烟草青枯病的发生均有一定的控制作用，Mo处理室内控病效果最好，其次为Ca处理；B、Mg处理对室内烟草青枯病的控病效果不显著。在接种后第10d(对照发病率达100％)，Mo、Ca处理对室内烟草青枯病的控病效果依次为64。39％和57．63％；在接种后第14d(对照处理烟株基本枯死)，Mo、Ca处理对室内烟草青枯病的控病效果分别为64．79％和57．67％，分别比B、Mg处理高29．58％、29．52％和22．46％、22．40％。说明增施Mo、Ca营养可有效控制室内烟草青枯病的发生，Mo处理控病效果最明显。§、-一蚕鲞三昌gU回∈较堠跫U2468101214接种后天数Daysafterinoculation(d)图3-4不同处理对烟草青枯病的室内控病效果Fig．34Comparisonofcontrolefficacyofdifferenttreatmentsagainsttobaccobacterialwiltingreenhouse2．3Ca、B、Mg、Mo4种元素对青枯雷尔氏菌生长量的影响3530J{25蒯电嗣翌20翘一萋耄．5善10oU5024h处理时间Treatmenttime(h)∞如舳约∞如∞∞加mO 槲：I函最第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果45403524h48h处理时间Treatmenttime(h)图3．5不同处理对青枯雷尔氏菌生长量的影响Fig．3-5EffectofdifferenttreatmentsonthereproductionofRalstoniasolanacearum不同矿质元素对青枯雷尔氏菌的生长、繁殖均可能存在直接或间接的影响。本研究测定Ca、B、Mg、Mo4种供试元素处理后青枯雷尔氏菌在NB培养基中的生长情况发现，4种供试元素对青枯雷尔氏菌均存在一定的直接抑制作用，且方差分析表明相互间差异显著；培养48h后培养基中青枯雷尔氏菌的数量显著高于培养24h的。培养24h后不同处理对青枯雷尔氏菌的抑菌率以Mo处理最高35．93％，其次为Ca处理33．13％，两者差异不显著：培养48h后，Ca处理对青枯雷尔氏菌的抑菌效果最高，为16．93％，其次是Mo处理，为13．52％，两者差异显著。说明Ca、B、Mg、Mo4种供试元素对青枯雷尔氏菌的生长繁殖均存在一定的直接影响，Ca、Mo处理效果较好。(图3．5I、II)3结论与讨论3．1结论本研究首次证实0．20％(w／v)(NH4)6M07024·4H20对青枯雷尔氏菌具有直接抑菌作用，对烟草青枯病具有较好的控病效果。Ca、B、Mg、Mo4种元素对烟草青枯病室内发病情况的影响研究结果显示，在保证烟株正常生长营养的基础上，增施Ca、B、Mg、Mo4种矿质元素对烟草青枯病均有一定的控病效果，Mo处理最好，其次为Ca处理，两处理对烟草青枯病的发生均具有一定的推迟、延缓发病作用，当对照发病率为100％时，Mo、Ca处理的发病率分别比对照低38．89％和27．78％，两处理的病情指数分别比对照低52．77和37．22，均与对照差异显著：两处理病程进展曲线下面积(AL乃)Pc)显著低于其余处理，分别比对照低300．00、244．44(基于发病率)和380．56、352．78(基于病情指数)；对青枯病的室内末次控病效果分别为64．79％、57．67％。4种元素对青枯雷尔氏菌生长量的影响研究结果显示，Mo、Ca处理对青枯病菌具有一定的直接抑制作用，处理24h后抑菌率最高，分别为35．93％、33．13％。如筋加巧m，O^摹一g暑co薯丑互口H 西南大学硕士学位论文3．2讨论研究结果表明，在保证烟株正常生长营养的基础上再增施0．20％Mo或Ca矿质营养可有效推迟或延缓烟草青枯病的发生，可显著降低烟草青枯病的发病率和病情指数，且对青枯雷尔氏菌的生长具有一定的直接抑制作用，在一定范围内可对烟草青枯病进行有效防控。关于不同元素在烟草青枯病防控上的最佳用量还有待进一步研究。矿质营养调节是控制植物土传病害的有效措施之一。本研究结果证实烟株的营养状况与其抗病性密切相关，定期向烟株增施Mo、Ca营养可增强烟草对青枯病的防御能力并提高其抗青枯病的特性，对烟草青枯病具有明显的控病作用。有研究指出【11’381，植物的营养水平影响其防御能力，不同矿质营养对不同作物的健康、不同病原物侵染引起的本能的防御反应都有着积极的影响；通过调节矿质营养这个重要的环境因子，可以影响寄主植物和病原物；但关于在病原菌存在条件下相关元素怎样改善植物生长发育和降低病害严重度的机制还有待进一步研究。另有研究指[1236,52-53,55,99]，硅营养降低番茄青枯病严重度的机制在于：硅处理后可显著降低感病植株体内细菌的数量，诱导寄主植物细胞壁果胶多糖结构改变，可显著增加土壤脲酶和土壤酸性磷酸酶的活性；硅处理主要调节一些与寄主植物防御反应、信号转导以及转录相关的基因；其主要状态可能被乙烯、茉莉酸或活性氧的种类等信号途径调节。综上可知，对于一些目前尚无较好化学防控措施的病害，调节矿质营养可能是一条值得探讨的新途径[1l,100】。这对植物病害防控上营养．控病模型的构建具有重要意义，有利于进一步完善植物的营养病理学研究。调控烟株Mo、Ca营养可较好地控制烟草青枯病的原因可能包括如下几个方面。首先，Ca可以在胞间层形成多聚半乳糖醛酸钙，有助于提高细胞壁的稳定性、减少病原物的侵染；Ca能有效抑制多聚半乳糖醛酸酶(与病原菌侵染植物组织有关)的活性，减少病原物的侵染机会，增强抗病力【11】。其次，Ca营养对番茄青枯病具有较好的控病效果；增加营养液中Ca浓度可减轻青枯病严重度，在抗病品种番茄苗上，同时还可减少茎秆上的菌量，这与本研究所得的Ca能直接抑制青枯雷尔氏菌的生长的结果相一致：在接种病原菌之前，细胞壁内的钙不参与Ca的依赖抗性：高抗品种吸收更多的Ca；番茄对青枯病的抗性显著地被寄主的Ca营养状况影响，Ca钙浓度越高，青枯病发病越轻[56-62】。第三，Mo主要存在于植物的韧皮部和维管束薄壁组织中，可以在韧皮部内转移，是硝酸还原酶的必需成分，是固氮酶中的钼铁蛋白的组分；Mo在植物氮代谢中起重要作用，能提高过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶及抗坏血酸酶等防御酶系的活性，提高植物抵抗病害的能力[87,103-104】：另有研究指出【98】，Mo营养在植物体内的可用性可能对K．．N平衡和营养利用率存在影响，Mo营养可能对部分植物病害发生的严重度存在一定的影响，但是其作用机制尚不清楚。因此，关于Mo营养影响植物抗青枯病的作用机理还有待进一步研究。 第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果第2节钼素不同用量对烟草青枯病的室内控病效果通过对采自重庆市青枯病发生典型的植烟区烟株根际土壤样品的矿质营养情况进行分析发现，大部分烟区烟株根际土壤平均有效钼含量均处于缺乏等级，仅彭水县植烟区平均有效钼含量处于中等含量状态，平均有效钼含量处于丰富等级的未发现(待发表)，结合本论文第二章和第三章第l节的结果，进而推之烟株钼营养水平与其抗青枯病特性之间可能存在一定的相互关系。加之，目前关于矿质营养与烟草青枯病关系的研究鲜见报道，关于Mo营养与烟草青枯病的关系的研究未见报道。对此，本节设置0．20％、0．10％、0．05％、0．02％4个Mo浓度，进行室内试验，旨在明确不同浓度Mo营养对烟草青枯病的室内控病效果，进而筛选出Mo营养在防控烟草青枯病方面的最佳用量，以期为从营养．病理学角度、从增强作物自身抗病特性层面解决茄科类青枯病防控难的问题提供科学依据。1材料与方法1．1供试材料1．1．1供试烟草品种同本章第1节1．1．1部分。1．1．2供试病原菌同本章第l节1．1．2部分。1．1．3供试矿质营养供试营养元素Mo原材料为钼酸铵((NH4)6M07024·4H20)(AR)，金堆城钼业股份有限公司化学分公司生产。试验过程中采用超纯水将其溶解到试验所需浓度。1．1．3仪器同本章第1节1．1．5部分。1．2试验设计试验共设5个处理，每处理36株烟苗。处理l_4依次为：全株均匀喷施0．20％(w／v，下同)、0．10％、0．05％、0．02％(NIX4)6M07024"4H20溶液；处理5：对照(CK)，全株均匀喷施超纯水。叶面喷施不同浓度的营养元素7d后采用伤根灌液法接种青枯雷尔氏菌，接种浓度均为6．42×107cfu／mL，20mL／株。接种处理后的烟苗放置于昼夜温度为30／27℃、相对湿度85～90％、光照14h的室温进行培养。整个试验已重复3次。1．3室内青枯病发病情况调查调查方法见本章第1节1．3部分。1．4数据处理采用Excel2003对试验数据进行基本处理，计算出发病率、病情指数和控病效果，然后 西南大学硕士学位论文采用SPSS16．0统计软件Duncan法比较分析相关数据在显著性水平为0．05时的差异。2结果与分析2．1Mo素对烟草青枯病室内发病率的影响篡ic)矗暑．gQ基．璺凸瓣倏螭3579ll1315接种后天数Daysaft日meoeulation(d)图3．6不同处理对烟草青枯病发病率的影响(室内试验)Fig．3-6Effectofdiff矗enttreatmentsonmcidenceoftobaccobacterialwiltingreenhouse注：折线图上的误差线表示标准偏差，n=3；不同字母表示pS0．05水平下差异显著(Duncan)：下同。Note：Errorbarsrepresentedstandarddew．ioninabovclineorbargraph，n=3；Differentleaersmeantsignificantdifferenceat0．05levelbyDuncan；Thesamebelow．青枯病一旦侵染寄主植物之后扩展十分迅速，0．02％、0．05％、0．10％、O．20％4个Mo营养水平处理对烟草青枯病室内发病率有着不同程度的影响，且方差分析表明相互间存在显著差异(图3．6)。在接种后第3d，0．02％、O．05％、O．10％、CK等处理均有烟草青枯病发生，而0．20％Mo处理直到接种后第5d才有青枯病典型症状出现；当对照青枯病发病率达100％时(接种后第13d)，0．20％处理青枯病发病率比对照低33．33％，与其余处理差异显著。说明，在室内环境条件下，0．20％Mo处理具有推迟烟草青枯病典型症状出现的时间。2．2Mo素对烟草青枯病室内病情指数的影响0．02％、0．05％、0．10％、0．20％4个Mo营养水平处理对烟草青枯病室内病情指数有着不同程度的影响，不同处理青枯病病害严重度增加呈逐渐上升趋势，且方差分析表明相互间存在显著差异(图3．7)。结合图3．17，在接种后第3d，0．02％、0．05％、0．10％、CK等处理均有烟草青枯病发生，而0．20％Mo处理直到接种后第5d才有青枯病典型症状出现：当对照青枯病发病率100％时(接种后第13d)，0．20％处理青桔病病情指数比对照低57．29，与其余处理差异显著。说明，在室内条件下，0．20％Mo处理具有延缓烟草青枯病发病严重度的作用。26∞如舳加∞如∞如加mO 第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果le090嗣名80a》70苦60蓥50磐40螵30201003579ll接种后天数Daysafterinoculation(d)图3-7不同处理对烟草青枯病病情指数的影响(室内试验)Fig．3-7Effectofdifferenttreatmentsonindexoftobaccobacterialwiltingreenhouseexperiment2．3Mo素对烟草青枯病室内病程进展曲线下面积(AUDPC)的影响1200800U蛊600o《4000DIDS图3—8不同处理对烟草青枯病病程进展曲线下面积(AUDPC)的影响(室内试验)Fig．3-8EffectofdifferenttreatmentsonAUDPCoftobaccobacterialwiltingreenhouseexperiment注：柱图上的误差线表示标准偏差，n=3；不同字母表示P冬0．05水平下差异显著(Duncan)。图中AUDPC为病程进展曲线下的面积的简称，DI、DS分别代表基于青枯病发病率、病情指数计算出的病程进展曲线下的面积。Note：Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovebargraph，n=3；DifferentlettersmeantsignificantdifferenceatO．05levelbyDuncan．TheAUDPCwasamunderdiseaseprogresscurve，DIandDSindividuallyrepresentedtheareaunderdiseaseprogresscurveonthebasisofincidenceandindexoftobaccobacterialwiltinFig．3—8．27 西南大学硕士学位论文在温室条件下，O．02％、0．05％、0．10％、O．20％4个Mo营养水平处理后烟草青枯病病程进展曲线下面积(基于青枯病发病率或病情指数计算)不尽相同，且方差分析表明相互间存在显著差异(图3．8)。无论是基于发病率(DI)，还是依据病情指数(DS)计算出来的烟草青枯病病程进展曲线下的面积(AUDPC)均显著低于其余处理，分别显著比对照低404．17和405．21。说明，在温室条件下，0．20％Mo处理有利于增强烟草的抗病能力，促进烟草抗青枯病能力的表现。2．4Mo素对烟草青枯病的室内控病效果根据利比希最小因子定律——当植物所能利用的某种物质的量紧密地接近所需的最低量时，该物质就可能对植物的健康生长起限制作用，成为限制因子——结合目前部分植烟土壤存在的问题(营养失衡，Mo缺乏)，探索Mo与青枯病的关系具有重要意义。从图3-9可知，不同浓度Mo处理对室内烟草青枯病有着不同的控病效果，且方差分析表明不同处理间差异显著：0．20％Mo处理对烟草青枯病的控病效果最好，其次为0．10％处理。当对照发病率为100％时(接种后第13d)，0．20％、0．10％Mo浓度处理对烟草青枯病的室内控病效果分别为61．78％、52．29％，两者间差异显著，与其余处理差异显著。说明，在一定程度上，根外增施0．20％Mo可有效控制烟草青枯病的扩展、蔓延或阻止青枯雷尔氏菌的传播，对烟草青枯病具有较好的控制作用。S富鼋歪吾眯较爆裂3接种后天数Daysafterinoculation(d)图3-9不同处理对烟草青枯病的控病效果比较(室内试验)Fig．3-9Comparisonofdifferenttreatmentsonthecontrolefficacyagainsttobaccobacterialwilt(greenhouseexperiment)3结论与讨论3．1结论通过比较0．02％、0．05％、0．10％、0．20％4个Mo营养水平对烟草青枯病室内发病情况的影响，发现在保证烟株正常生长营养的基础上，增施0．20％Mo营养可有效延缓、减轻烟草青2R∞如舳加∞如柏如加mO 第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果枯病的发生与危害；当对照青枯病发病率为100％时(接种后第13d)，0．20％处理青枯病发病率比对照低33．33％、病情指数比对照低57．29、病程进展曲线下的面积(AUDPC)比对照低404．17(基于DI)和405．2(基于DS)，均与其余处理差异显著，对室内烟草青枯病的最终控病效果为57．06％。3．2讨论早在20世纪80年代就有研究指出【100】，对一些特殊的目前尚无较好的化学防治方法的病害，调节矿质营养是一条值得探讨的新途径。通过调节矿质营养这个重要的环境因子，可以影响寄主植物与病原物间的相互作用；矿质营养调节是化学防治方法的补充，是控制植物病害发生的有效措施之一【l¨。本研究也证实在保证烟株正常生长营养的基础上，增施0．20％Mo营养可有效增强烟草对青枯病的抵抗能力。其原因可能是由于钼主要存在于韧皮部和维管束薄壁组织中，可以在韧皮部内转移，是硝酸还原酶的必需成分，是固氮酶中的钼铁蛋白的组分，在植物氮代谢中其重要作用，能提高过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶等防御酶的活性，提高植物抵抗病害的能力[87,103-104】。此外，钼营养在植物体内的可利用性可能对K-N平衡和营养利用率有影响，钼营养可能对部分植物病害发生的严重度存在一定的影响，但是其作用机制还有待进一步研究。29 西南大学硕士学位论文第3节不同方式补充钼素对烟草青枯病的室内控病效果植物对不同矿质营养的最佳吸收方式不尽相同，对其抗病特性的表现也存在不同程度的影响。根据第二章和本章第l节的试验结果，可初步确定钼素与烟草抗青枯病的特性之间可能存在一定的联系，为了进一步探索钼素影响烟草抗青枯病间的机理，明确对烟草补充钼素的最佳方式显得尤为重要。对此，本节设置了叶面喷雾、灌根、窝施3种向烟株补充钼素的方式进行室内试验，并比较了钼素不同施用方式对烟草抗青枯病的影响，旨在为进一步研究钼素与烟草抗青枯病的关系奠定基础。1材料与方法1．1供试材料1．1．1供试烟草品种同本章第l节1．1．1部分。1．1．2供试病原菌同本章第l节1．1．2部分。1．1．3供试矿质营养同本章第2节1．1．3部分。1．1．3仪器同本章第l节1．1．5部分。1．2试验设计试验共设4个处理，每处理36株烟苗。处理l：全株均匀喷施10mL0．20％的(NH4)6M0704·4H20溶液：处理2：用0．20％的(NH4)6M0704"4H20溶液灌根，10mL／株；处理3：每株施用0．02g(NH4)6M0704"4H20；处理4：喷施超纯水。处理7d后采用伤根灌液法接种青枯病雷尔氏菌，接种浓度均为5．43×107cfu／mL，20mL／株。接种处理后的烟苗放置于昼夜温度为30／27。C、相对湿度85---．90％、光照14h的室温进行培养。整个试验已重复3次。1．3室内青枯病发病情况调查调查方法见本章第l节1．3部分。1．4数据处理采用Excel2003对试验数据进行基本处理，计算出发病率、病情指数以及控病效果，然后采用SPSS16．0统计软件Duncan法比较分析相关数据在显著性水平为0．05时的差异。2结果与分析2．1不同方式补充Mo素对烟草青枯病室内发病率的影响30 第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果植物吸收不同元素的方式不尽相同，加之在病原菌存在的条件下，怎样保证植物最适量地吸收某种矿质元素，进而保证其体内的营养平衡，增强其抗病特性，研究补充各元素针对该植物最佳的施用方式尤为重要。对此，本研究比较了叶面喷雾、灌根、窝施3种向烟草补充Mo营养的方式对烟草抗青枯病的影响。就Mo对烟草青枯病发病率的影响而言，叶面喷雾方式处理明显低于其余处理，青枯雷尔氏菌导致该处理烟草出现典型萎蔫症状的速度最慢，比其它处理晚2d出现；其次是灌根处理，窝施处理最差；当对照烟株全部发病时(即发病率为100％，接种后第10d)，喷雾和灌根处理青枯病发病率分别为55．56％和61．11％，分别比对照低44．44％和38．89％。说明在温室条件下以叶面喷雾和灌根方式向烟株补充Mo营养对烟草青枯病的扩展、青枯雷尔氏菌的传播均具有一定的抑制作用，以叶面喷雾方式效果最明显。(图3．10)100摹80Q‘)祷暑60璨‘互粼‘暑器40o口2002468101214接种后天数Daysafterinoculation(d)图3．10不同处理对烟草青枯病发病率的影nil(室内试验)Fig．3-10EffectofdifferenttreatmentsOilincidenceoftobaccobacterialwiltingreenhouse注：折线图上的误差线表示标准偏差，n=3：不同字母表示P卯．05水平下差异显著(Duncan)：下同。Note：Errorbarsrepresentedstandarddeviationinaboveline，n=3；Differentlettersmeantsignificantdifferenceat0．05levelbyDuncan；Thesamebelow．2．2不同方式补充Mo素对烟草青枯病室内病情指数的影响分别采用叶面喷雾、灌根、窝施3种方式向烟草补充Mo营养后，烟草青枯病发生严重度均呈逐渐上升的趋势，但喷雾处理病情进展比其它处理缓慢，对照处理病情进展最快，方差分析表明不同处理间青枯病病情指数存在显著差异。从图3．1l可明显看出，喷雾处理烟草出现青枯病的时间比其余处理晚2d；结合图3．13，当对照发病率达100％时，喷雾、灌根、窝施处理青枯病病情指数分别比照低38．89、36．11、25；在接种后第14d，对照病情指数为95．83时，喷雾、灌根、窝施处理分别比照低56．94、54．17、41．67。说明在温室条件下以叶面喷雾、灌根、窝施3种方式向烟株补充Mo营养对青枯雷尔氏菌的侵染、繁殖、传播可能均具有一定的抑制作用，以喷雾方式处理效果最好。3l 西南大学硕士学位论文籁靼逛惧024681012接种后天数Daysafterginoculation(d)图3-11不同处理对烟草青枯病病情指数的影响(室内试验)Fig．3-llEffectofdifferenttreatmentsonindexoftobaccobacterialwiltingreenhouse142．3不同方式补充Mo素对烟草青枯病病程进展曲线下面积(AUDPC)的影响DSD101002003004005006007008009001000AUDPC图3—12不同处理对烟草青枯病病程进展曲线下面积(AuDPc)的影响(室内试验)Fig．3—12EffectofdifferenttreatmentsonAUDPCoftobaccobacterialwiltingreenhouse注：柱图上的误差线表示标准偏差，n=3；不同字母表示P≤O．05水平下差异显著(Duncan)；图III中AUDPC为病程进展曲线下的面积的简称，DI、DS分别代表基于青枯病发病率、病情指数计算出的病程进展曲线下的面积。Note：Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovebargraph，n=3；Differentlettersmeantsignificantdifferenceat0．05levelbyDuncan．TheAUDPCwasareaunderdiseaseprogresscurve，DIandDSindividuallyrepresentedtheareaunderdiseaseprogresscurveonthebasisofincidenceandindexoftobaccobacterialwiltinFig．3．12．32∞如踮加∞如∞如加m0器口旨。痞2_f1 第三章矿质营养Mo对烟草青枯病的室内控病效果分别以叶面喷雾、灌根、窝施3种方式处理后青枯病的发病率、病情指数为参数计算室内烟草青枯病病程进展曲线下面积发现，不同处理不同参数间均存在显著差异(图3．12)。基于发病率计算的病程进展曲线下面积(DI)，喷雾、灌根、窝施3种方式处理分别比对照低405．56、316．67、188．89，相互间差异明显：基于病情指数计算的病程进展曲线下面积(DS)，喷雾、灌根、窝施3种方式处理分别比对照低359．72、318．06、247．22，相互间差异显著。说明在温室条件下以叶面喷雾、灌根、窝施3种方式向烟株补充Mo营养均有利于增强烟草对青枯病的抗病能力，叶面喷雾方式处理效果最明显。2．4不同方式补充Mo素对烟草青枯病的室内控病效果以不同的方式向植物补充同一矿质营养，植物对其吸收、利用率不尽相同，进而对植物的生长及抗逆能力也有可能产生不同的影响。比较叶面喷雾、灌根、窝施3种向烟草补充Mo营养的方式对室内烟草青枯病的控病效果发现，以叶面喷雾方式处理对青枯病的控病效果最好，其次为灌根处理，窝施处理效果最差，相互间差异显著；在对照发病率达100％时(接种后第10d)，3个处理对青枯病的控病效果依次为63．69％、59．23％、41．07％，喷雾、灌根处理间差异不显著，但与窝施处理差异显著；在接种后第14d，3个处理对青枯病的控病效果分别为59．43％、56．53％、43．41％，差异性与接种后第10d一致。说明喷雾和灌根处理对室内烟草青枯病均具有较好的控病效果。(图3．13)U2468101214接种后天数Daysafterinoculation(d)图3．13不同处理对烟草青枯病的室内控病效果Fig．3-13Comparisonofcontrolefficacyofdifferenttreatmentsagainsttobaccobacterialwiltingreenhouse3结论与讨论3．1结论研究结果表明，在室内环境(温室)条件下，以喷雾、灌根、窝施3种方式根外增施Mo素对烟草青枯病均具有一定的控病效果，其中以叶面喷雾方式补充钼营养对青枯病的控病效33∞如∞加∞如∞如加m0一装一萝蠕芎一暑口ou张较懊翅 西南大学硕士学位论文果最佳，可明显推迟青枯病典型萎蔫症状出现的时间以及降低烟草青枯病的严重度。当对照青枯病发病率为100％时，3种补充方式控病效果依次为63．69％、59．23％、41．07％，病情指数依次比对照低38．89、36．11、25。00，病程进展曲线下的面积比对照低405。56、316．67、188．89(DI)和359．72、318．06、247．22fDS)。3．2讨论本研究证实叶面喷雾是向烟草补充钼营养的最佳方式，其次为灌根方式。对此，建议在实际生产过程中可采用叶面喷雾的方式向烟草补充钼营养；如果采用窝施方式补充钼营养，则应注意钼肥与烟株之间的距离，切忌钼肥与烟株或烟根直接接触(钼素用量较大时，直接接触烟株可能会导致毒害，影响烟株的正常生长)；若再辅以一些恰当的农艺措施，及时拔除病株，可有效延缓或减轻烟草青枯病的发生。34 第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理植物必需矿质元素不仅对植物的正常生长和发育起着至关重要的作用，而且还以多种方式直接或间接地对病原物的侵染和繁殖以及寄主植物的抗病或感病性产生影响【Il'471。已有大量研究指出，补充部分植物必需矿质元素能够促进植物体内一些防御酶活性的表达，如补充钼素将提高植物体内过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶等防御酶的活性[87,103-104】，补充钙营养可提高植物体内超氧化物歧化酶、过氧化物酶等多种酶的活性‘¨1等。但是，关于钼素不同浓度处理后感染青枯病的烟株体内防御酶的活性是怎样变化的、哪些酶在起作用以及该元素与其它元素的作用有什么区别，目前未见报道。对此，本章在本文第二、三章研究结果的基础上，研究了不同浓度的铝营养处理后感病烟株体内防御酶活性的变化，同时也比较了钙、硼、镁、钼4种元素在增强烟草抗青枯病的生理生化机理的差异，旨在为进一步研究钼素、烟草、青枯雷尔氏菌三者之间的互作机理奠定基础。第1节钼素影响烟草抗青枯病的生理生化机理根据利比希最小因子定律——植物生长的好坏取决于相对有效程度最低的那种营养物质的供给水平，以及钼营养可能对一些植物病害发生的严重度有一定的影响【38】。对此，在明确以叶面喷雾方式增施0．20％铝酸铵对烟草青枯病具有较好控病效果的基础上，为了进一步明确钼素影响烟草抗青枯病的生理生化机理，本节设置0．20％、0．10％、0．05％、0．02％4个Mo浓度进行试验，比较了不同浓度Mo营养对感染青枯病烟草体内部分防御酶活性的变化情况，以期从生理生化方面明确Mo调控烟草抗青枯病的生理生化途径，为从营养．病理学角度、从增强作物自身抗病特性层面解决茄科类青枯病防控难的问题提供科学依据。1材料与方法1，1供试材料1．1．1供试烟草品种同第三章第l节1．1．1部分。1．1．2供试病原菌同第三章第l节l。1．2部分。1．1．3供试矿质营养同第三章第2节1．1．3部分。1．1．4仪器WGZ．2．XJ细菌浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司。UVl000单束紫外可见分光光度计(SpectrophotometerTechcomp)，上海天美科学仪器有限公司。iMark酶标仪，北京泰泽嘉业科技发展有限公司。35 西南大学硕士学位论文1．2试验设计同第三章第2节1．2．1部分。1．3接种处理后烟草叶片中防御酶系指标、丙二醛含量的测定在室内烟草青枯病发病初期，随机取3盆烟苗，取其从上往下数第三片真叶作为待测鲜样品，将其洗净后用于可溶性蛋白的含量，以及过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和丙二醛(MDA)活性的测定。粗酶液提取：将新鲜样品放入预冷的研钵中，加入5mL粗酶提取缓冲液，在冰浴上充分研磨后转移至预冷的离心管，然后10000rpm、4℃离心20min，上清液为酶粗提取液。根据实验需求将粗酶液迅速分装成多管(使用前，先预冷处理)并放入．80℃冰箱中保存备用‘11】。酶液粗提缓冲液：0．2mol／LpH8．8硼酸缓冲液；5mmol／LMe(2．巯基乙醇)；lmmol／LEDTA；PVP少许。1．3．1可溶性蛋白含量的测定1．3．1．I原理蛋白质的存在会影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。考马斯亮蓝(G．250)因其存在的形式不同表现为红色或蓝色。游离状态下呈红色，在稀酸溶液环境中与蛋白质结合后变为蓝色或青色，反应2．5min后在595nlll处具有最大光吸收，且能够稳定1h以上。蓝色的深浅与溶液中蛋白质的含量成正比，利用该特性可对未知溶液中的蛋白质进行定量测定[91-92]。1．3．1．2试剂(1)考马斯亮蓝G．250：将100mg考马斯亮蓝染料溶于50mL95％的乙醇中，再加入100mL85％的磷酸，用超纯水定容至1L，过夜后用纱布过滤，并储存于棕色瓶中。(2)牛血清蛋白(标准蛋白质溶液)：将100mg溶于100mL超纯水中，即为1000gg／mL的母液，并置于4℃下保存备用。1．3．1．3方法(考马斯亮蓝G-250法)(1)制作标准曲线(2)向上述7支试管中分别加入5mL考马斯亮蓝G．250，充分摇匀后静置5min，再用酶标仪测定595nnl下的OD值，以蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。(3)取各待酶液40此于试管中，加960gL水，再加5mL考马斯亮蓝G．250，充分摇匀后静置5min，在595hill下测OD值，通过标准曲线查出蛋白含量(pg)。蛋白质含量(mg／g)=(C×VT)／(V。×WF×1000)注：C一查标准曲线值(嵋)VT一粗酶液总体积(mL)36 第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理vs一测定时取酶液的量(mL)wF一样品鲜重(g)1．3．2过氧化物酶(POD)活性测定1．3．2．1原理过氧化物酶(peroxidase，POD)是一种植物体中普遍存在的，与植物的呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等密切相关的酶。测定该酶可以反应某一时期植物体代谢的变化情况。在POD催化下，H202可将愈创木酚氧化成茶褐色产物，该物质在470nm处有最大光吸收。因此，可通过测定一定时间范围内反应液在470nnl下的吸光度变化来间接测定过氧化物酶的活性㈣。1．3．2．2试剂(1)愈创木酚溶液：0．1mol／LpH5．8磷酸缓冲液含0．018mol／L愈创木酚。(2)双氧水溶液：2．5％H202，现用现配。(3)O．2mol／LpH8．8硼酸缓冲液(提取硼酸缓冲液)1．3．2．3方法将由愈创木酚溶液(每个样品2．9mL)与双氧水溶液(每个样品50此)组成的反应混合液先在25℃水浴中预热，然后取反映混合液2．95mL，立即加入酶粗提取液50此启动反应，终体积为3mL，立即用紫外分光光度计测定470ilin下的吸光度。每隔30s读一次OD值，共读5mill【931。空白管用酶提取缓冲液代替酶液。以每分钟内A470变化0．01为1个POD酶活性单位(U)。每个样品重复3次。POD活性(U·g-1．min。1FW)=(A470×VT)／(Vs×0．0l×WF×T)注：VT一粗酶液总体积(mE)V。一测定时取酶液的量(mL)wF一样品鲜重(g)T一反应时间(min)1．3．3过氧化氢酶(CAT)活性测定1．3．3．1原理过氧化氢酶(Catalase，CAT)属于血红蛋白酶，含有Fe，位于微体一过氧化物体、乙醛酸循环体及相关氧化酶定位的细胞器一中。CAT功能在于除去叶片光呼吸时产生的过氧化氢(H202)，催化体内积累的H202分解为水和分子氧，从而减轻H202对植物组织造成的氧化伤害p11。CAT在其催化过H202分解为水和分子氧的过程中起电子传递作用，而过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。根据反应过程中H202的消耗量可测定CAT酶的活性；H202在波长240nnl处有最大光吸收，利用紫外分光光度计可以检测过H202含量的变化。1．3．3．2试剂(1)用0．1mol／LpH7．0的磷酸缓冲液，将0．6mL30％H202稀释到100mL作为底物溶液。(2)0．1mol／LpH8．8硼酸缓冲液。1．3．3．3方法测定时先将由定量的底物溶液(每个样品1．0mE)、pH8．8的硼酸缓冲液(每个样品80此)和超纯水(每个样品1．9mE)组成的反应混合液于25oC水浴中预热。然后取2．90mL反应混合37 西南大学硕士学位论文液于1个已编号的5mL离心管中，再加入40此酶粗提取液，立即置于分光光度计240nln下测定吸光度，每隔20s读一次值，共读3min[93-94]。以加入超纯水为对照。以每分钟内A240变化0．1为1个CAT酶活性单位(u)。每个样品重复3次。CAT活性(U·g-1．min’1FW)=(AA240×VT)／(VsxO．1×WF×T)注：、■一粗酶液总体积(mL)V。一测定时取酶液的量(mL)WF一样品鲜重(g)T一反应时间(mill)1．3．4超氧化物歧化酶(SOD)活性测定1．3．4．1原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)能抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可氧化物质存在条件下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化产生02一，02一可将NBT还原为蓝色的甲臌，后者在560nnl处有最大光吸收，而SOD可清除02一从而抑制甲躜的形成。因此，光还原反应后反应混合液蓝色越深，说明酶活性越低，反之活性则越高；将NBT的还原剂抑制到对照一半(50％)时所需要的酶量定义为一个酶活性单位，据此可计算酶的活性大小‘95-961。每个样品重复3次。1．3．4．2试剂及方法采用SOD试剂盒测定(南京建成生物工程研究所)。SOD活性(U·百1FW)=((Ao—As)×VT)／(Ao×0．5×WF×Vs)注：‰一光照对照管的吸光值As一样品管的吸光值VT一粗酶液总体积(mL)V。一测定时取酶液的量(mL)wF一样品鲜重(g)1．3．5多酚氧化酶(PPO)活性测定1．3．5．1原理多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)可催化各种酚被02氧化为醌，可参与植物的光合作用、花色的形成、生长发育、伤口的愈合、末端氧化酶、防御反应以及抗病虫害，处于生物氧化一系列反应的最末端，把电子传递给02的酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌；醌有颜色在525nln下有最大光吸收，据此可测定该酶的活性‘971。1．3．5．2试剂0．02mol／LpH6．8邻苯二酚溶液；O．Imol／LpH6．8磷酸缓冲液(PBS缓冲液)1．3．5．3方法将酶粗提液50此用0．1mol／LpH6．8的含0．02mol／L邻苯二酚的PBS稀释60倍，混合均匀后，于30℃水浴中反应2min。然后用紫外分光光度计分别测量398nm波长下0min、2min吸光度的变化，以不加酶液而加相同体积PBS缓冲液为空白对照，以每分钟OD398值变化0．0l为1个酶活单位。每个样品重复3次。PPO活性(U·g-1．min‘1FW)=(AA398×vT×V反)／Ⅳs×0．01×WF×T)38 第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理注：、■一粗酶液总体积(mL)V。一测定时取酶液的量(mL)V反一反应体积(mE)WF一样品鲜重(g)T一反应时间(mKn)1-3．6苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定1．3．6．1原理苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase，PAL)是植物次生代谢物质合成的一个关键酶，可催化苯丙氨酸的脱氨反应，使Nil3释放形成反式肉桂酸。根据产物反式肉桂酸在290nnl处吸光度的变化可测定该酶的活性‘91-921。1．3．6．2试剂0．05mol／LpH8．8硼酸缓冲液0．01mol／L苯丙氨酸O．2mL6mol／LHCl1．3．6．3方法(1)调零：以50lxL0．2mol／LpH8．8的提取缓冲液代替酶液，加0．1mL0．01mol／L苯丙氨酸溶液，再加3．85mL水后，混合均匀。(2)样品测定：取50此酶液，加入0．6mL0．05mol／LpH8．8硼酸缓冲液中，再加O．1mL0．01mol／L苯丙氨酸溶液和3．25Inl水，混合均匀后，于40℃水浴40．60min，然后于冰浴上或加入O．2mL6MHCI终止反应，在290nln下测OD值，重复测量3次，取平均值。在上述条件下，以每小时使OD值变化0．01的酶量定义为一个酶活性单位(u)。PAL活性0-J·g-i．h．1FW)=(A290×VT×V反)／(Vs×0．Ol×WF×T)注：VT一粗酶液总体积(mL)V。一测定时取酶液的量(mE)V反一反应体积(mL)WF一样品鲜重(g)T一反应时间(h)1．3．7丙二醛(MDA)含量测定l-3．7．1原理丙二醛(malondialdehyde，MDA)是膜脂过氧化的最终产物，是反应膜损伤程度的重要生化指标之一，可间接反映植物组织抗氧化能力的大／j．[9引。在酸性、高温条件下，MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红色的--qj／II(3，5，5’一甲基嗯唑2，4一二酮)。三甲川在53213111处有最大光吸收，可溶性糖可能干扰该反应，糖与TBA的反应产物在532nlTl处也有吸收(最大吸收波长在450nnl处)。1．3．7．2试剂O．6％硫代巴比妥酸(TBA)；0．05mol／LpH7．8磷酸缓冲液(PBS)1．3．7．3方法MDA含量的测定采用TBA比色法进行‘111。取酶粗提液2mL与2mLTBA溶液混合均匀39 西南大学硕士学位论文后，沸水煮15min，迅速冷却后再离心20min(12000曲，取上清测OD值。以TBA溶液调零，为防止可溶性糖等的干扰，分别测定450、532、600nln波长下的吸光值，并计算待测样品中丙二醛的含量(mmol·g～Fw)。CMDA(mmol’g-1．FW)=Vr／(Vs×WF)×[6．45×(A532一A600)一0．56×A450】注：Vt一提取液总体积(m1)Vs一测定用提取液体积(m1)FW一样品鲜重(g)1．4数据处理采用Excel2003对试验数据进行基本处理，计算出各相关防御酶的活性，然后采用SPSS16．0统计软件Duncan法比较分析相关数据在显著水平为O．05时的差异。2结果与分析2．1Mo素对接种后烟草叶片可溶性蛋白含量的影响咖}缸皿嘲型缝詹12100468接种天数Daysafterinoculation(d)10图4一l不同处理对青枯病感病烟株可溶性蛋白含量的影响Fig．4—1Theeffectofdifferenttreatmentsonsolubleproteincontentininfectedtobaccoplant注：柱图上的误差线表示标准偏差，n-3；不同字母表示P≤0．05水平下差异显著(Duncan)。下同。Note：Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovebargraph，n=3；DifferentlettersmeantsignificantdifferenceatO．05levelbyDuncan．Thesamebelow．接种后第0(即接种当天)、4、6、8、10d不同Mo素浓度处理后烟叶中可溶性蛋白的含量变化情况如图4．1所示，对结果进行方差分析发现不同处理存在显著差异。试验结果表明，随Mo浓度的增加，烟叶中可溶性蛋白含量逐渐递增；5次测定结果均以0．20％Mo处理可溶性蛋白含量最高，与其余处理差异显著；在发病初期(接种后第6d)达到最大值10．554mg·g-1．FW，比对照高1．64倍；在发病盛期(接种后第10d)，比对照高1．42倍。说明向烟株4086420^≥‰．．．暑．∞基一_I_豆08II童。邕。Iqj—o∞ 第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理补充适量的Mo营养可增加烟草叶片中可溶性蛋白的含量。2．2Mo素对接种后烟草叶片过氧化物酶活性(POD)的影响由图4．2可知，随青枯病病情的加重，在一定范围内，不同处理烟草叶片中POD的活性均呈先增加后降低的趋势；0．20％Mo处理POD活性一直最高，在发病初期(接种后6d)为4145．892U·g-1．min-1FW，比对照增加2．62倍；在发病盛期(接种后第10d)，比对照高1．44倍。说明向烟株补充适量的Mo营养可增加烟叶中过氧化物酶的活性。篁烬溢：SS球蜊O0468接种天数Daysafterinoculation(d)10图4-2不同处理对青枯病感病烟株过氧化物酶活性(POD)的影响Fig．4-2TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofPODininfectedtobaccoplant2．3Mo素对接种后烟草叶片过氧化氢酶活性(CAT)的影响掣蜒避迤甬葚隳捌0468接种天数Daysafterinoculation(d)10图4—3不同处理对青枯病感病烟株过氧化氢酶活性(CAT)的影响Fig．4-3TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofCATininfectedtobaccoplantCAT是植物体内一种重要的活性氧清除酶，可催化对植物有毒害作用的过氧化氢成无毒4lO0O0654321^参山l-Ⅱ1日．I-嚣．≥一白IA口。时Qo乱0987654321一事函．．II眉目．．．∞．fl一蚤IA召冀一《u 西南大学硕士学位论文的水和氧气，从而消除活性氧类对植物细胞的伤害。接种后第0(即接种当天)、4、6、8、10d不同Mo素浓度处理后烟叶中CAT活性的变化情况如图4．3所示，不同处理CAT活性几乎均呈先增加后下降，然后再增加的趋势；与对照相比，0．20％、0．10％Mo处理均可显著增加烟叶中CAT的活性，且效果比较稳定。在发病初期(接种后第6d)0．20％、0．10％、0．05％、0．02％Mo处理分别比对照增加1．34、o．51、o．34、0．08倍，前三者与对照差异显著；在接种后第lOd(发病盛期)，4个处理依次比对照增加2．41、1．53、0．96、1．27倍，与对照均存在显著差异。说明向烟株补充Mo营养有利于增强烟叶中CAT酶的活性：在一定范围内，烟叶中CAT酶的活性随Mo浓度的增加而增强。2．4Mo素对接种后烟草叶片超氧化物歧化酶活性(SOD)的影响妻呈避’∞萋喜羹蚕们046810接种天数Daysafterinoculation(d)图4．4不同处理对青枯病感病烟株超氧化物歧化酶活性(SOD)的影响Fig．4—4TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofSODininfectedtobaccoplantSOD是植物体内防御活性氧毒性的保护酶，能清除超氧化物阴离子自由基，保护细胞免受损伤，提高植物抗逆性。由图4_4可知，不同处理烟叶中SOD活性基本上均呈递增的趋势，即在一定范围内，青枯病发病越重烟叶中SOD活性越强；在开始发病之后，烟叶中SOD活性出现迅速增加的现象，可能是由于烟草受病原菌的侵染、为害之后，体内活性氧种类突然增多所致，具体机理还有待进一步研究。在发病初期(接种后6d)，0．20％、0．10％、0．05％、0．02％4个Mo处理烟叶中SOD活性分别比对照增加0．76、0．65、0．56、0．46倍，前三者与对照差异显著；在接种后第10d(发病盛期)，4个处理依次比对照增加0．61、0．25、0．26、0．07倍，与对照均差异显著。说明根外补充0．20％Mo营养有利于增强烟叶中SOD酶的活性，提高烟草抵抗青枯病的能力。2．5Mo素对接种后烟草叶片多酚氧化酶活性(PPO)的影响本研究测定了接种后第0(即接种当天)、4、6、8、10d不同Mo素浓度处理后烟叶中PPO的活性，结果显示不同处理烟叶中PPO活性几乎均呈先低后高再降低的趋势，即在一定范围420O0O0笛加垮m5 第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理内，随着青枯病的加重，烟叶中PPO活性先增强后降低；在发病初期(接种后第6d)，与对照相比，0．20％、0．10％、0．05％、0．02％4个处理PPO活性分别比对照增加1．2l、1．00、0．82、0．43倍，均与对照存在显著差异；在发病盛期(接种后第10d)，各处理依次比对照高0．58、0．38、0．29、O．02倍，0．20％、0．10％、0．05％处理均与对照差异显著。说明向烟株补充0．20％Mo营养有利于提高感病烟草叶片中PPO的活性。(图4-5)捌!ig链章蛴盘蚺0接种天数Daysafterinoculation(d)10图4-5不同处理对青枯病感病烟株多酚氧化酶活性(PPO)的影响Fig．4-5TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofPPOininfectedtobaccoplant2．6Mo素对接种后烟草叶片苯丙氨酸解氨酶活性(PAL)的影响掣蝗避减襞裔蜮畦装0468接种天数Daysafterinoculation(d)10图4-6不同处理对青枯病感病烟株苯丙氨酸解氨酶活性(PAL)的影响Fig．4-6TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofPALininfectedtobaccoplant由图4．6可知，不同处理烟叶中队L活性呈先增加后降低再升高的趋势；在发病初期(接43∞O舳加∞如∞如加mr事k．II—g．．．粤f1-扫IA口譬。山厶帅∞帅∞∞∞帅∞o鲫筘∞弘孙苟抑bm，(_≥函．．q．．郇≥一扫!A召3B一《山 西南大学硕士学位论文种后第6d)，0．20％、0．10％、0．05％、0．02％4个处理依次比对照增加0．67、0．58、0．61、0．46倍，且各处理与对照差异显著：在发病盛期(接种后第10d)，各处理分别比对照增加0．45、O．34、0．39、O．4l倍，均与对照存在显著差异。说明增施Mo营养有利于提高感病烟草植株体内PAL酶的活性。2．7Mo素对接种后烟草叶片丙二醛含量(MDA)的影响删缸豁11隈O接种天数Daysafterinoculation(d)810图4—7不同处理对青枯病感病烟株丙二醛(MDA)含量的影响Fig．4—7TheeffectofdifferenttreatmentsonthecontentofMDAininfectedtobaccoplant接种后第0d(即接种当天)、4、6、8、10d不同Mo素浓度处理后烟叶中MDA的含量情况如图4．7所示，高浓度Mo处理可将感病烟株中MDA的含量控制在一定范围内，不会随着青枯病的加重而加重；但是低浓度Mo处理及对照烟叶中MDA的含量均随青枯病病情的加重而上升。在发病初期(接种后第6d)，0．20％、0．10％、0．05％、O．02％4个处理烟草叶片中MDA的含量依次比对照低0．54、0．5l、0．41、0．39倍，各处理均与对照差异显著；在发病盛期(接种后第10d)，各处理分别比对照低0．59、0．5l、0．4l、0．21倍，各处理均与对照差异显著。说明向烟株增施0．05％以上的Mo营养均有利于降低感病烟株体内MDA的含量，且在一定范围内Mo浓度越高效果越明显。3结论与讨论3．1结论通过比较0．20％、O．10％、0．05％、0．02％4个钼素水平处理后感病烟株叶片中可溶性蛋白的含量，过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等防御酶的活性，以及丙二醛(MDA)含量等的变化情况发现，在保证烟株正常生长营养的基础上增施0．20％Mo营养，发病初期，可显著提高感病烟草体内可溶“8642O8642Ol10O0一≥山一文．Io吕吕=口等口oo《Q= 第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理性蛋白的含量以及POD、CAT、PPO的活性，增强SOD和PAL的活性，降低MDA的含量，●依次比对照处理增加1．64、2．62、1．34、1．2l、0．76、0．67倍，降低0．54倍；发病盛期，依次比对照处理上升1．42、1．44、0．61、0．58、0．67倍，降低0．59倍。3．2讨论研究结果证实，以叶面喷雾方式增施0．20％Mo营养可明显提高感病烟株体内部分防御酶的活性，从而巩固其防御机制、增强烟株的抗病性。这与Schwarz等通过系统研究得出的“Mo能提高过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶等防御酶的活性，从而提高植物抵抗病害的能力[87,103-104】：且对部分植物病害发生的严重度存在一定的影响”结果一致。另有研究指出【381，植物的营养水平与其防卫机制密切相关，许多矿质营养对不同作物的健康、不同病原物侵染引起的天然防御反应都有着积极的影响，关于在病原菌存在条件下相关元素怎样改善植物生长发育、降低病害严重度的机制还有待进一步研究。矿质营养对植物抗病机制的影响主要表现在促进植物细胞壁加厚，进而形成对病原菌的机械阻隔和促进植物本身防御机制的表现(主要是促进植物分泌或合成一些抗氧化剂、植保素、黄酮类物质等)两个方面【451。根据本文的研究结果可知，增施Mo营养对烟草青枯病具有较好控制作用的机理可能主要是由于POD可参与吲哚乙酸、酚类化合物的氧化、乙烯的合成等诸多的生理活动，与CAT、SOD共同组成了植物体内的活性氧清除系统，三者相互协同作用可有效清除植物体内活性氧或其它过氧化物、自由基对细胞膜系统的伤害[98,102】；PPO与植物的“伤呼吸”密切相关，可催化醌、单宁的合成——醌和单宁可有效限制病原物的扩展、酚类物质是细胞形成木质素的前体——促进细胞壁的木质化，进而抵抗病原物的侵染[11,98】；PAL可催化苯丙氨酸裂解、与大多数酚类化合物的合成有关，也可参与木质素的合成，从而增加植物细胞壁的厚度、组织木质化的程度，形成病原物入侵寄主植物的机械屏障；同时也与植保素的合成有关【6l】；萜类、酚类、类黄酮等次生物质的代谢情况是诱导化学抗病性的基础，植保素的累积可以增强植物的抑菌和对毒素的降解作用【1叭】。因此，Mo营养与烟草抗青枯病特性间一定存在着密切的关系，摸清病原物、寄主植物(烟草)与Mo营养三者之间的关系对从营养调控方面着手解决茄科类植物青枯病防控难的问题具有重要意义。45 西南大学硕士学位论文第2节Ca、B、Mg、Mo4种元素影响烟草抗青枯病的生理生化机理不同的矿质元素在植物体内的作用各不相同。根据本论文第二、三章的研究结果可知，Mo、Ca营养与烟草抗青枯病之间一定存在着相互关系，且摸清青枯雷尔氏菌、烟草与Mo或Ca营养三者之间的关系对从营养调控方面着手解决茄科类植物青枯病防控难的问题具有重要意义。因此，本节比较了Ca、B、Mg、Mo4种元素影响烟草抗青枯病的生理生化机理之间的差异，旨在为从营养．病理学角度、从增强作物自身抗病特性层面解决茄科类青枯病防控难的问题提供科学的理论依据。l材料与方法1．1供试材料1．1．1供试烟草品种·同第三章第1节1．1．1部分。1．1．2供试病原菌同第三章第1节1．1．2部分。1．1．3供试矿质营养同第三章第1节1．1．4部分。1．1．4仪器同本章第1节1．1．4部分。1．2试验设计同第三章第1节1．2．1部分。1．3接种处理后烟草叶片中防御酶系指标、丙二醛含量的测定同本章第1节1．3．1．7部分。1．4数据处理采用Excel2003对试验数据进行基本处理，计算出各相关防御酶的活性，然后采用SPSS16．0统计软件Duncan法比较分析相关数据在显著性水平为O．05时的差异。2结果与分析2．1Ca、B、Mg、Mo对接种后烟草叶片q】n--j-溶性蛋白含量的影响可溶性蛋白含量是反映植物总代谢的一个重要指标。本研究测定了接种后第2、6、8、10 第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理d不同元素处理后感病烟草叶片中可溶性蛋白的含量，结果显示不同处理烟草叶片中可溶性蛋白的含量均呈现先增加后降低的趋势；在处理区烟草未出现青枯病典型萎蔫症状之前(接种后第2d)，不同处理烟草叶片中可溶性蛋白的含量最低：在处理区烟草出现典型的萎蔫症状后(发病初期)，不同处理烟草叶片中可溶性蛋白的含量达到测定时间范围内的最高点，此时Ca、B、Mg、Mo4种元素处理后烟草叶片中可溶性蛋白的含量依次比对照高1．39、O．50、0．79、2．25倍，均与对照存在显著差异：在接种后10d(发病盛期)，4种元素处理依次比对照增加0．73、0．34、0．3l、0．95倍，与对照差异显著。说明向烟株补充适量Ca、B、Mg、Mo4种元素均可提高烟株体内可溶性蛋白的含量，Mo处理效果最明显。(图4．8)蚓毒瞪．口嘲掣涎宫268接种后天数Daysafterinoculation(d)10图4．8不同处理对青枯病感病烟株可溶性蛋白含量的影响Fig．4—8Theeffectofdifferenttreatmentsonsolubleproteincontentininfectedtobaccoplant注：柱图上的误差线表示标准偏差，n=3；不同字母表示PS0．05水平下差异显著(Duncan)。下同。Note：Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovebargraph，n=3；DifferentlettersmeantsignificantdifferenceatPS0．05levelbyDuncan．Thesamebelow．2．2Ca、B、Mg、Mo对接种后烟草叶片过氧化物酶活性(POD)的影响POD与CAT、SOD共同组成了植物体内活性氧类清除酶系统，在植物抵抗病原物的侵染、为害过程中发挥着重要的作用。本研究通过测定接种后第2、6、8、10d不同元素处理后感病烟草叶片中POD酶的活性发现，随青枯病的扩展、蔓延，不同元素处理烟草叶片中POD的活性几乎均呈逐渐上升的趋势，这可能与青枯病侵入烟草之后产生大量的活性氧类或自由基等有毒物质有关；在发病初期(接种后第6d)，Ca、B、Mg、Mo4种元素处理烟草体内POD活性依次比对照增加1．26、1．09、1．12、3．11倍，均与对照差异显著：在接种后第10d(发病盛期)，各元素分别比对照增加0．71、O．4l、0．36、O．98倍，各处理与对照差异显著。说明Ca、B、Mg、Mo4种矿质营养均能不同程度地促进青枯病感病烟草体内POD酶的表达，Mo处理效果最明显。(图4．9)47642O8642O(_萝，．暑．锄暑一_喜卫口8口歪。基。一ojl0∞ 西南大学硕士学位论文掣蜒溢霉鼍球蜊26810接种天数Daysafterinoculation(d)图4-9不同处理对青枯病感病烟株过氧化物酶(POD)活性的影响Fig．4-9TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofPODininfectedtobaccoplant2．3Ca、B、Mg、Mo对接种后烟草叶片过氧化氢酶(CAT)活性的影响掣烬档蛹Slfif捌268接种天数Daysafterinoculation(d)10图4．10不同处理对青枯病感病烟株过氧化氢酶活性(CAT)的影响Fig．4-10TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofCATininfectedtobaccoplantCAT可将对植物有害的H202催化分解为H20和02，在植物抗病过程中扮演着重要的角色。本研究测定接种后第2、6、8、10d不同元素处理后感病烟草叶片中CAT的活性结果显示，各处理烟草叶片中CAT活性呈递增的趋势，即在一定范围内随着青枯病的扩展，烟草体内CAT活性越高(图4．10)。在发病初期(接种后6d)，Ca、B、Mg、Mo4种元素处理烟株体内CAT活性依次比对照高0．73、0．10、O．50、1．10倍，除B处理外，其余处理与对照差异显∞O钙们弱如笱加：2m5一是r山I-II一．【II．I-龇．fl一扫一≯口u两Qo山98765432●0爹，’Ⅲm．I-兰室蕊卜舌 第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理著；在接种后第10d(发病盛期)，各处理分别比对照高0．68、0．29、0．60、0．96倍，均与对照差异显著。说明向烟株补充Ca、B、Mg、Mo4种元素可提高其体内的CAT活性，补充Mo营养效果最明显。2．4Ca、B、Mg、Mo对接种后烟草叶片超氧化物歧化酶活性(SOD)的影响SOD是植物体内活性氧类清除系统的成员之一，在植物的抗病过程中起着重要的作用。由图4．11可知，不同处理烟草叶片中SOD活性，除Mo处理呈先增加后降低再上升的趋势外，其余处理均呈先上升后降低的趋势。在接种后第6d(发病初期)，Ca、B、Mg、Mo4种元素处里烟草叶片中SOD活性分别比对照增加0．90、0．43、O．24、O．82倍，均与对照差异显著；在发病盛期(接种后第10d)，各处理分别比对照增加0．99、O．37、O．45、0．85倍，均与对照存在显著差异。说明向烟株补充Mo、Ca营养可显著提高感病烟草叶片中SOD活性。26810接种天数Daysafterinoculation(d)图4—11不同处理对青枯病感病烟株超氧化物歧化酶活性(SOD)的影响Fig．4-11TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofSODininfectedtobaccoplant2．5Ca、B、Mg、Mo对接种后烟草叶片多酚氧化酶活性(PPO)的影响PPO可参与植物体内醌和酚类物质的合成，在植物细胞壁的加厚、巩固植物的天然防御反应中起着重要的作用。本研究测定接种后第2、6、8、10d不同元素处理后感病烟草叶片中PPO的活性发现，不同处理烟草叶片中PPO活性几乎均呈逐渐递增的趋势(图4．12)。在接种后第6d(发病初期)，Ca、B、Mg、Mo4种元素处理后烟草叶片中PPO的活性分别比对照增加1．00、0．26、0．07、1．68倍；在接种后第10d(发病盛期)，各处理烟草叶片中PPO活性依次比对照高1．09、0．40、0．35、1．34倍，各处理与对照均存在显著差异。说明向烟株补充Ca、B、Mg、Mo4种元素均可增加其体内PPO的活性，Mo处理效果最佳，其次为Ca处理。49O0O蜀O5O5O5O5432l1(．≥‰．．咩3-扫IA景爵Qo∞掣烬滋甚警S甚1毒靶 西南大学硕士学位论文掣烬避基师鑫蚺26810接种天数Daysafterinoculation(d)图4-12不同处理对青枯病感病烟株多酚氧化酶活性(PPO)的影响Fig．4-12TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofPPOininfectedtobaccoplant2．6Ca、B、Mg、Mo对接种后烟草叶片苯丙氨酸解氨酶活性(PAL)的影响型!ig龆膝饕涮膝窿将30002500200015001000500O268接种天数Daysafterinoculation(d)10图4．13不同处理对青枯病感病烟株苯丙氨酸解氨酶活性(PAL)的影响Fig．4-13TheeffectofdifferenttreatmentsontheactivityofPALininfectedtobaccoplantPAL在植物体抗病过程中所起的作用与PPO相似，主要是加厚细胞壁，对病原菌的侵染形成机械阻隔。接种后第2、6、8、10d不同元素处理后感病烟草叶片中PAL的活性如图4．13所示，不同处理烟草叶片中PAL活性变化趋势不尽相同，Ca、Mg呈先降低后上升再降低的趋势，B呈递减的趋势，Mo呈先增加后降低再上升的趋势。关于不同元素处理后对PAL活性造成的不同趋势的变化还有待进一步研究。在发病初期(接种后第6d)，Ca、B、Mg、Mo4种元素处理烟草叶片中PAL活性分别比对照增加0．33、0．30、0．19、0．60倍，与对照差异显著；50O0O伽枷抛咖渤伽枷姗。爹‰I．II!g．了嚣．j一蚤苓召譬。山厶(．≥‰．q．。郇3v扫}A疆3B一《钆 第四章矿质营养Mo影响烟草抗青枯病的生理生化机理在接种后第10d(发病盛期)，各处理分别比对照增加o．28、0．25、0．22、0．56倍，与对照差是显著。说明向烟株补充Ca、B、Mg、Mo4种元素，在一定程度上，均可提高其体内PAL活性，以Mo处理效果最明显。2．7Ca、B、Mg、Mo对接种后烟草叶片丙二醛含量(MDA)的影响MDA是反映植物细胞膜受损伤程度的一个重要指标，在植物抗病特性中起着重要的作用。接种后第2、6、8、10d不同元素处理后感病烟草叶片中MDA的含量变化情况如图4．14所示，不同处理烟草叶片中MDA含量几乎均呈现先增加后下降的趋势。在接种后第6d(发病初期)，Ca、B、Mg、Mo4种供试元素处理烟草叶片中MDA含量分别比对照低0．26、O．06、O．13、0．50倍，除B处理外，其余处理与对照均存在显著差异：在接种后第10d(发病盛期)，各处理分别比对照低0．34、0．09、O．20、0．41倍，除B处理外，其余处理与对照差异显著。说明向烟株补充适量的Mo营养可较好地降低其体内细胞膜受病原菌损害的程度。接种天数Daysaiterinoculation(d)10图4．14不同处理对青枯病感病烟株丙二醛(MDA)含量的影响Fig．4-14TheeffectofdifferenttreatmentsonthecontentofMDAininfectedtobaccoplant3结论与讨论3．1结论通过比较Ca、B、Mg、Mo4种矿质营养处理后感病烟株叶片中可溶性蛋白的含量，过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等防御酶的活性，以及丙二醛含量等的变化情况发现，在保证烟株正常生长营养的基础上再增施0．20％Mo或Ca矿质营养，发病初期，可显著提高感染青枯病烟株体内可溶性蛋白的含量以及POD、CAT、SOD、PPO、PAL的活性，依次比对照处理增加2．25、3．11、1．10、0．82、1．68、0．60倍和1．39、1．26、0．73、0．90、1．00、0．32倍：可显著降低MDA的含量，分别降低0．50倍和0．26倍；发病盛期，依次比对照处理上升0．95、0．98、0．96、0．85、1．34、O．56和0．73、0．71、O．68、0．99、1．09、0．28倍，分别下降0．41和0．34倍。51O5O5O5O32l0O一事皿．．锄．Iogg—Iuo荟ou《Q窆删姐斑¨窿 西南大学硕士学位论文3．2讨论●研究结果证实增施0．20％(w／v)(NH4)6M07024·4H20或CaN206"4H20可明显提高感病烟株叶片中可溶性蛋白的含量，明显增强POD、CAT、SOD、PPO等防御酶的活性，从而巩固其防御机制、提高烟株抗青枯病的特性。这与Jiang等研究得出的补充钙营养可提高植物体内过氧化物酶和多酚氧化酶的活性【621，以及Schwarz等研究指出的补充钼营养可提高植物体内过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶等防御酶的活一陛tS7,103-104]，结果一致。关于调控植物Mo或Ca营养，可明显增强植物体内可溶性蛋白的含量，显著提高POD、CAT、SOD、PPO、PAL等防御酶的活性，降低丙二醛的含量，从而从生理生化途径方面增强烟株抵抗青枯病的原因可能是由于POD可参与吲哚乙酸、酚类化合物的氧化、乙烯的合成等诸多的生理活动，与CAT、SOD共同组成了植物体内的活性氧清除系统，三者相互协同作用可有效清除植物体内活性氧或其它过氧化物、自由基对细胞膜系统的伤害【98’102】；PPO与植物的“伤呼吸”密切相关，可催化醌、单宁的合成——醌和单宁可有效限制病原物的扩展、酚类物质是细胞形成木质素的前体——促进细胞壁的木质化，进而抵抗病原物的侵染[i1,981；PAL可催化苯丙氨酸裂解、与大多数酚类化合物的合成有关，也可参与木质素的合成，从而增加植物细胞壁的厚度、组织木质化的程度，形成病原物入侵寄主植物的机械屏障；同时也与植保素的合成有关【6l】；酚类、萜类、类黄酮等次生物质代谢是诱导化学抗病性的基础，植保素的累积可以增强植物的抑菌和对毒素的降解作用【l01j。52 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果不同作物对不同的养分具有特定的选择性吸收规律，特别是对某些中、微量元素有着特殊需求，而部分植烟区长期种植单一品种、施用化肥，己严重导致土壤营养失衡、土壤抑病效果降低等连作障碍问题的不断出现，从而也加重了以青枯病为代表的土传病害的发生[5,72,109-112]。只有保证植物营养平衡，才能使其抗病特性得到最佳的发挥‘38M83’1351。因此，烟草的营养状况与青枯病的发生之间可能存在着一定的相互关系，且本论文第三章(室内试验部分)已初步证明根外补充部分矿质营养可促进烟草抗青枯病特性的表现。对此，本章比较了Ca、B、Mg、M04种元素以及Mo素不同用量和不同施用方式对烟草青枯病田间控病效果的差异，旨在进一步验证第三章的试验结果，同时也进一步证明矿质营养与烟草抗病性之间存在相互关系，向烟株补充部分矿质营养，可促进其抗病特性的表达。第1节Ca、B、Mg、Mo4种元素对烟草青枯病的田间控病效果目前，在烟草上，青枯病已成为其生产可持续生产的瓶颈，且尚无特效的解决措施【l悼1161。大量研究指出【41117-112],增施部分烟草必需营养元素可增强作物的抗病、抗逆性，提高作物产量、品质：矿质营养调控是化学防治方法的补充，是控制植物病的有效措施之一；对一些无较好化学防治方法的植物病害，调节矿质营养可能是一条值得探讨的新途径。对此，在室内试验的基础上，本文选择性地向烟草根外补充Ca、Mg、B、Mo等中微量元素进行田间验证试验，通过调查试验地青枯病发生情况、烟草农艺性状、烟草生育期等指标，统计分析比较4种矿质营养对烟草青枯病的田间控病效果，以期为进一步探究矿质营养与烟草青枯病的关系奠定基础，为烟叶生产的可持续发展提供技术保障。1材料与方法1．1试验材料1．1．1试验地情况试验于2012年在重庆市黔江区新华乡大田村二组和水市乡烟科所两地进行，面积均为1000m2，为多年连作、青枯病发生严重地块。海拔750m、1172m；经度108036’E、108042，E，纬度：29。19’N、29。13’N。地势较平坦，黄壤、砂壤，pH5．03、6．00，碱解氮98．40、61．44m眺g，速效磷45．64、36．80mg／kg，速效钾103．88、165．319mg／l【g，有机质18．68、13．35g&g。有灌溉条件，光照条件较好。冬耕冬炕深耕细耙，土壤均匀疏松，垄高30cm，垄体饱满，行株距为120cm×55cm、110cm×50cm。1．1．2栽培情况试验地栽培情况：试验所用烟苗均采用漂浮育苗，各小区均按相关技术标准进行统一大53 西南大学硕士学位论文田管理，中心花开放打顶，用12．5％氟节胺EC抑芽剂控制腋芽。新华试验地烟苗移栽时间为5月8日，6月30日打顶第一次打顶，7月15日第一次采烤：水市烟科所试验地烟苗移栽时间为5月17日，7月26日打顶，8月1日第一次采烤。1．1．3供试烤烟品种云烟87品种(黔江新华试验地)，当地主栽品种，云南省烟草科学研究所、中国烟草育种研究(南方)中心以云烟二号为母本，K326为父本杂交选育而成‘1231。南江3号(黔江水市烟科所试验地)，当地主栽品种，从红花大金元品种中获得的自然变异株，经系统选择培育而成‘1241。1．1．4供试矿质营养原材料硝酸钙(CaN206-4H20)、硼砂(H3803)、硫酸镁(MgS04-7H20)、钼酸铵((NH4)6M07024·4H20)等均为分析纯(AR)，试验过程中采用当地浇灌所用的自来水将其溶解到相应浓度。1．1．5仪器GPS定位仪，北京合众思壮股份有限公司。TFC一203PCB型智能土肥养分测试仪，北京强盛分析仪器制造中心。土壤pn值快速检测仪，杭州托普仪器有限公司生产。1．2试验设计试验共设5个处理，各3次重复，共15个小区，采用完全随机区组设计，各小区面积为0．1亩，栽烟100株，行株距均为120cm×55cm，四周设有保护行。处理1：全株均匀喷施0．20％(、)I，／v，下同)的硝酸钙溶液；处理2：全株均匀喷施0．20％的硼砂溶液；处理3：全株均匀喷施1．0％的硫酸镁溶液：处理4：全株均匀喷施0．20％铝酸铵溶液；处理5(对照)：清水处理，常规栽培。黔江新华试验地处理时间为：烟苗成活后(移栽后大约14d)、团棵期(零星发病时，移栽后45d左右)、旺长期(移栽后55d左右)，整个烟草生育期共处理3次；黔江水市烟科所试验地处理时间为：团棵期(零星发病时，移栽后45d左右)、旺长期(移栽后55d左右)；整个生育期共处理2次。1．3调查内容及方法1．3．1烟株青枯病发病情况调查按GB／23222．2008《烟草病虫害分级及调查方法》国家标准，采用5点取样方法，每点固定调查10株，在烟草青枯病零星发生时(团棵期)，调查各处理青枯病发病情况，以后每隔7-10d调查一次，并根据第三章第1节1．3室内青枯病发病情况调查部分的(1)、(2)、(3)公式分别计算各处理发病率、病情指数和控病效果。1．3．2烟草生育期调查按YC／T142．1998《烟草农艺性状调查方法》标准，对试验区各处理烟草生育期，主要包括移栽期、团棵期、现蕾期、初烤采收期等进行调查，并记录。1．3．3烟株农艺性状调查按YC／T142．1998《烟草农艺性状调查方法》标准，分别在团棵期、打顶后7d，每小区取 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果5点，每点调查3株，测量各处理烟株株高、最大叶长、最大叶宽、茎围、有效叶片数等农艺指标，并根据公式(5)计算最大叶面积。叶面积(cm2)=0．6345×(叶长×叶宽)(5)1．4数据处理试验数据统一采用Excel进行基本处理，计算出发病率、病情指数及相对防效，然后采用SPSS16．0统计软件比较分析相关数据在显著性水平为0．05时的差异。2结果与分析2．14种中微量元素对烟草青枯病田间发病情况的影响2．1．14种中微量元素处理后烟草青枯病田间发病率比较钙、硼、镁、钼4种中微量元素对烟草青枯病发病率有着不同程度的影响影响(图5．1)。从图5．1I可明显看出，黔江新华试验点，试验期间对烟草青枯病发病情况共进行了4次调查，4次调查均以对照发病率最高，且方差分析表明钙、硼、镁、钼等4种中微量元素处理与对照处理青枯病发病率差异显著。在4种中微量元素处理中，以钼素处理发病率最低；方差分析表明，与钙素处理差异不显著，与镁和硼素处理差异显著；末次调查结果显示，钙素、硼素、镁素、钼素处理青枯病发病率依次分别比对照少18．83％、11．06％、9．92％、25．17％。说明，在一定程度上，4种供试元素处理对烟草青枯病的发生流行、扩展均具有一定的控制作用，尤其是Ca、Mo调控处理。邑8矗蔼．暑Q基．璺凸祷惧裂查时间55加∞踟∞加0 西南大学硕士学位论文查时间处理前第1次处理后7d第2次处理后7d第2次处理后14d第2次处理后21d图5．14种中微量元素处理后烟草青枯病田间发病率比较Fig．5．1Comparisonofdifferenttreatmentsonincidenceoftobaccobacterialwiltinthefield注：图I、II依次为黔江新华试验地、水市乡烟科所试验地处理区烟草青枯病发病率变化情况。折线图上的误差线表示标准偏差，n=3：不同字母表示PS0．05水平下差异显著(Duncan)；下同。Note：Fig．5一lIandIIaretheincidencedynamicsoftobaccobacterialwiltatQianjiangXinhuaandShuishiresearchsites，respectively．Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovelineorbargraph，n=3；Differentlettersmeantsignificantdifferenceat0．05levelbyDuncan；Thesamebelow．从图5．1II可知，黔江水市乡烟科所试验点，处理前不同处理与对照CK的青枯病病情指数差异不显著，处理后对照CK青枯病病情指数一直最高，不同处理与其存在显著性差异；4种中微量元素调控处理中，钙、钼元素调控处理青枯病病情指数相对最低，相互间无显著差异，与对照CK差异显著；末次调查结果显示，钙、钼处理青枯病病情指数依次分别比对照低23．61、21．67。说明4种中微量元素调控对烟草青枯病严重度均有一定的缓解作用，以钙、钼元素处理最好。2．1．24种中微量元素处理后烟草青枯病田间病情指数比较钙、镁、硼、钼等4种中微量元素调控对烟草青枯病病情指数的影响如图5．2所示。从图5．2I可明显看出，黔江新华试验点，在4次病害调查中，对照的病情指数一直最高，方差分析表明，钙、硼、镁、钼素处理与对照差异显著。在4种中微量元素调控中，以铝素处理最好，其次为钙素，方差分析表明，两者差异不显著，与镁素和硼素处理差异显著。末次调查结果显示，4种中微量元素调控处理青枯病的病情指数依次分别比对照少19．07、9．74、10．28、20．06。从图5．2II可知，黔江水市乡烟科所试验地，处理前不同处理与对照CK的青枯病病情指数差异不显著，处理后对照CK青枯病病情指数一直最高，不同处理与其存在显著差异；4种中微量元素调控处理中，钙、钼元素调控处理青枯病病情指数相对最低，相互间无显著性差异，与对照CK差异显著；末次调查结果显示，钙、钼处理青枯病病情指数依次分别比对照低23．61、21．67。说明4种中微量元素调控对烟草青枯病严重度均有一定的缓解作用，以钙、钼元素处理最好。56舳加印如∞如加m0^摹-89pI。u石器譬IQ解倏越 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果卷暑Q基．璺。籁靼磐倏6．227一107．20查时间处理前第1X处理后7d第2次处理后7d第2次处理后14d第2次处理后21d图5．24种中微量元素处理后烟草青枯病田间病情指数比较Fig．5—2Comparisonofdifferent仃eatmentsonindexoftobaccobacterialwiltinthefield注：图I、II依次为黔江新华试验点、水市乡烟科所试验点处理区烟草青枯病病情指数变化情况。Note：Fig．IandIIaretheindexdynamicsoftobaccobacterialwiltatQianjiangXinhuaandShuishiresearchsites，respectively．2．24种中微量元素对烟草青枯病的田间控病效果4种中微量元素调控对烟草青枯病的控病效果如图5．3所示。从图5．3I可明显看出，黔江新华试验点，钙素和钼素处理对青枯病的控病效果不显著，镁素和硼素对青枯病的控病效果差异不明显。试验期间，钙、硼、镁、铝等4种中微量元素对青枯病的控病效果分别为42．91％～62．57％、29．29％"43．05％、22．17％～41．56％、45．28％～62．17％。从图5．3II可知，黔江水市乡烟科所试验点，钙、钼元素调控处理对青枯病的控病效果相对较好，相互间差异不明显，试验期间，对青枯病的控病效果依次分别为48．36％～61．56％、48．03％～62．23％；硼、镁元素57如钙如孙如筋加bm，O器≈II!Q∞8∞IQ籁靼逛惧如筋加bm，O 西南大学硕士学位论文调控处理对青枯病的控病效果分别为39．58％一--47．54％、35．01％～45．72％，前期两者差异不显著，中后期两者差异显著，与钙、钼元素调控处理差异显著。说明根外增施钙素和钼素对烟草青枯病有相对较好的控制作用。6．227．20调查时间第1次处理后7d第2次处理后7d第2次处理后14d第2次处理后21d图5．34种中微量元素对烟草青枯病的田间控病效果Fig．5·3Controlefficaciesofdifferenttreatmentsontobaccobacterialwiltinthefield注：图I、II依次为黔江新华试验点、水市乡烟科所试验点处理区不同处理对烟草青枯病的田间控病效果；柱图上的误差线表示标准偏差，n=3；不同字母表示P10．05水平下差异显著(Duncan)。Note：Fig．IandIIarethecontrolefficaciesofdifferenttreatmentsontobaccobacterialwiltatQianjiangXinhuaandShuishiresearchsites，respectively．Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovebargraph，n=3；Differentlettersmeantsignificantdifferenceat0．05levelbyDuncan．2．34种中微量元素对烟草田间生育期的影响足够的营养是烟株正常生长的必备条件，在烟株正常生长发育所必需的16种营养元素中，任何一种元素缺乏，都会对烟草的生长发育、产质造成严重的威胁【119】。从表5．1可以看出，在黔江新华试验点，各处理烟草进入团棵期的时间比对照早2．4d，50％烟株出现花蕾的时间比对照早1．2d，三片脚叶成熟的时间较对照早2．3d，其中以钙素和钼素喷雾处理进入团棵、现蕾、成熟期最早。在水市烟科所试验点，试验于团棵期、旺长期处理，各处理烟草50％烟58加∞如∞如加mO^更一h§疆3Io扫IIou眯较惧辍加∞如柏如加m0^摹v分8uJo—o扫IIou眯j；if惧辍 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果株出现花蕾的时间比对照晚1．3d，三片脚叶成熟的时间比对照晚1．3d。田间调查发现，钙、硼、镁、钼4种元素处理后，烟株田间长势、整齐度、叶色均比对照CK强、整齐、绿，说明根外增施钙、硼、镁、铝等叶面肥对烟株的生长发育均具有一定的促进作用。说明根外增施钙、硼、镁、钼等叶面肥对烟株的生长发育具一定的促进作用，可能更有利于烟草的健康茁壮生长、提前进入各生育阶段，尤其是增施钙和钼营养。表5．1不同处理对烟草生育期的影响Table4-lEffectofdifferenttreatmentsontobaccogrowthperiod2．44种中微量元素处理对烟草田间农艺性状的影响2．4．14种中微量元素处理对烟草移栽后45d农艺性状的影响表5．2不同处理对烟草移栽后45d农艺性状的影响Table5-2Effectofdifferenttreatmentsontobaccoagronomicalcharacter45daysaftertransplanting注：同一列数字后小写字母表示处理间P50．05时的显著性差异。下同。Note：DifferentsmalllettersabovethebarmeantsignificantdifferenceatPSO．05．respectively．Thesamebelow由于水市乡烟科所试验地处理初始时间为团棵期，所以仅对其进行了打顶后7d(移栽后75d)农艺性状调查。不同营养元素在烟株体内的功能各不相同，对烟株的生长发育影响各异。黔江新华试验点，ca、B、Mg、Mo等4种中微量元素调控对烟草移栽后45d农艺性状的影响如表5-2所示。从表中数据可明显看出，中微量元素处理后烟草的株高、最大叶长、最大叶宽、茎围、有效叶片数、最大叶叶面积等农艺指标均比对照(清水处理)好，其中株高、最大叶宽以钼素处理最好，比对照多2．84cm、3．15cm；方差分析表明，与钙素处理差异不显著，与镁、59 西南大学硕士学位论文硼、对照处理差异显著。最大叶长、有效叶片数、最大叶叶面积等指标以钙素处理最好，比对照多4．18era、0．66片、141．5Icm2；方差分析表明，与钼素处理差异不显著，与镁、硼、对照处理差异显著。茎围指标，钙素和钼素处理相同，与硼素处理和对照差异显著。说明，在一定程度上，钙素和钼素处理在供试中微量元素中更有利于烟草各农艺指标的优化、烟株的生长发育。2．4．24种中微量元素处理对烟草移栽后75d农艺性状的影响表5．3不同处理对烟草栽后75d农艺性状的影响Table5-3Effectofdifferenttreatmentsontobaccoagronomicalcharacter75daysaftertransplanting中微量元素调控对烟草移栽后75d农艺性状的影响如表5．3所示。从表中数据可明显看出，黔江新华试验点，茎围指标以钼素处理最好，比对照多1．31cm；方差分析表明，与钙素处理差异不显著、与镁、硼、对照处理差异显著。株高、最大叶长、最大叶宽、有效叶片数、最大叶叶面积等指标均以钙素处理最好，分别比对照多13．52cm、5．32cm、4．46cm、1．24片、260．55cm2；方差分析表明，除有效叶片数仅与对照差异显著外，其余各指标均与镁、硼、对照处理差异显著，与钼素处理不显著。黔江水市乡烟科所试验点，处理区各农艺指标均比对照区好；其中株高、有效叶片数以钙素处理相对最好，分别比对照多25．15cm、2．45片，与对照CK差异显著；最大叶长、最大叶宽、茎围、最大叶面积以钼素处理相对最好，依次分别比对照多8．13cm、2．52cm、1．25cm、26．14cm2，与对照差异显著。说明叶面喷施钙、硼、镁、钼4种中微量元素对烟草移栽后75d的生长均有一定促进作用，以钙、钼素处理相对较好，尤其是钼素。3结论与讨论3．1结论研究结果显示，根外增施钙、硼、镁、钼4种中微量元素可使烟草提前l～4d进入各生育阶段，对株高、最大叶长和宽、茎围等农艺指标均有一定的促进作用，以钙、钼处理最好：对青枯病发病情况的影响方面，4种中微量元素均呈现一定的抑制作用，以钙、铝处理最好， 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果试验期间，两者病情指数依次分别为1．44"-'25．29、1．44"～24．30(新华试验点)和1．38～11．45、1．43"--"12．53(水市乡烟科所试验点)，分别比对照少1．39～19．07、1．39～20．06和0．23～13．61、0．18～12．53。两者对青枯病的控病效果依次分别为42．91％～62．57％、45．28％～62．17％(新华试验点)和48．36％～61．56％、48．03％～62．23％(水市乡烟科所试验点)。3．2讨论本研究田间试验结果表明，向烟草补充Mo、Ca矿质元素，可增强烟草对青枯病的抵抗能力，对烟草青枯病具有较好的控制作用；试验期间，两处理对青枯病的控病效果最高可达65．52％和62．57％，发病后期控病效果为49．46％和46．80％；对烟草株高、最大叶宽、茎围、最大叶面积等农艺指标均具有积极的效应。其原因可能是由于钙是植物细胞壁间中果胶钙的成分，与细胞分裂有关，具有稳定生物膜的作用，有利于植物愈伤组织形成，对植物抗病有一定的作用【5¨l】；钼是硝酸还原酶的必需成分，也是固氮酶中的钼铁蛋白的组分，钼在植物氮代谢中其重要作用【97’l叫；对烟草的氮素营养及提高烟叶中叶绿素的含量和稳定性、增强其光合作用、促进烟株体内碳水化合物的合成转移起着重要作用【10¨07’125】；能增大烟株株高、单叶重、叶面积系数，促进烟草体内总糖、蛋白质以及氮的合成，较好地协调糖碱比，提高烟叶的香气质量，改善烟叶的香吃味[105,108,125】；钙在植株生长、干物质产量方面扮演着重要的角刨引’12纠271。此外，本文第二章通过测定、分析采自重庆黔江植烟区的177份烟株根际土壤样品营养状况已发现，随着植烟土壤的不断连作，土壤酸化、根际营养失衡等连作障碍问题越严重：健康烟株根际土壤中交换性钙、有效硼、有效钼等矿质营养的含量显著低于青枯病发病烟株根际土壤；土壤中有效钼、交换性钙的含量可能是影响青枯病发生最关键的土壤营养因子。综上可知，Mo、Ca营养与烟草青枯病之间存在着密切的关系。本研究通过在青枯病发病重的烟田的烟株上喷施Mo、Ca可达到补充这两种元素的目的，对发病较重区域提供了一个重要的防控措施。钙、钼元素在烟株体内的具体作用及功能还有待进一步研究，摸清钙和钼元素、烟草以及青枯雷尔氏菌之间的关系，对从营养学角度解决青枯病防控难的问题将具有重要的意义。6l 西南大学硕士学位论文第2节钼素不同用量对烟草青枯病的田间控病效果钼虽然是烟草必需的微量元素之一，烟草在生长过程中对其吸收量很低，但根据利比希最小因子定律——植物生长的好坏取决于相对有效程度最低的那种营养物质的供给水平。对此，结合本论文第二、三章以及本章第1节的研究结果，本节设置了0．20％、0．10％、0．05％、0．02％4个钼营养浓度进行田间小区试验，通过调查试验地青枯病发生隋况、烟草农艺性状、烟草生育期，统计分析比较不同钼素浓度处理对烟草青枯病的田间控病效果，旨在进一步明确钼素在烟草上的最佳用量、钼素诱导烟草抗青枯病的效果，为进一步深入研究奠定基础。1材料与方法1．1试验材料1．1．1试验地情况同本章第1节1．1．1部分。1．1．2栽培情况同本章第1节1．1．2部分。1．1．3供试烤烟品种同本章第1节1．1．3部分。1．1．4供试矿质营养供试营养元素Mo原材料为钼酸铵((NH4)6M07024·4H20)(AR)，金堆城钼业股份有限公司化学分公司生产。试验过程中采用自来水将其溶解到试验所需浓度。1．1．5仪器同本章第1节1．1．5部分。1．2试验设计试验共设5个处理，各3次重复，共15个小区，采用完全随机区组设计，各小区面积为0．1亩，栽烟100株，行株距均为120cmX55cm，四周设有保护行。处理l—4依次为：全株均匀喷施0．20％(、)l，／V，下同)、0．10％、0．05％、0．02％0m4)6M07024·4H20溶液；处理5(对照)：清水处理，常规栽培。黔江新华试验地处理时间为：烟苗成活后(移栽后大约14d)、团棵期(零星发病时，移栽后45d左右)、旺长期(移栽后55d左右)，整个烟草生育期共处理3次：黔江水市乡烟科所试验地处理时间为：团棵期(零星发病时，移栽后45d左右)、旺长期(移栽后55d左右)；整个生育期处理2次。l-3调查内容及方法1．3．1烟株青枯病发病情况调查同本章第1节1．3．1部分。1．3．2烟草生育期调查62 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果同本章第1节1．3．2部分。1．3．3烟株农艺性状调查同本章第1节1．3．3部分。1．4数据处理试验数据统一采用Excel进行基本处理，计算出发病率、病情指数及相对防效，然后采用SPSSl6．0统计软件比较分析相关数据在显著性水平为0．05时的差异。2结果与分析2．1不同浓度钼营养对烟草青枯病田间发病情况的影响2．1．1不同浓度钼营养处理后烟草青枯病田间发病率的比较在重庆市黔江区新华烟草基地试验期间，共进行了5次青枯病发病情况调查，浓度分别为0．20％、0．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵处理对烟草青枯病田间发病率的影响如图5_4I所示。在5个处理中，对照CK青枯病的发病率最高，0．20％钼酸铵叶面喷雾处理青枯病的发病率最低，两者相差17．21～30．18％，方差分析表明两者间差异显著；其次为0．10％钼酸铵叶面喷雾处理，比对照CK低16．47～29．50％，方差分析表明与0．20％钼酸铵处理差异不显著，与对照CK差异显著。说明增施铝营养具有延缓青枯病蔓延的趋势，以0．20％钼酸铵叶面喷雾处理效果最好。63∞如舳加印如∞如加mO^摹一88屯13口．}o％譬IQ瓣惧越 西南大学硕士学位论文§、-，8g蔼．宣。嚣．璺。槲懊《查时间处理前第1次处理后7d第2次处理后7d第2次处理后14d第2次处理后21d图5-4不同浓度钼素处理后烟草青枯病田间发病率比较Fig．5．4Comparisonofdifferenttreatmentsonincidenceoftobaccobacterialwiltinthefield注t图I、II依次为黔江新华试验点、水市乡烟科所试验点处理区烟草青枯病发病率变化情况。折线图上的误差线表示标准偏差，n-3；不同字母表示PS0．05水平下差异显著(Duncan)；下同。Note：Fig．5-4IandIIaretheincidencedynamicsoftobaccobacterialwiltatQianjiangXinhuaandShuishiresearchsites，respectively．Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovelineorbargraph，n=3；Differentlettersmeantsignificantdifferenceat0．05levelbyDuncan；Thesanlebelow．在重庆市黔江区水市乡烟科所试验如图54II所示。试验于团棵期、旺长期处理两次，试验期间，共进行了5次青枯病发病情况调查，浓度分别为0．20％、0．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵处理对烟草青枯病田间发病率有着不同程度的影响。调查结果显示，处理前0．10％处理青枯病发病率稍偏低，与对照差异不显著，与其余处理差异显著；在处理后的4次病害调查中，对照CK青枯病的发病率一直最高，0．20％钼酸铵叶面喷雾处理青枯病的发病率最低，两者相差18．13一-26．03％，方差分析表明两者间差异显著。说明0．20％钼酸铵叶面喷雾可较好控制青枯病的蔓延、扩展。2．1．2不同浓度钼营养处理后烟草青枯病田间病情指数的比较黔江新华试验点0．20％、O．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵处理后烟草青枯病病情指数变化情况如图5．5I所示。对照的病情指数一直最高，钼酸铵4个浓度处理青枯病的病情指数均比对照低；0．20％钼酸铵叶面喷雾处理青枯病病情指数最低，比对照1．9116．75，方差分析表明两者差异显著；其次为0．10％钼酸铵叶面喷雾处理，比对照CK低1．83～15．10，方差分析表明两者差异显著，与0．20％钼酸铵喷雾处理差异不显著。说明增施钼酸铵对延缓青枯病的严重度具有一定的效果，以0．20％钼酸铵喷雾处理效果最明显。黔江水市乡烟科所试验点，试验于团棵期、旺长期处理两次，浓度依次为O．20％、0．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵处理后烟草青枯病病情指数变化情况如图5—4II所示。处理后，不同处理间差异更明显；对照处理的病情指数一直最高，4个钼酸铵浓度处理青枯病病情指数均比对照低；第1次处理后7d、第2次处理后7d两次调查结果均以0．20％钼酸铵叶面喷雾处理青枯64粥舳加∞如∞如加m0 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果病病情指数最低，比对照CK低2．65、6．53，其次为0．10％钼酸铵叶面处理，两者间差异不显著，但与对照比差异显著：第2处理后14d、第2次处理后21d两次调查结果以为0．10％钼酸铵叶面喷雾处理最低，比对照CK低9．80、14．9l，比对照低9．72、13．35，其次为0．20％钼酸铵喷雾处理，两者间差异不显著，但与对照比差异显著。说明根外补充钼营养可有效延缓青枯病病情的加重度具有一定的效果。器量。嚣．塑Q籁靼逛惧7．207．27查时间调查时间处理前第1次处理后。7d第2次处理后‘7d第2次处理后14d第2次处理后21d图5．5不同浓度钼素处理后烟草青枯病田间病情指数比较Fig．5·5Comparisonofdifferenttreatmentsonindexoftobaccobacterialwiltinthefield注：图I、II依次为黔江新华试验点、水市乡烟科所试验点处理区烟草青枯病发病率变化情况。Note：Fig．IandIIaretheindexdynamicsoftobaccobacterialwiltatQianjiangXinhuaandShuishiresearchsites，respectively．2．2不同浓度钼营养处理对烟草青枯病的田间控病效果比较浓度依次为0．20％、0．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵处理对烟草青枯病控病效果如图5-6所示。从图5-6I可知，黔江新华试验基地实验结果为：0．20％钼酸铵叶面喷雾处理对青枯病的控病效果最好，试验期间，最高控病效果为58．82％(第3次调查)，末次控病效果为46．97％，∞弱如巧加bm；Ox3勺II!Q器墨Q籁靼磐嫘 西南大学硕士学位论文方差分析表明与其余处理差异显著；其次为0．10％钼酸铵叶面喷雾处理，试验期间对青枯病的控病效果为41．68％～53．87％；其后依次为0．05％>0．02％，0．02％叶面喷雾处理对青枯病的末次防控效果为32．75％。说明根外补充钼营养在一定程度上有有利于促进烟草抵抗青枯病严重为害的作用。6．227．107．27调查时间第1次处理后7d第2次处理后7d第2次处理后14d第2次处理后2ld调查时间图5．6不同浓度钼素处理对烟草青枯病的田间控病效果Fig．5．6Controlefficaciesofdifferenttreatmentsontobaccobacterialwiltinthefield注：图I、II依次为黔江新华试验点、水市乡烟科所试验点处理区烟草青枯病发病率变化情况：柱图上的误差线表示标准偏差，n=3；不同字母表示PS0．05水平下差异显著(Duncan)。Note：Fig．IandIIarethecontrolefficaciesoftobaccobacterialwiltatQianjiangXinhuaandShuishiresearchsites．respectively．Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovebargraph，n23；Differentlettersmeantsignificantdifferenceat0．05levelbyDuncan．黔江水市烟科所基地试验结果为(图5-6II)：0．20％t阳酸铵叶面喷雾处理对青枯病的控病效果最好，试验期间，控病效果为51．15---63．44％，方差分析表明与其余处理差异显著；其次为0．10％t距I酸铵叶面喷雾处理，试验期间对青枯病的控病效果为43．85％～50．03％；其后依次为0．05％>0．02％，0．02％叶面喷雾处理对青枯病的末次防控效果为38．25％。说明根外补充钼加∞如∞如加mO一摹一奇8疆3Io扫盘ou眯较爆辍加∞如柏如加mO一零一分E。蹬aI昌暑u眯糕堠辽 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果营养在一定程度上可能有促进烟草抵抗青枯病的为害，以0．20％钼酸铵叶面喷雾处理对青枯病的控病效果最明显。2．3不同浓度钼营养对烟草田间生育期的影响表5_4不同处理对烟草生育期的影响Table5-4Effectofdifferenttreatmentsontobaccogrowthperiod对新华试验地烟株生长情况调查发现，在烟苗移栽成活后到采烟叶烤结束，无论是前期，还是后期生长，叶面喷施钼酸铵处理区烟草的生长势、整齐度、叶色均比对照CK的强、整齐、绿。浓度为0．20％、0．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵处理对烟草关键生育期的影响如表5_4所示，从表中数据可明显看出，0．20％、O．10％钼酸铵处理50％叶片达到团棵标准的时间、50％烟株出现花蕾的时间均比对照早2d；三片脚叶成熟的时间，前者比对照CK晚ld，后者与对照一样。0．05％、0．02％钼酸铵处理50％叶片达到团棵标准的时间与对照CK一样；50％烟株出现花蕾的时间，前者比对照晚1d，后者与对照一样；三片脚叶成熟的时间，前者比对照CK晚2d，后者比对照早ld。由表5_4可知，在水市乡烟科所试验点，试验于团棵期、旺长期处理两次，田间调查发现，处理区烟株生长势、整齐度、叶色均比对照区强、整齐、绿。从表中数据可明显看出，0．20％钼酸铵叶面喷雾处理50％烟株出现花蕾的时间、三片脚叶成熟的时间均比对照晚2d；0．10％、0．05％叶面喷雾处理50％烟株出现花蕾的时间、三片脚叶成熟的时间均比对照晚ld；0．02％叶面喷雾处理50％烟株出现花蕾的时间比对照CK晚1d，三片脚叶成熟的时间与对照一致。不同处理烟草进入关键生育期的时间与对照几乎一致，说明浓度分别为0．20％、0．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵叶面喷雾处理对烟草正常的生长发育均无不利影响。2．4不同浓度钼营养对烟草农艺性状的影响2．4．1不同浓度钼营养对烟草移栽后45d农艺性状的影响由于水市乡烟科所试验地处理初始时间为团棵期，所以仅对其进行了打顶后7d农艺性状调查。黔江新华试验地，浓度为0．20％、0．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵处理烟草移栽后45d农艺性状的变化情况如表5．5所示。从表中数据可明显看出，叶面喷施钼酸铵后烟草的株高、67 西南大学硕士学位论文最大叶长、最大叶宽、茎围、最大叶叶面积均比对照CK好。在4个钼酸铵浓度处理中，除有效叶片数外，0．20％钼酸铵叶面喷雾处理各农艺指标相对最好，方差分析表明，该处理与对照差异显著；其次为0．10％锢酸铵叶面喷雾处理，方差分析表明，除株高、有效叶片数外，该处理与对照差异显著，与0．20％钼酸铵叶面喷雾处理差异不显著。说明叶面喷施钼酸铵对烟草前期的生长有一定的促进作用，0．20％钼酸铵叶面喷雾处理效果最佳，其次为0．10％钼酸铵叶面喷雾处理。表5．5不同处理对烟草移栽后45d农艺性状的影响Table5—5Effectofdifferenttreatmentsontobaccoagronomicalcharacter45daysaftertransplanting注：同一列数字后小写字母表示处理间PSO．05时的显著性差异，下同。Note：DifferentsmalllettersabovethebarmeantsignificantdifferenceatPS0．05．respectively．The$anlcbelow2．4．2不同浓度钼营养对烟草移栽后75d农艺性状的影响表5．6不同处理对烟草栽后75d农艺性状的影响Table5-6Effectofdifferenttreatmentsontobaccoagronomicalcharacter75daysaftertransplanting黔江新华试验地烟草种植品种为云烟87，0．20％、0．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵对其移栽后75d农艺性状的影响如表5．6所示。从表中数据可明显看出，叶面喷施钼酸铵后烟草的株高、最大叶长、最大叶宽、茎围、有效叶片、最大叶叶面积均比对照CK好；0．20％钼酸铵叶面喷施处理效果相对最佳，方差分析表明，除有效叶片数外，该处理其余各农艺指标均与对照CK差异显著；其次为0．10％钼酸铵叶面喷雾处理，方差分析表明仅最大叶面积与0．20％钼酸铵叶面喷施处理差异显著，与对照相比，株高、最大叶宽、茎围、最大叶面积均存在显68 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果著性差异。说明在一定程度上，叶面喷施钼酸铵有助于烟草后期的生长，0．20％铝酸铵叶面喷雾处理效果相对最佳，其次为0．10％钼酸铵叶面喷雾处理。黔江水市乡烟科所试验地种植品种为南江3号，浓度分别为O．20％、O．10％、0．05％、0．02％的钼酸铵对烟草移栽后75d农艺性状的影响如表5-6所示。从表中数据可明显看出，处理区各农艺指标均比对照CK好：株高、最大叶长、茎围、有效叶片、最大叶叶面积均以0．20％叶面喷施处理最好，依次分别比对照多24．04cm、8．01cm、1．26cm、2．11片、280．87cm2，方差分析表明，与对照CK差异显著；最大叶宽以0．05％钼酸铵叶面喷雾处理最好，比对照多3．23cm，方差分析表明与对照相与对照差异显著。说明在一定程度上，叶面喷施铝素有助于烟草后期的生长，0．20％钼酸铵叶面喷雾处理效果最佳。3结论与讨论3．1结论试验结果显示，根外增施钼营养具有延缓青枯病蔓延的趋势，能有效降低青枯病的危害严重度，以0．20％钼酸铵叶面喷雾处理对青枯病的控病效果最好，田间最高控病效果为58．82％(新华)、63．44％(水市乡烟科所)，末次调查控病效果为46．97％(新华)、51．15％(水市乡烟科所)；在烟草生育期、农艺性状方面，叶面喷施钼酸铵处理区烟草的生长势、整齐度、叶色均比对照CK的强、整齐、绿；浓度为0．20％、0．10％、0．05％、0．02％钼酸铵处理对烟草进入各关键生育期的时间影响不明显；在4个钼酸铵浓度处理中，以0．20％叶面喷施处理对烟草移栽后45d、75d的株高、最大叶长、最大叶宽、茎围、最大叶面积等农艺性指标的优化作用最明显。3．2讨论研究结果表明，根外补充0．20％钼酸铵不仅能促进烟草抗青枯病能力的表达，而且对烟草各农艺指标均有一定的优化作用。原因可能是目前一些植烟区土壤存在缺钼问题，而钼元素又是硝酸还原酶的必需成分，也是固氮酶中钼铁蛋白的组分，且在植物氮代谢中起重要作用、改善烟草的氮素营养‘87，104】；根外增施Mo有利于提高烟叶中叶绿素的含量和稳定性、增强烟叶的光合作用、促进烟株体内碳水化合物的合成和转移，能促进烟草体内总糖、蛋白质以及氮的合成，较好地协调糖碱比，进而增大烟株株高、单叶重和叶面积系数[105-108,125】。69 西南大学硕士学位论文第3节不同方式补充钼素对烟草青枯病的田间控病效果由于钼是烟草必需的微量元素，对烟草的氮素营养、提高烟叶中叶绿素的含量和稳定性、增强烟叶的光合作用、促进烟株体内碳水化合物的合成转移起着重要作用阶104’1251。钼能增大烟株株高、单叶重、叶面积系数，促进烟草体内总糖、蛋白质以及氮的合成，较好地协调糖碱比，提高烟叶的香气质量，改善烟叶的香吃味【105。1鹏】。对此本节在前期室内和田间试验的基础上，设置了叶面喷雾、灌根、窝施3种补充钼素的方式，通过调查试验地青枯病发生情况、烟草农艺性状、烟草生育期，统计分析比较3种方式补充钼素对烟草青枯病的田间控病效果，以期筛选出诱导烟草抗青枯病的最佳施用方式，为进一步深入研究奠定基础，同时也为烟叶生产的可持续发展提供科学的依据。1材料与方法1．1试验材料1．1．1试验地情况同本章第l节1．1．1部分。1．1．2栽培情况同本章第1节1．1．2部分。1．1．3供试烤烟品种同本章第1节1．1．3部分。1．1．4供试矿质营养同本章第2节1．1．4部分。1．1．5仪器同本章第1节1．1．5部分。1．2试验设计试验共设4个处理，各3次重复，共12个小区，采用完全随机区组设计，各小区面积为0．1亩，栽烟100株，行株距均为120cm×55cm，四周设有保护行。处理1．3依次为：以叶面喷施、灌根、窝施方式施用0．20％(w／v，下同)(NH4)6M07024·4H20溶液：处理4(对照)：清水处理，常规栽培。黔江新华试验地处理时间为：烟苗成活后(移栽后大约14d)、团棵期(零星发病时，移栽后45d左右)、旺长期(移栽后55d左右)，整个烟草生育期共处理3次；黔江水市乡烟科所试验处理时间为：团棵期(零星发病时，移栽后45d左右)、旺长期(移栽后55d左右)，整个生育期处理2次。1．3调查内容及方法1．3．1烟株青枯病发病情况调查同本章第1节1．3．1部分。70 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果1-3．2烟草生育期调查同本章第1节1．3．2部分。1．3．3烟株农艺性状调查同本章第1节1．3．3部分。1．4数据处理试验数据统一采用Excel进行基本处理，计算出发病率、病情指数及相对防效，然后采用SPSSl6．0统计软件比较分析相关数据在显著性水平为O．05时的差异。2结果与分析2．1不同方式补充钼营养对烟草青枯病田间发病情况的影响2．1．1不同方式补充钼营养对烟草青枯病田间发病率的影响喷雾、灌根、窝施3种方式补充钼素对烟草青枯病发病率的影响如图5．7所示。从图5．7I可知，黔江新华试验地，对照CK的发病率最高，为29．78～91．22％，方差分析表明与钼素处理区差异显著。3种铝素补充方式中，喷雾处理青枯病发病率相对最低为11．99％～67．96％，比对照少17．79％～23．48％；其次为钼素灌根处理，为12．43％～70．90％；铝素窝施处理相对较高，为14．23％～80．84％；方差分析表明，试验期间，钼素喷雾与灌根处理间差异不显著，但钼素喷雾和灌根处理均与钼素窝施处理差异显著(第一次调查除外)。说明以喷雾、灌根、窝施3种方式增施钼素对烟草青枯病的发生、流行均有一定的抑制作用，叶面喷雾方式施用钼素效果相对最好，其次为灌根方式施用钼素。由于室内试验结果已表明以窝施方式补充钼营养对烟草抗青枯病特性的表达效果不明显，以及与黔江水市新华试验地在处理次数或时间上形成对比，所以在黔江水市乡烟科所试验地仅对叶面喷雾和灌根方式进行了比较。从图5．7II可知，黔江水市乡烟科所试验地，试验于团棵期、旺长期处理两次，喷雾、灌根两种方式根外增施钼素对烟草青枯病发病率有着不同程度的影响，处理前各小区青枯病发病率无显著性差异，处理后不同处理间存在显著性差。调查结果显示，处理后，对照CK的发病率一直最高，为35．98％～75．23％，方差分析表明与钼素处理区差异显著：叶面喷雾、灌根两种根外增施钼素处理中，灌根增施钼素处理青枯病发病率大于叶面喷雾增施钼素处理，试验期间，两者差异显著。说明以喷雾、灌根方式增施钼素对烟草青枯病的发生、流行均有一定的抑制作用，以叶面喷雾方式补充钼素效果更好。71 西南大学硕士学位论文霎、-，8g号．曼D§．璺凸碍倏鲻6-227．107—207．27查时间调查时间处理前第1次处理后7d第2次处理后7d第2次处理后14d第2次处理后21d图5．7不同方式补充钼营养对烟草青枯病田间发病率的影响Fig．5．7EffectofdifferenttreatmentsOnincidenceoftobaccobacterialwiltinthefield注：图I、Ⅱ依次为黔江新华试验点、水市乡烟科所试验点处理区烟草青枯病发病率变化情况。折线图上的误差线表示标准偏差，n=3：不同字母表示PS0．05水平下差异显著(Duncan)；下同。Note：FigIIandIIaretheincidencedynamicsoftobaccobacterialwiltatQianjiangXinhuaandShuishiresearchsites，respectively．bErrorbarsrepresentedstandarddeviationinabovelineorbargraph，n=3；Differentlettersmeantsignificantdifferenceat0．05levelbyDuncan；Thesamebelow．2．1．2不同方式补充钼营养对烟草青枯病田间病情指数的影响试验结果表明不同方式补充钼营养对烟草青枯病田间病情指数的变化存在不同程度的影响(图5．8)。从图5—8I可知，在黔江新华基地试验期间，对烟草青枯病发病情况共进行了5次调查，对照CK青枯病病情指数最高，方差分析表明与处理区差异显著。在喷雾、灌根、窝施3种方式增施钼素处理中，喷雾方式增施钼素处理青枯病病情指数相对最低，其次为钼素灌根处理，窝施铝素处理青枯病病情指数相对较高；末次调查结果显示，三种方式处理青枯∞∞舳加∞如∞如加m0兜舳加∞如绚如加mo^装一88口13u}Q∞8∞一口糌惧越 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果病病情指数依次分别比对照少15．49、7．92、13．10。说明以喷雾、灌根、窝施方式增施钼素延●缓青枯病的严重发生均具有一定的抑制、减缓作用，叶面喷雾方式增施钼素效果最明显。蓉鼍．_器．璺凸籁磐惧嚣屯．曼Q昌譬舀籁靶堙懊6．227．107．207．27查时间处理前第1次处理后7d第2次处理后7d第2次处理后14d第2次处理后21d图5．8不同方式补充钼营养对烟草青枯病田间病情指数的影响Fig．5-8Effectofdifferenttreatmentsonindexoftobaccobacterialwiltinthefield注：图l、II依次为黔江新华试验点、水市乡烟科所试验点处理区烟草青枯病病情指数变化情况。Note：Fig．IandIIaretheindexdynamicsoftobaccobacterialwiltatQianjiangXinhuaandShuishiresearchsites，respectively黔江水市乡烟科所试验基地，试验于团棵期、旺长期处理两次，试验期间，对烟草青枯病发病情况共进行了5次调查。从图5．8II可明显看出，处理前，各处理间青枯病病情指数无显著差异：处理后，对照CK青枯病病情指数明显高于处理区；方差分析表明对照CK与处理区差异显著。在喷雾、灌根方式增施钼素处理中，喷雾方式增施钼素处理青枯病病情指数相对最低，其次为钼素灌根处理；末次调查结果显示，两种方式增施钼素处理青枯病病情指数依次分别比对照少11．96、lO．09。说明以喷雾、灌根方式增施钼素延缓青枯病的严重发生均具如稻∞弘如巧加bm5O弱如巧加蛉m50 西南大学硕士学位论文有一定的抑制、减缓作用，叶面喷雾方式增施钼素效果最明显。2．2不同方式补充钼营养对烟草青枯病的田间控病效果⋯调查时间／-Z／第一次处理后7d第二次处理后7d第二次处理后14d第二次处理后21d调查时间图5—9不同方式补充钼营养对烟草青枯病的田间控病效果Fig．5．9Controlefticaciesofdifferenttreatmentsontobaccobacterialwiltinthefield注：图I、II依次为黔江新华试验点、水市乡烟科所试验点不同处理对烟草青枯病的田间控病效果；柱图上的误差线表示标准偏差，n=3；不同字母表示P≤O．05水平下差异显著(Duncan)。Note：Fig．IandIIalethecontrolefficaciesofdifferenttreatmentsontobaccobacterialwiltatQianjiangXinhuaandShuishiresearchsites，respectively．Errorbarsrepresentedstandarddeviationinabovebargraph，n23；Differentlettersmeantsignificantdifferenceat0．05levelbyDuncan．喷雾、灌根、窝施3种方式增施钼素对烟草青枯病的控病效果如图5-9所示。从图5-9I可知，在黔江新华试验点，叶面喷雾增施钼素对烟草青枯病的控病效果相对最佳，为41．82％～59．63％；其次为灌根方式施用钼素，其控病效果为36．31～58．09％；窝施方式施用钼素处理，74加∞卯∞如加mO^装一分81王奄一Q耳口ou睬校懊辍加∞柏如加mO一摹一分8蹬三暑口ou眯校馔衽 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果发病初期，控病效果为52．04％，后期效果不明显。说明喷雾、灌根、窝施3种方式增施钼素对烟草青枯病均具有一定的控病效果，以叶面喷雾增施钼素效果最明显。从图5-9II可知，在黔江水市乡烟科所试验点，叶面喷雾增施钼素对烟草青枯病的控病效果相对最佳，为48．81％---62．13％；其次为灌根方式施用钼素，其控病效果为45．77～55．9l％；方差分析表明，前3次调查喷雾、灌根方式处理差异显著，末次调查差异不显著。说明喷雾、灌根方式增施钼素对烟草青枯病均具有一定的控病效果，以叶面喷雾增施钼素效果最佳。2．3不同方式补充钼营养对烟草田间生育期的影响表5．7不同处理对烟草生育期的影响Table5-7Effectofdifferenttreatmentsontobaccogrowthperiod田间调查发现，处理区烟株生长势、整齐度、叶色均比对照区强、整齐、绿。喷雾、灌根、窝施3种方式增施钼素对烟草进入各关键生育期的影响如表5．7所示。从表中数据可明显看出，在黔江新华试验点，以喷雾方式施用钼素处理50％叶片达到团棵标准的时间、50％烟株出现花蕾的时间、三片脚叶成熟的时间依次分别比对照晚2d、2d、3d，钼素窝施处理烟草到达上述三个关键生育期的时间一致，以灌根方式施用钼素处理烟草到达上述三个关键生育期的时间依次分别比对照晚ld、1d、3d。处理区与对照区烟草进入关键生育期的时间几乎一致，说明以喷雾、灌根、窝施3种方式增施钼素对烟草正常的生长发育无不利影响。在黔江水市乡烟科所试验点，以喷雾方式施用钼素处理50％烟株出现花蕾的时间、三片脚叶成熟的时间依次分别比对照晚ld、2d；以灌根方式施用钼素处理50％烟株出现花蕾的时间与对照一致，三片脚叶成熟的时间比对照晚ld。说明以喷雾、灌根两种方式增施钼素对烟草正常的生长发育无不利影响。2．4不同方式补充钼营养对烟草田间农艺性状的影响2．4．1不同方式补充钼营养对烟草移栽后45d农艺性状的影响由于水市乡烟科所试验地处理初始时间为团棵期，所以仅对其进行了打顶后7d农艺性状调查。在黔江新华试验点，喷雾、灌根、窝施3种方式增施钼素对烟草移栽后45d农艺性状的影响如表5-8所示。从表中数据可明显看出，与对照CK相比，不同处理株高、最大叶长、。茎围均以叶面喷施钼素处理相对较好，但相互间不存在显著差异；最大叶宽以灌根方式施用钼素处理相对较好，比对照CK多2．47cm，与对照CK差异显著；有效叶片数、最大叶面积75 西南大学硕士学位论文以叶面喷施钼素处理相对较好，分别比对照多0．75片、108．46cm2，与对照CK差异显著。说明以喷雾、灌根方式增施钼素，在一定程度上，有利于烟草前期的生长，尤其是喷雾方式施用。表5．8不同处理对烟草移栽后45d农艺性状的影响Table5-8Effectofdifferenttreatmentsontobaccoagronomicalcharacter45daysaftertransplanting注：同一列数字后小写字母表示处理间PS0．05时的显著性差异，下同。Note：DifferentsmalllettersabovethebarmeantsignificantdifferenceatPSO．05respectively．Thesamebelow2．4．2不同方式补充钼营养对烟草移栽后75d农艺性状的影响表5-9不同处理对烟草栽后75d农艺性状的影响Table5-9Effectofdifferenttreatmentsontobaccoagronomicalcharacter75daysaftertransplanting喷雾、灌根、窝施3种方式增施钼素对烟草移栽后75d农艺性状的影响如表5-9所示。从表中数据可明显看出，在黔江新华试验点，除有效叶片数外，处理区烟草移栽后75d农艺指标与对照区存在显著性差异；株高、最大叶长、最大叶面积以喷雾增施钼营养处理相对最好，依次分别比对照多9．29cm、4．27cm、220．36锄2，与对照CK差异显著：最大叶宽、茎围以灌根方式增施钼素处理相对最好，分别比对照多3．27cm、1．02cm，与对照CK差异显著。在黔江水市乡烟科所试验点，处理区株高、最大叶长、最大叶宽、茎围、有效叶片数、最大叶面积等指标均比对照CK好；方差分析表明，处理区各农艺指标与对照CK差异显著；在喷雾、灌根增施钼素处理中，仅株高指标以灌根方式增施钼素处理相对比较好，与喷雾增施钼素处理差异不显著；其余指标均以叶面喷雾方式增施钼素处理相对较好，与灌根方式增施钼素处理液不存在显著性差异。说明以喷雾、灌根方式增施钼素有利于烟草后期各农艺特征的表现，喷雾方式增施钼素效果比较明显。76 第五章矿质营养Mo对烟草青枯病的田间控病效果3结论与讨论3．1结论研究结果显示，喷雾、灌根、窝施3种方式补充钼营养对烟草青枯病均具有一定的控病效果，以叶面喷雾方式增施钼素效果最明显，试验期间，该处理对青枯病的控效果为41．82％～59．63％(黔江新华试验点)、48．81％"--62．13％(黔江水市乡烟科所试验点)；其次为灌根方式施用钼素，其控病效果为36．31～58．09％(黔江新华试验点)、45．77～55．91％(黔江水市乡烟科所试验点)。在烟草生长发育方面，钼素处理区烟株生长势、整齐度、叶色均比对照区强、整齐、绿：喷雾、灌根方式补充钼素有利于烟草整个生育期株高、叶长、叶宽、茎围等农艺特征的优化。3．2讨论研究结果表明，以喷雾、灌根方式补充钼营养在一定程度上起着控病增产的作用。虽然烟草根系主要以钼酸根离子的形式从根际土壤中吸收钼元素，但是已有研究指出，叶片也可以吸收钼，且以叶面喷施方式补充烟草更容易更快；烟草的产量、品质与其钼营养的状况密切相关‘1281。根据利比希最小因子定律——植物生长的好坏取决于相对有效程度最低的那种营养物质的供给水平——及本论文的相关研究结果，建议在今后的烤烟生产中务必注重Mo肥的施用(尤其是在Mo营养缺乏的植烟区)，若再辅以一些调控田问温湿度的农艺措施，对烟草青枯病的控病作用将更明显。此外，关于其在烟草植株体内的含量变化动态、对烟草品质的影响、通过叶面补充是否对烟株根际周围的微生物区系产生影响，Mo、寄主植物(烟草)以及青枯雷尔氏菌三者之间相互作用的分子机制等还有待进一步研究。 西南大学硕士学位论文78 第六章结论与讨论矿质营养是植物正常生长和发育所必需的，其主要包括大量元素氮、磷、钾，中量元素钙、镁、硫和微量元素铁、锰、铜、锌、硼、钼、氯等【861。不同元素作用于植物的途径、有效量不尽相同，植物对其生理生化反应也各有差异，从而也直接或间接地影响着植物的抗病能力[11,86]。对此，本论文首先对重庆市青枯病发生十分典型的黔江植烟区部分健康和发病烟株根际土壤营养状况进行了初步分析，然后采用室内与田间试验相结合的模式，研究了根外补充部分烟草必需矿质营养对烟草抗青枯病的影响及其生理生化机理，取得了系统的研究结果，在理论和实践中都具有重要的价值。1结论1．1烟草青枯病的发生与根际土壤营养状况密切相关通过对采自重庆市烟草青枯病发生十分典型的黔江植烟区的根际土壤样品营养成分进行测定分析发现，健康烟株与青枯病发病烟株根际土壤营养各指标间存在极显著差异，土壤中交换性钙和镁、有效钼、有效硼等矿质营养与植烟土壤发病与否密切相关，尤其是有效钼和交换性钙。通过判别分析可知，烟株根际土壤中速效钾、交换性钙、有效钼、有机质、有效硼5个成分的含量情况可能是判别青枯病发病与否的关键因子，同时也构建了相应的判别函数。1．2初步明确增施Mo、Ca元素对烟草青枯病具有较好的控病效果通过比较Ca、B、Mg、Mo4种元素对烟草青枯病的室内和田间控病效果发现，4种元素处理对青枯雷尔氏菌的生长均具有一定的直接抑制作用，Mo处理最高，其次为Ca处理，两处理对青枯雷尔氏菌的最高抑菌率分别为35．93％、33．13％；4种供试元素对青枯病在室内和田间的发病均具有一定的控制作用，以Mo处理最好，其次为Ca处理，两处理对青枯病的室内末次调查控病效果分别为64．79％、57．67％，田问最高控病效果分别为62．23％、62．57％；Mo、Ca处理有利于优化烟草的株高、最大叶宽、茎围、最大叶面积等农艺指标。1．3采用叶面喷雾的方式补充钼素对烟草青枯病的控病效果最佳通过比较叶面喷雾、灌根、窝施3种方式补充钼营养对室内和田间烟草青枯病发病情况的影响发现，以叶面喷雾方式补充0．20％钼营养对烟草青枯病具有最佳的控病效果，可有效延缓青枯病的发生，室内末次调查控病效果为59．43％，田间控病效果最高为59．63％。1．4进一步明确了根外补充0．20％钼素对烟草青枯病的控病效果及生理生化机理通过比较0．20％、0．10％、0．05％、0．02％4种Mo营养对烟草青枯病的控病效果发现，随钼营养水平的增加，处理烟草表现出对青枯病更好的抵抗效果，室内末次调查控病效果为57．06％，田间最高控病效果为63．44％，对烟株的株高、最大叶长和宽、茎围等农艺指标有一 西南大学硕士学位论文定的促进作用。通过比较不同浓度Mo营养及Ca、B、Mg、Mo4种元素增强烟草抗青枯病的生理生化机理发现，0．20％Mo处理可显著提高感病烟株体内可溶性蛋白的含量，可明显增强感病烟株体内POD、CAT、PPO的活性；0．20％Ca处理也可显著提高感病烟株体内可溶性蛋白的含量，可明显增强POD、SOD、PPO的活性。综合上述研究结果，建议，在今后的烤烟生产中，应注重钼、钙肥的施用，如果再辅以一些调控田间温湿度的农艺措施，可有效延缓或减轻青枯病的危害。此外，关于其对烟草品质的影响、通过叶面补充矿质营养是否对烟株根际周围的微生物区系产生影响、补充矿质元素后植物体内相关元素含量的变化情况及抗性基因的表达情况还有待进一步研究。2讨论烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌限．solanacearum)引起的一种世界范围内毁灭性的细菌性土传病害，目前从抗病育种、改善耕作制度、农艺措施、生物或药剂防治、综合治理等方面着手效果均不理想【1．10’3∞71。而该病原菌寄主、致病力、发病条件均日趋多样化，己成为茄科类作物生产可持续发展的瓶颈。加之，营养不平衡是目前大部分植烟区乃至茄科作物种植基地(尤其是西南地区)普遍存在的一个连作障碍问题【3．5】；植物病害的防治措施主要从增强寄主抗病性或保护寄主不受侵染、消灭或控制病原物、改变环境条件，使其有利于寄主而不利于病原物三个方面着手[39】；病原物与寄主之间营养关系是最重要的，病原物必须从寄主植物体内获得必要的营养物质和水分，其才能在寄主体内进一步繁殖和扩展，寄主不能满足及病原物的营养要求，侵染过程就不能顺利完成，且对于一些目前尚无理想防控措施的病害，矿质营养调控是一条值得探索的新途径[39,11,100】：其不仅符合作物健康栽培的理念，而且对植物病害防控中营养．控病模型的构建具有重要意义、对调控或缓解土壤连作障碍问题意义重大。本研究也证实根外调控烟草部分必需矿质营养可促进烟草抗青枯病特性的表现。2．1摸清土传病害发生严重烟区发病烟株根际土壤与健康烟株根际土壤营养成分差异，对土传病害的防控具有重要意义。近年来，虽然关于植烟土壤有效成分、微量元素的含量情况、分布规律及影响因素进行研究的很多，但大多集中在地区间差异及单个元素指标的分析上，涉及土壤有效成分与青枯病发病情况关系研究的鲜见报道【3，12乳”31。针对目前没有理想防控措施的茄科青枯病类土传病害，调节矿质营养可能是值得探讨的一条新途径[1l'10们，且已有研究者将营养调控措施用于青枯病类土传病害的防控研列12。141。对此，摸清烟株根际土壤营养与青枯病发生的关系，找准影响发病最关键的土壤营养因子，为探索烟草青枯病的发病机理、解决连作障碍研究奠定基础，为从根际土壤调控或营养调控方面着手解决土传病害防控问题，尤其是烟草青枯病综合防控技术的集成，重庆特色山地烟的生态条件基础研究、土壤修复技术的进一步完善提供科学的依据。此外，该研究在烟草健康栽培、保持根际微生态环境平衡方面均具有重要价值，对促进该区优质中间香型特色烟叶生产布局及特色烟叶的可持续发展具有重要意义。2．2调控作物矿质营养措施是有效防控青枯病的一条值得深究的新途径。 第六章结论与讨论本论文研究结果证实调控烟草体内部分矿质营养的水平有利于增强烟草对青枯病的抵抗能力。将营养调控措施应用与青枯病的防控，已有研究们在烟草以外的作物上开展研究[12-14,134-135]。Doannon等研究硅营养与番茄青枯病的关系后指出【12’36’52彤】，增加硅营养可明显降低番茄青枯病的发病率、病情指数，诱导番茄对青枯病产生抗病特性。Yamazaki等研究钙营养与番茄青枯病的关系结果表明【56-611，增加钙营养具有降低番茄青枯病病情指数的作用，且在抗病品种上表现更明显。Jiang等研究钙营养对由青枯雷尔氏菌引起的番茄青枯病的影响及其抗性机制的调控指出【62】，0．5、5．0、20mM钙浓度处理病害严重度分别为100％、77．1％和56．8％：高钙浓度处理番茄苗的高、茎粗、生物量显著好于生长在低钙浓度中的番茄苗：且钙调控着番茄植株中过氧化氢的含量以及过氧化物酶和多酚氧化酶的活性。Norman等研究亚磷酸与青枯病的关系结果表明【l31，亚磷酸(H3P03)灌根可有效阻止青枯雷尔氏菌1、3生理小种侵染天竺葵，且含钾盐的亚磷酸效果更好，而其它含磷产品(P205、H3P04)没有此作用。2．3以叶面喷雾方式根外补充钼营养可明显增强烟草抵抗青枯病的能力，其分子机理还有待进一步研究。本研究通过室内和田间试验证实以叶面喷雾方式根外补充钼营养对烟草青枯病具有较好的控病效果，其田间控病效果最高为63．44％，可显著提高烟草体内POD、CAT、PPO等防御酶的活性。钼是烟草必需的微量元素之一，主要存在于生长中的幼嫩叶片，叶片中钼含量大于茎和根，且主要存在于叶绿体中【861。烟草对其需求量低于其它矿质养分，在烟草体内的氮代谢途径中扮演着重要的角色。钼是硝酸还原酶的组分之一，植物如果缺钼就会出现亚硝酸的积累。这对以N03—_N为主要氮源的烟草来说是非常重要的【87．1洲。钼在植物中还有许多其它方面的功能，如植物缺铝时，抗坏血酸的浓度显著降低；在植物的代谢和呼吸中起一定作用；钼还与植物的磷代谢有关，缺钼时不利于无机磷向有机磷转化；此外，钼还能提高植物抗病害的能力【l¨。目前关于钼与烟草的关系的研究主要集中在生理生化及品质的影响方面。关于Mo处理后烟株体内青枯雷尔氏菌的生长动态、致病力的变化以及相关元素的含量变化，Mo处理后烟株根际微生物种群的变化情况，Mo处理后烟株体内抗病相关基因的表达情况等可开展进一步的研究。本研究从营养保健方面着手，探讨了营养与病害之间的关系，为今后研究病虫害的防治提供强有力的理论依据及技术支撑，对推进烟草行业的可持续发展具有十分重要的意义。对于青枯病这类典型的土传病害，在缺乏抗病品种和有效药剂的情况下，必须坚持“预防为主，综合防治”的方针，实行以“农业措施为主，化学防治为辅”的系统控制策；立足于轮作和土壤生态调控，降低初始菌源量、减少病菌侵染机会，推迟发病高峰期的到来，从而降低损失。坚持轮作，可改善微生态环境：平衡营养，可提高抗病性：精耕细作，可保证适量的有机肥和良好的土壤条件。在今后的烤烟生产过程中，生产者应该培育无病壮苗、高质量移栽，加强病原菌监测、病害测报：将气象条件、土壤条件、病原菌等三者结合起来对大田烟株进行综合管理。81 西南大学硕士学位论文82 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西南大学硕士学位论文 致谢时间匆匆，转眼间，从2007年9月至今，已来到西南大学植物保护学院7载。在西南大学这片肥沃的土地上，我播下了种子，也收获了硕果。日复一日，月复一月，年复一年，在这片充满活力、充满阳光的土地上，我经历过风风雨雨、也品尝了人生的酸甜苦辣。总之，在西大，无论是生活、学习、个人能力的锻炼等方面我都收获了很多，成长了不少。在硕士毕业论文即将完成之际，一并向所有帮助我、支持我、鼓励我的人敬上我最真诚的谢意。感谢您们!正是因为有了你们的关心与帮助，我的大学生活才会过得那么的充实、色彩斑斓。该论文是在导师丁伟教授悉心指导下完成的，无论是论文的选题、设计、试验的开展，还是论文的撰写和修改，无不倾注导师大量的心血。在此，特向导师丁伟教授道一声：“丁老师，您辛苦了”!从2010年本科生教学实习我就跟着您从事烟草病虫害综合防控技术研究工作，五年来，您和师母对我的学习、生活、成长给予了莫大的关心和帮助。您严谨的治学态度，废寝忘食、不辞劳苦的工作作风，以及深入到田间实干的精神，无时无刻不在激励着我——付出了，总是会有收获的!跟着您五年，我学会了很多、受益匪浅；感谢您对我人生目标规划、为人处世、个人能力培养等方面的指导；这一段经历，我将永远记忆犹新，并影响着我未来的工作、学习与生活。在试验过程中，重庆烟草公司黔江分公司徐小洪经理、谢华东科长、王绍吉站长、王占伟老师、姚姗姗老师、张学杰老师，重庆市烟草科学研究所陈海涛老师等给予了我大力的支持、鼓励与关心，在此向他们表示衷心的感谢!在学习和生活过程中，西南大学植物保护学院王亨洪书记、吴俊平副书记、王进军教授、刘怀教授、何林教授、肖崇刚教授、谭万忠教授、邓新平教授、青玲教授、孙现超研究员、冉春研究员、吴仕源老师、陈国康老师、钱坤老师、肖伟老师、厉阗老师、樊玉虎老师、豆威老师、申光茂老师、周建如老师、胡伟伟老师等给予了我很多的指导、关心和帮助，感谢您们!从2011年9月至今，研究生3年，西南大学植物保护学院天然农药研究室就像我的家一般，实验室的工作人员对我无私的帮助以及所营造的良好氛围让我度过了最永远难忘的研究生生活。在此感谢实验室的张永强老师、罗金香老师在我研究过程中给予的指导与关怀，感谢杜根平、赵言国、王振国、雍小菊、李阳、李石力、石生探、杨振国、张琳丽等师兄师姐的指导与关心，感谢刘宪臣、程小龙、崔伟伟、刘永琴、李梦、张倩等同窗的关心与帮助，感谢伍斗生、于艳梅、侯秋莉、李彩新、汤荔枝、张凯、刘晓姣、王丹、喻延、王珞笙、章冰川、李盼盼、杨亮、万维肖、张淑婷、倪欢欢、程蕾、刘颖、孙立强、郭兵、刘盼盼、孙燕等师弟师妹在研究过程中的帮助。在此一并向您们表示最真诚的谢意!此外，还要感谢我家人、亲人和朋友，是他们无私的帮助、理解、关心、支持与鼓励，我才能顺利完成学业。感谢他们!谨此，向所有关心、帮助我的人，表示我最诚挚的谢意!郑世燕2014年5月于重庆北碚9l 西南大学硕士学位论文 在学期间获得的研究成果。在学期间获得的研究成果攻读硕士学位期间获得的科研成果参与“土壤修复对作物根茎病害防控作用的研究与应用”项目，获“2012．2013年度中华农业科技奖科学研究成果”三等奖。攻读硕士学位期间发表的学术论文1．郑世燕，丁伟，杜根平，等．增施Mo、Ca对烟草青枯病的控病效果及其作用机理[J】．中国农业科学，2014，47(6)：1099．1110．2．郑世燕，陈弟军，丁伟，等．烟草青枯病发病烟株根际土壤营养状况分析[J]．中国烟草学报，2014(已接收)．3．郑世燕，陈弟军，丁伟，等．根际土壤调控对连作烟田青枯病的控制作用[J】．中国烟草学报，2013，19(1)：47．52．4．郑世燕，丁伟，陈弟军，等．不同覆盖方式对烟草青枯病及农艺性状的影响【A】．中国植物保护学会成立50周年庆祝大会暨2012年学术年会论文集[c】，2012．