番茄抗青枯病生理生化机制的研究

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安徽农业大学硕士学位论文番茄抗青枯病生理生化机制的研究姓名：朱圣杰申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：丁克坚20040601 Y607252本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：套至苍时间：。伽午年∥月矽日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：基主盔．时间：弘m铲年∥月哆日跏躲j丝帆川年f月哆日 摘要本文研究了6个青枯菌菌株的致病性、生化变种、胞外酶的变化，5个番茄品种(系)对青枯病的苗期和成株期抗病性鉴定，同时研究了接种后番茄根部和叶片发生的生理生化变化，以初步探讨番茄抗青枯病的生理生化机制。所得结果概括如下：经测定，供试6个青枯菌菌株均具有致病性，且致病性由强到弱依次为HF、Hx、Ys、FY、HN2、HNl。生化变种的测定结果表明，仅FY菌株不能利用甜醇，属生化变种III的一个亚型，即III．1，而其余5个菌株均属生化变种III。胞外酶活性的测定结果表明，随培养时间的延长，果胶酶和纤维素酶两种酶活性都逐渐升高，培养7～9天酶活性均达最大值，但果胶酶活性最大值与菌株致病性之间相关性不大(r=O．6371)，而各菌株纤维素酶活性最大值与致病性高度正相关(r=O．9526)。番茄苗期采用伤根灌注法接种，分别于接种后l周、2周、3周进行发病株率调查。3次调查结果一致，5个品种(系)苗期均为感病品种(系)，但品种(系)间发病株率存在显著差异，强丰最高，新星最低，其余品种(系)介于两者之间。番茄成株期采用伤根灌注法接种鉴定，结果表明，新星、夏钻石、黄山1号3个品种(系)为抗病品种(系)，抗性指数分别为12．9、12．3、lO．9，黄山2号抗性指数为8．9，属中抗品种(系)，而强丰抗性指数为2．5，属感病品种(系)。番茄苗期未接种处理各品种(系)叶片5种防御酶活性处在动态平衡中，接种后，各品种(系)叶片POD、PPO、PAL3种酶活性均升高，新星、夏钻石、黄山1号、黄山2号始终高于对照，且上升速度、最大增幅、峰值均高于强丰，而强丰接种后初期高于对照，后期则低于对照。接种后，各品种(系)叶片SOD和CAT活性变化紊乱，没有规律。所以，接种青枯菌后番茄叶片PoD、PP0、PAL3种酶可以作为早期筛选抗病品种(系)的辅助指标，而SOD和CAT2种酶还有待于进一步研究。番茄成株期未接种处理各品种(系)根部和叶片5种防御酶(POD、PPO、PAL、soD、cAT)酶活性处在动态平衡之中，均在一定范围内波动，但幅度不大，抗病品种(系)和中抗品种(系)POD和PAL活性始终高于感病品种(系)。接种后，无论是根部还是叶片，各品种(系)PoD、PP0、PAL、SoD4种酶活性均升高，其中PAL和SOD表现较为敏感，活性高峰出现早，而且PAL出现两个活性高峰，其余3种酶只有一个活性高峰。各品种(系)根部POD、PPO、PAL酶活性的峰值和最大增幅均高于叶片，SOD恰好相反。总体上，无论是根部还是叶片，接种后抗病品种(系)和中抗品种(系)4种酶活性均高于对照，且酶活性上升速度和峰值均高于感病品种(系)；而感病品种(系)前期高于对照，后期则低于对照。各品种(系)4种酶活性峰值的高低与品种(系)抗病性均呈正相关。接种后，各品种(系)根部cAT活性均先降低后升高，第6天达到高峰，且峰值和最大增幅与品种(系)抗病性呈J下相关。抗病品种(系) 叶片CAT活性变化与根部相同，中抗品种(系)接种后2天内基本没有变化，此后升高，并始终高于对照，第6天达到高峰；感病品种(系)接种后CAT活性缓慢升高，第6天达到高峰，此后下降，第8天后一直低于对照。番茄成株期接种青枯菌后体内POD、PP0、PAL、SoD4种酶可以作为番茄抗青枯病的生理生化指标，而CAT还有待于进一步研究。番茄成株期未接种处理，无论是根部还是叶片，木质素含量与品种(系)抗病性梯度一致。接种后，无论是根部还是叶片，木质素含量均升高，抗病品种(系)始终高于中抗品种(系)，后者又高于感病品种(系)，而且木质素含量上升速度和最大增幅与品种(系)抗病性梯度一致。番茄成株期接种青枯菌后，无论是根部还是叶片，各品种(系)总酚含量均升高，抗病品种(系)和中抗品种(系)第2天和第6天出现两个高峰，且第一个峰值高于第二个，而感病品种(系)第4天达到高峰，峰值显著低于其余品种(系)，这与PAL活性变化规律基本一致。接种后，各品种(系)总酚含量均始终高于对照，且峰值高低与品种(系)抗性梯度一致。番茄成株期接种青枯菌后体内木质素含量和总酚含量可以作为番茄抗青枯病的生理生化指标。番茄成株期接种青枯菌后，抗病品种(系)和中抗品种(系)根部和叶片PoD同工酶谱带数没有变化，PP0同工酶多了1条新酶带，而感病品种(系)根部和叶片PoD同工酶多了1条新酶带，PP0同工酶多了2条新酶带。接种后，抗病品种(系)和感病品种(系)的根部和叶片SOD同工酶多了2条新酶带，而中抗品种(系)根部多了3条新酶带，叶片多了2条新酶带。关键词番茄青枯菌抗病性鉴定防御酶木质素总酚同工酶 StudiesonMechanismofPhysiologicalandBiochemicalResistanceof110matotoBacterialWiltzhuShen百ieSupeⅣisedbyProfDingKejianAbstmct：Inthisp印er，thepathogenicity，bioVar'extracellularenzyme0fsixstrainsandt11eseedlin空andadultresiStallceidemificationofnvetomatocultivarstobacterialwilt、verestudied．Meantime，t王lephysioIogicalandbiochemicalchangeswerestudiedaRerinoculationwithR口瓜幻”衙50肠珂口cP口r“minordertoclarifythephysiologicalandbiochemicalresistancemechanismoftomatotobacterialwilt．Theresultswereasf01lowing：Theresultsindicated，thesixtestedstrainsallhadpathogenicityandthepathogenicityorderfromstrongtoweakwasHF，HX，YS，FY，HN2，HNl．TheFYstraincouldn’tutilizeeulcitalandbelongedtoasubtvpeofbiov盯III—III—l，whileothersstrainsbelongedtobiovarIII．Theresultsofex廿acellularenzymeacti“tiesindicated，也eextracellularenzyme(PGandEG)activitiesincreasedaccompaniedwiththepmlongationofcultivationtimegraduallv’a11dtheenzymeactivitiesrcachedthemaxin7～9daysanercultivation．Therelativitybet、veenthemaxofPGactivityandpathogenicitywasnottoolarge(FO．6371)，whiletherelativitybetweenthemaxofEGactivityandpa廿logenicitywaSverylarge(r=O．9526)．Tbmatocultivars、Ⅳereinoculated谢thRJ口肠胛dce甜“埘wimthepouringmethodoftheseedling’shunroota11dthediseasedplantratewasinvestigatedat吐1efirst，second，thirdweekres口ectivelyafterinoculation．TIlreetimesinvestigationresultswerecoincident．Fivetomatocultivarswereallsusceptibleinseedling，butt11ereweresignificantdi仃音renceonthediseasedplantrateamongcultivarsQiangfengwasthehighestandXinXingwasthelowest，whileo血erscultiVarswerebetweenOiangfen足andXinxing．TomatocuItivarswereinoculatedwim尼JD肠门们P硼“mwiththepouringmethodoftheadult’shurtroot．Theresunshowed：Xinxing，Xiazuanshi，Huangshanvihaowereresistantcultivarsandtheresistanceindexeswere12．9，12．3，lO．9respectively．HuangShajlerhaowasmiddle—resistantcultivarandtheresistanceindexwas8．9．WhileQian譬fengwassusceptiblecultivarandtheresistanceindexwasonly2．5．Fivedefcnsiveenzvmes’activitiesinleavesoftomato、vereunderhomeostasiswithoutinoculationinseedling．TheenzymeactivitiesofPOD，PPOandPALinleavesofa11cultivarsascendedafterinoculation．TheenzymeactivitiesofPOD，PPOaIldPALofXinxing，XiazuanShi，Huangshanyihao，Huallgshanerhaowerealwaysh培herthanthoseofCKaRerinoculation，andtheascendingspeed，the1argestincreasingratethepeakvaluesofthefourcultivarswerehi曲ermanthoseofQiangfeng．TheenzymeactivitiesofPOD，PP0a11dPALofQiangfenginearlydayswashigherthanthoseof CKaRerinoculation。whilewaslowertllanthose0finlatedavsafterinoculation．ThechangesofenzymeactivitiesofSODandCATinleavesofalIcultivarswereturbulentandwerea_bsenceoforderlinessa丘erinoculation．So．thethreeenzvmes(POD，PPO，PAL)ofleavesoftomatocouldbeusedasassistantguidelinesoffntm廿ngtheresistancecultivarsinearlyphaseanerinocul“onwithR占D肠门口c已∥“埘，whileSODandCATneededmorestudies．Fivedef色nsiveenzmesactivitiesinleavesandrootsoftomatov，ereun(krhomeostasiswithoutinoculationinadult．Theyfluctuatedinacenainscope，buttheextemwassmall．TheenzvmeactivitiesofPODandPALinleavesandrootsofresistantcultivarsandmiddle—_resistantcultivarwerehigherthanthoseofthesusceptiblecultivarwithoutinoculation．TheenzvmeactivitiesofPOD，PPO，pAL，SODinleavesandmotsofallcultivarSascendeda丘erinoculation．ThePALa11dSODweremoresusceptivethanothersandtheiractivitiespeaksappearedearlierthallothers'．TheenzymeactiVityofPAL印pearedtwopeaks，Whileothers印pearedonlyonepeak．ThepeakvaIuesandmelargestincreasingratesofenzymeactivitiesofPOD，PP0，PALinrootsofallcultivarswerehigherthallthoseofleaves，whileSOD、张sreversetoothcrs．Asawhole．theactivitiesoffourenzvmesinleavesandmotsofresistamcultivarsandmiddle—resistantcultivarwerehi窟herthanthoseofaRerinoculationandmeascendingspeedandthepeakvaluesoftllef-ourcultivarswerehigherthanthoseofthesusceptiblecultivaLTheactivitiesOffourenzymesin1eavesandmofsofsusceptiblecultivarwaShi曲erthanmoseofinearlydaysaaerinoculation，whilewaslowerthanthoseofinlatedays．TherewasapositivecorrelatiOnbetweentheactivitypeakvaluesoffourenzymesandthe1evcIofcultivarsresistance．TheCATactiv“iesinrootsofallcul“v甜sdecreasedatfifst．也enascendedandappearedapeakatthesixthday世erinoculation．TherewasapositivecorrelationbetweentheactivitypeakvalueandthelargeStincreasingrateofCArandthelevelofcultivarsresistance．ThechangesofCAractivityinleavesofresistantcultivarsweres锄easthoseofrootsafterinoculation．TheC／汀activitvinkaveofmidd}e—resist札ncultivaralmostdidn’tchangeintwodaysafterinoculation，thenitascendedalldappearedaDeakatsix血dav．TheCATactivityinleaveofsusceptiblecultivarascendedslowlyaRerinoculationandaDpearedapeakatsixthdaMThenitdecreaseda11dwasalwayslo、verthaflthatofaftertheei曲mday．So，thefourerlzymesfPOD，PPO，PALandSOD)ofbodyoftomatocouldbeusedasphysiologicalandbiochemical叵uidelines0fthetomatoresistancetobacterialwiltaRerinoculationwith月sD肠门口ce盯“川．whileCATneededmorestudies．Theli垡nincontentsinrootsandleavesoftomatowereconsistenttot11elevelofcultivarsresistancewithoutinoculation．Theli旦nincontentsinrootsa11dleavesofallcultivarsincreasedaRerinOculation．Theli旦nincontentsofresistantcultivarswerealwayshi曲ert11anthatofmiddle—resistantcultivarandthelatterwasalwayshi曲erthanthat0fsusceptiblecultivaLTherewasapositivecOrrelatiOnbetweentheincreasin2speedandthelargestincreasingrateof1ignincontemsandmelevelofcultivarsresistance．ThetotalDhenolicscontentsinrootsandleavesofaHcul“varsincreasedaRerinoculation．ThetotaIDhen01icscomentsinrootsandleaveofresistantcultivarsandmiddle-resistantcultivarappearedpeakattheseconddayandthesixth4 dayrespectivelyandthe矗rstpeakvaluewaslargerthant11esecond．Thetotalphenolicscontentsinrootsandleavesofsusceptiblecultivarappeared血epeakatmefbunhandthepeakvaluewaslowerthanthatofothersobviously．Thechangedisciplinarianoftotalphen01icscontentswaSalmostsameasthatofthePALactivitv．ThetotalphenolicscontentsinrootsandleavesofallcultivarswerealwayshigherthanthoseofCKaRerinoculationandtherewasaDositivecorrelationbetweenⅡlepeakvalueoftotalphen01icscontentsandthelevelofcultivarsresistance．So，tllelignincontentandtotal曲enolicscomentofbodyoftomatocouldbeusedasphysiologicalandbiochemicalguidelinesofthetomatorcsistancetobacterialwiltanerinoculationwithR．sD肠"日c已c7r“聊．TherewerenochangesatisozvmespectranumbersofPODinrootsandleavesofresistantcultivarsandmiddle—resistantcultivarafterinoculation．whiletheisozvmeSpectraofPPO口roducedanewband．Theisozymespec订aofPODinmotsa11dleavesofsusceptiblecultivarproducedanewband，whiletheisozymespectmofPPOproducedtwonewbands．TheisozymespectraofSODinrootsandleavesofresistantcultivarsandsusceptiblecultivarpmducedtwonewbands．TheisozymespectraofSODinrootofmiddle-resistantculth艄Droducedthreenewbands，whiletheisozvmespectraofSODinleaveproducedtwonewbandsKeywOrdstomato尺日拈，D门缸占D肠ndcP∥“脚resistanceidentificationdefen出呲enz)rmeslignintotalphenolicsisozyme 引言番茄细菌性青枯病是由青枯菌(忍』srD仃妇sD』a门acPar删)所引起的世界范围内发生的重要病害川。该病害在我国各地区番茄上都有严重危害，是番茄生产上的最重要病害之一，一般田块发病率为25％一30％，严重者达80％一100％，甚至全田枯死，给番茄生产造成重大的经济损失，已成为番茄生产上的重要障碍【2】。目前生产上主要是采用抗病品种和轮作等农业措施来防治青枯病，但由于受到各种条件的限制，防治效果仍很不理想。例如曾经是防治青枯病有效措施的农业轮作由于人多地少、耕地有限而受到极大的限制p1；利用抗病品种虽是防治青枯病最为经济有效的途径，但番茄抗青枯病材料很难收集，目前大多从野生番茄中获得抗源，如夏威夷的“Kewaio”、美国北卡莱纳的“Venus”和“Saturm”等都是从野生番茄作抗性亲本而育成的。广东省农科院蔬菜所曾引进不少抗病材料，但这些材料多数为小果型或野生型，能直接利用的很少，目前已育成的抗青枯病番茄品种有丰顺、夏星、粤红玉、粤星等，已成为华南地区的主栽品种【4】，但尚未大面积推广应用；大量使用化学农药造成环境污染且至今还没有一种化学农药可有效地控制青枯病的发生，因此探索防治青枯病的新方法和新技术，对防治番茄青枯病具有重要的现实意义。1植物细菌性青枯病研究概况1．1青枯病的发生与为害植物细菌性青枯病是一种世界性分布的毁灭性病害，在炎热、多雨、潮湿的热带、亚热带和温带的地区普遍流行。我国台湾及长江流域各省均有发生，尤以四川、浙江、福建、江西、湖南、广东、广西等省区发病严重。青枯病菌的寄主范围很广，可危害50多个科，数百种植物pJ，包括农作物、果树、林木、花卉、药材、牧草、杂草等许多具有重要经济价值的木本和草本植物，造成严重的经济损失Ⅲ。细菌性青枯病是一种土传性维管束系统侵染病害，被侵染植株初期茎叶白天萎垂，傍晚恢复，数天后整株枯死，但仍呈青绿色，天气潮湿时，病株出现由水渍状变为褐色的斑块，病茎维管束变褐，用手挤压有乳白色菌液溢出【6，7】。1．2青枯菌的分类地位与亚分类植物细菌性青枯菌最早是由E．F．Smith鉴定并定名为茄青枯假单胞菌(风口u出肋加占sDJa门ac∞，删E．F．Smith)。该名沿用了百余年，Yabuuchi等【8】根据DNA—DNA、DNA—RNA分子杂交，以同源性分析为基础将其纳入伯赫氏属(毖，舳D』幽，妇sD』a门ac朗，唧(Smith．1896))。随后又通过大最工作，对16SrRNA基因组序列测定和聚类分析，Yabuuchi等吲又建议成立一个新属一拉尔氏属tRalstonja)。烙B，soianacearum0S蚀ith，、896)，Burkhoiderpjckettij昶卅』∞』j卵门船eut"印斤“占列入此属，该分类变化已被IJSB(国际细菌学杂志)认可 Ⅲ一12)。青枯菌又可分为许多个复杂的菌系，目前己形成两个国际公认的亚分类系统。一是根据寄主范围将其划分为5个生理小神：1号小种危害多数茄科植物，包括番茄、马铃薯、茄子、烟草等，还危害其它科植物；2号小种危害三倍体香蕉、海里康和大蕉；3号小种主要危害马铃薯，也可弱侵染番茄和烟草；4号小种侵染姜以及弱侵染马铃薯、番茄等其它植物；5号小种对桑的致病力很强，但对番茄、马铃薯、茄子、龙葵和辣椒的致病力很弱，对普通烟、花生、芝麻、甘薯和姜则不致病⋯2_141。二是根据不同菌株对3种双糖和3种己醇氧化产酸能力的差异，将其划分为5个生化变种(见表1)。生理小种与生化变种之间无绝对关系，但生理小种3只含生化变种2㈣151。表1生化变种的划分⋯。最Ⅺ啊、能般化菜种帮或酣：“+”最日i畦氧化浆种研或孵。1．3寄主植物一青枯菌相互作用机制【l，lo'1”2】寄主植物一青枯菌相互作用机制是目前国际上研究的热点。青枯菌的致病机制非常复杂，存在着如胞外多糖(EPS)、胞外蛋白(主要是聚半乳糖醛酸酶(PG)和纤维素酶(EG))、运动性等多个与致病相关的因素。对于这些因素的研究有助于了解青枯菌与寄主植物的相互关系，从而为控制青枯病的发生、为害提供理论依据。目前较为一致的观点是：①EPS是致病的重要因子，但不是难一的，其能阻塞导管，特别易于对叶柄结和小叶处较小孔径的导管穿孔板造成堵塞，影响和阻碍体内水分运输，从而引起植株萎焉。另有人认为EPS主要通过影响病菌在植株体内的系统定殖。而对青枯菌的致病性起间接作用，此外EPS还可阻止青枯菌菌毛和植物细胞壁结合，从而不能激发寄主的防卫反应。然而也有人对EPs的致病重要性持相反观点。②PG和EG两种酶在青桔菌致病中有一定作用。已经清楚的是EG能影晌病害的发展速度，而PG是青枯菌迅速侵入植物根系和体内定殖所必须的【24l，但它们在致病中的真正作用还未完全弄清。除此之外，运动性通常被看作是细菌毒性的一种决定因子。JulieTans—Kersten等(2001)研究番茄青枯野生菌株K60的鞭毛缺失突变体对番茄的致病过程，发现K60在植株体内几乎不运动，但游泳运动对其早期侵染植株及体内定殖是十分重要的。然而，是soJa舱c的删菌系十分复杂，部分野生型菌株并不具鞭毛，其游动 性与毒性之间也许并不存在严格的关系。2番茄对青枯病的抗病性鉴定及抗病机制的研究2．1接种方法和接种浓度[7∞’361目前常用的接种方法除伤根菌液灌注法(soildrenching)、毛细管刺茎渗透法(Micropipettetechnique)、剪叶接种法(clipleaftechnique)外，还有浸根法和离体水培法等。李海涛较为全面地研究了番茄对青枯病的最适抗病鉴定方法，认为幼苗伤根灌注法和浸根法均是番茄幼苗期适宜的抗病性鉴定方法，但前者较后者更经济、省力，是抗病性鉴定的首选方法。关于接种浓度，不同的研究者使用不同的浓度，没有统一的标准，但大多数人都用1×108～3x109cFU／ml的菌悬液进行接种处理。2．2接种时期及病情调查时期∞24，32】林维英认为无论成株期还是苗期，接种效果一样，但苗期接种比成株期发病快，调查时期为接种后9～10天，成株期为接种后18天。李华平发现抗病品种苗龄3星期和7星期植株的抗性是各自独立的，苗龄7星期的抗病水平不能说明苗龄3星期的抗病程度，反之亦然。认为番茄不同龄期抗病或感病依品系不同而不同，抗病性鉴定应分别测定植株苗期和成株期的抗性。李海涛认为采用伤根灌注法接种的最佳时期为苗龄20天，幼苗2叶期接种能够有效的筛选抗性材料，与4—5叶期接种相比，接种时间提前，但结果是一致的。虽然多数番茄个体苗期抗性和成株期抗性具一致性，但苗期鉴定尚不能取代成株期鉴定，只有将二者结合，才能选育出抗性材料。winstead等认为番茄品系对青枯病具有阶段抗性，即番茄品系(种)在苗龄4星期以前高度感病，只有在苗龄4星期以后才表现出明显抗性。Quezado认为具有6片完全叶的番茄是进行抗性鉴定的最佳时期。2．3番茄抗青枯病机制的研究乐素菊【27】对接菌后的番茄主根进行显微观察表明抗性材料大导管分子较短，筛板相对较多，感病材料大导管分子较长，筛板相对较少。筛板在两个导管细胞之间起着过滤或障隔作用。抗性材料的多筛板结构能减缓菌体的繁殖和扩展。同时发现抗性材料的根部组织与病菌有粘连现象，对菌体的繁殖和扩展起着缓减作用，而感病材料这种粘连不明显，病菌可存在于皮层薄壁细胞间隙，瓦解细胞壁，形成溶生腔。在侵染初期，抗、感材料的侵染率差异不大，但96小时后，病菌对感病材料的侵染率比抗病材料高得多。Grimault[37】发现病菌侵入番茄的导管后，抗、感品种的反应不同，抗性品种迅速形成侵填体，堵塞有病菌定殖的导管，限制病菌的发展，而感病品种有病菌定殖的导管未形成侵填体，细菌的扩展不受限制。王卉【38】电镜观察发现，青枯病菌强致病力菌株和弱致病力菌株都能从抗、感品种的幼根表面细胞间的间隙及根表自然 伤口侵入。当强致病力菌株侵入感病品种后，菌体能大量存活在感病品种的细胞间隙，并降解细胞壁、破坏原生质膜。反之，在抗病品种内，入侵的青枯病菌则被幼根细胞周围的浓密物质所包围，而阻止病菌的活动。认为抗性机制在于抑制病菌在根部增殖，而与根部对病菌吸附无关。汪国平口9J研究了离体番茄材料的肼胝体对青枯病菌的反应，跟感病材料相比，抗性材料的肼胝体迅速变褐、瓦解。Vasse【40l研究了病原菌对番茄根部的侵入，认为致病菌能侵入到内皮层和维管束中，非致病菌能侵入到内皮层，但在维管束中未发现病菌。Grimault⋯通过根部伤口接种比较了茄子、辣椒和番茄在抗性机制方面的差异，在较低接种浓度时，所有植株均表现为潜伏侵染，番茄和茄子能减少病菌在根部和茎中的定殖，而辣椒体内的病菌量比番茄和茄子的病菌量都高，表明番茄和茄子有相同的抗青枯病机制，而辣椒比它们更耐病。Grimault㈣还利用嫁接技术调查番茄的抗青枯病机制，将抗性接穗嫁接在感病砧木上，并没有比感病品种表现更好的抗性。对感病品种和抗病品种根部病菌的定殖率和病菌密度检测，发现品种的抗性和植株的根部及茎基部限制病菌的扩展有关。G“mault在一些抗青枯病品种和感青枯病品种的茎部均发现大量青枯病菌。证实青枯菌能侵入到抗性品种的木质素导管中，但这些抗性植株均无萎焉症状，说明抗性材料维管束组织具忍耐高浓度病菌的能力。GopinathmJ用抗病番茄和感病番茄杂交，跟抗性有关的糖及酚的含量增加。RaheemI“J用Pendimethalin或Metribuain处理番茄种子及在苗期接种sc。，c由叮“sjj和工删f丑6j』js能诱导番茄碱含量增加。番茄碱的提取物能减缓青枯菌的生长，减缓程度和番茄碱的浓度成正比。Hanudin【451研究表明高蛋白植株比低蛋白植株更易感病。sitaramaiah【46】研究认为根部酚的浓度和发病程度无关。3植物抗病性3．1植物抗病性表现【4”植物在其生长发育过程中常受到某些病原物的侵袭，常表现为感病或抗病两大类，在长期的相互作用、相互适应、相互选择乃至协同进化的过程中，植物逐渐获得了一系列复杂的防御机制来保护自己，使得植物的抗病性与病原物致病性之间达到某种形式的动态平衡，减轻病害的危害程度。一方面，植物自身的某些物理结构与化学成分具有抗病功效，前者如细胞壁的角质、蜡质、栓质、木质素，特殊的气孔、水孔、皮孔结构等；后者如产生抑制病原物生长的细胞壁成分，合成小分子抑菌物质如植保素，毒性酚类小分子化合物；诱导产生各种病程相关蛋白(PR蛋白)如几丁质酶、葡聚糖酶等；蛋白酶抑制剂的生成。另一方面，植物在受到病原物侵染时通过诱导产生的防卫反应抗病，主要包括释放各种活性氧、表达防卫基因以及发生过敏性反应(HR)等。3．2植物抗病机制 一般说来，植物对病原菌主要采用两种方式保护自己：一种是结构的特征，用物理的障碍物作用，抑制病原菌的侵入和在植物体内扩散：另一种在植物细胞和组织中发生生化反应，在植物体内造成不适于病原菌生长或生存的环境。在植物的防御机制中，结构的特征和生化反应的组合因寄主一病原菌系统而异。而在同一寄主和病原菌之间，又随植物年龄、植物器官的种类和营养状况、生态条件等不同而存在差异。3．2．1形态结构抗性3．2．1．1固有的形态结构抗性植物对病原菌最初防御的场所在植物表面，有的防御结构在与病原菌接触以前已在植物中存在。通常这些结构是大量蜡质和覆盖表皮细胞的角质层，表皮细胞的结构、大小、位置，气孔、水孔、皮孔的形态和厚壁细胞的存在等都可阻挡病原菌的侵入。在叶片、果实、枝条的表面，蜡质形成防水层，避免了病原菌附着、侵入、萌发或增殖。病原菌直接穿透寄主组织时，角质层起增强抗病性的作用【48'4叭。表皮细胞外壁的厚度和硬度也是重要的抗病因子之一。除了这些结构外．木质部、维管束、叶脉的厚壁组织也可有效地阻碍病原菌的扩展【50‘5引。3．2．1．2诱导的形态结构抗性病原菌侵染寄主后所诱导的防御结构可分为4个类型：(1)组织学的防御结构。在病原菌侵入部分的植物组织产生的防御结构【5””。在感染部位病原菌分泌代谢物质刺激植物形成几层木栓层，它可抑制病原菌的扩展和病原菌分泌的毒素物质扩散，阻止健全部分的营养物质和水分向感染部位流动。植物形成离层也是防御结构之一，因它抛弃感病部位，保护剩余健康部分的组织。侵填体在病原菌扩散的同时也在寄主感染部位大量快速形成，防止病原菌的继续扩展。植物胶在感染部位细胞的周围或在细胞之『白：J的空隙迅速沉积，形成病原菌难以贯穿的障碍物，导致病原菌孤立、饥饿并死亡。(2)细胞的防御结构。这种结构有3类：①与病原菌接触的细胞壁外层产生胖挺现象，伴随着形成非晶态物质，这些物质包围病原菌，防止扩散：②细胞壁强度增大；③病原菌侵入寄主后，其所在细胞壁内部胝质物质所包围，之后注入酚类物质，在菌体周围形成鞘状物质或木质化结构。(3)细胞质的防御结构。它是在病原菌攻击时，寄主细胞质中发生的防御反应。受感染细胞的细胞质变为颗粒状。由于缺乏营养物质，菌体被分解，其侵染停止。(4)过敏性坏死反应。病原菌侵入寄主后，感染细胞立即死亡，以防止病菌的生长，保护植物自身【5s，”J。3．2．2生理生化抗性3．2．2．1固有的生理生化抗性固有的生化抗性可分为3种类型：(1)植物释放的抑菌物质。(2)必需因素缺乏的防御。它是寄主与病原菌之间识别因素、寄主受体、寄主感受部位及供病原菌生存营养物质的缺乏。(3)存在于植物细胞内的抑制剂。它们主要是酚类化合物，如单宁，番茄 素和燕麦镰孢菌素掣6㈦⋯。在植物体内也存在降解病原菌细胞壁的水解酶类，如几丁质酶与葡聚糖酶等。3．2．2．2诱导的生化抗性诱导的生化抗性可分为如下8个类型：(1)过敏性反应(HR)发生时，伴随细胞质膜完全性的丧失，细胞呼吸增强，酚类化合物氧化并积累以及植保素的合成№57】；(2)植物细胞内存在的抑制剂酚类化合物在病原菌侵染后，其合成与积累加速。如绿原酸、咖啡酸和东莨菪苷原等，这类化合物称为普通酚类化合物【6习：(3)有的酚类化合物只在植物感染后，受病原菌刺激时才出现。如菜豆的菜豆蛋白．豌豆的豌豆素，棉花的棉子酚等，这类化合物称为植保素【6¨8】：(4)大多数植物含有无毒性的配糖体物质，它是由葡萄糖和酚类物质或其他分子构成。当病原菌侵染植物后，寄主的糖苷酶被激活，糖苷酶分解成配糖体，从而释放出酚类化合物【69’”】；(5)病原菌侵染植物后，抗病品种的酚类氧化酶活性高于感病品种。多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)都能氧化酚类化合物和促进类似木质素物质的聚合作用，这种聚合物在细胞中沉积，抑制病原菌生长与扩展【s8，71-74】；(6)超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(PoD)、过氧化氢酶(CAT)是细胞抵御活性氧伤害的保护酶系统，与植物的抗病性反应密切相关；丙二醛(MDA)是脂质过氧化作用的主要产物之一，它的积累是活性氧毒害作用的表现，可作为膜脂过氧化作用的一种指标。SoD是生物体内一种重要的活性氧清除剂，是防止氧自由基对细胞膜系统伤害的保护酶。PoD与CAT均有分解H。0：、消除细胞内过多H：仉的作用，从而保护膜的结构。PoD还可以催化许多化合物如脂肪酸、芳香胺和酚类物质的氧化，参与乙烯的合成，催化木质素前体的形成及细胞壁碳水化合物与蛋白质共价键的形成。PPO参与植株体内酚类物质氧化形成醌的保卫反应，能使一元酚与二元酚氧化成醌，在植物对病原菌侵染的防卫反应中起着重要作用。因此，这些酶的活性高低与植物抵抗包括病害在内的逆境的能力有着十分密切的关系【7。⋯。(7)病原菌的攻击引起植物体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)合成的变化，寄主感染时大量合成新的PAL，而且PAL的活性也增强。PAL是植保素与木质素合成的关键酶【69’70】。(8)在植物体内被诱发的萎蔫酸等物质也在抗病反应中起重要作用。这些物质通过特别的代谢过程使病原菌的毒素变为无毒的化合物【80'“J。4研究目的及意义番茄青枯病的防治仍是一大难题，从目前的情况看，要解决这一难题需结合多条措施综合治理，但选育抗病品种是最经济有效的途径。然而，番茄抗青枯病材料很难收集，目前大多从野生番茄中获得抗源。安徽农业大学植保系黄业东老师多年来一直致力于番茄抗青枯病育种工作，选育出了黄山l号和黄山2号抗青枯病新品系，基于此，本研究对这两个品系进行苗期和成株期的抗青枯病鉴定，以确定这两个新品系对青枯病的抗性，为大面积推广这两个抗青枯病新品系提供试验依据。 目前，对番茄抗青秸病的机制知之甚少，虽然前人在这方面作了不少工作，对番茄形态结构抗性机制也有了一定的了解，但对番茄生理生化抗性机制的研究却很少。现在，青枯菌的基因组全序列已被完全测定【821，这将有助于彻底搞清青枯菌的致病机制，也将促进对番茄抗青枯病机制的研究。近几十年以来，植病学者开始注意到植物抗病的本质问题，认识到植物的保护反应是复杂的新陈代谢过程，对病原物侵入及扩展的生理反应是以酶的催化活动而实现的。黄齐望认为植物和寄生物相互作用中化学物质是生理活性物质的基础。植物的抗病生理生化机制很复杂，植物体内正常情况下保护酶系处干平衡状态，而受病原物侵染后活性大大改变。这表明植株体内保护酶系都是在与病原物的互作中，主要是经病原物诱导而起抗病作用的。因而，在病原菌侵染初期测定保护酶系的变化可以作为一个选育指标：而J下常植株酶活性的高低也可作为品种筛选的指标之一。故研究番茄抗感品种(系)接种青枯菌前后几种酶活性及同工酶的变化，可预测番茄对青枯病的抗性水平，以便有选择地进行繁殖和再生工作，减少了盲目性，提高了工作效率，同时也将推动与抗青枯病有关的其它生理生化指标的研究和番茄抗青枯病机制的研究。 材料与方法1试验材料1．1供试菌株供试青枯菌共6个菌株，分别采自岩寺、合肥、和县、淮南、阜阳，其中淮南2个菌株，～个分离自番茄，另一个分离自辣椒，其余菌株均分离自番茄，6个菌株分别以Ys、HF、Hx、HNl、HN2、FY表示。样本的采集、菌株的分离、培养与保存参照方中达f3】(1998)的方法。1．2供试番茄品种(系)新星(广东省农科院蔬菜研究所)、夏钻石(广州市华农大会田良种有限公司)、黄山1号和黄山2号(由安徽农业大学植保系病理教研室黄业东老师提供)、强丰(合肥市种子公司)。1．3供试培养基【3】(1)NA培养基牛肉浸膏3克酵母浸膏1克蛋白胨5克葡萄糖10克琼脂18克蒸馏水looOmlpH7．O(2)TTc培养基蛋白胨10克酪朊水解物1克葡萄糖5克琼脂15克蒸馏水1000m1pH7．O酸度调节到约pH7．O，分装，灭菌(12l℃)15min。加过滤灭菌的1％的2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)的水溶液到冷却至55℃左右的灭菌培养基中，使最终浓度达到0．00j％。2试剂与仪器21仪器设备与器具755B分光光度计，比色皿，超低温冷冻离心机．离心管，恒温水浴锅，冰盒， 研钵，吸管，冷冻冰箱，DYY一Ⅱl系列多用途电泳仪、电泳槽(北京六一仪器厂)，方、凹玻璃板，板条，琼脂槽，胶室支架，挂冰槽，梳子，长针头注射器，长针头，容量瓶，三角瓶，量筒，烧杯，托盘天平，电子天平，微量迸液器，试管架，试管，广口瓶，磁力搅拌器，秒表，烘箱。电炉。2．2主要试剂麦芽糖，乳糖，纤维二糖，甘露醇，山梨醇，甜醇，1％的果胶溶液，1NNa2c03溶液，0．1M12一KI溶液，2NH2s04溶液，O．05NNa2s203溶液，液氮，O．1mol几pH8．8的硼酸缓冲液，0．Olm01几pH8．8的硼酸缓冲液，O．02mol／L苯丙氨酸，6【f【ol几盐酸，O．02mol儿pH6．0的磷酸盐缓冲液，0．1mol几pH6．O的磷酸盐缓冲液，愈创木酚，30％过氧化氢，O．05mol／LpH6．0的磷酸缓冲液，0．1m01／L邻苯二酚，lO％磷酸，0．05m01／LpH7．8的磷酸缓冲液，甲硫氨酸，氯化硝基四氮蓝(NBT)，EDTA—Na。，核黄素，O．051l】01几pH7．O的磷酸缓冲液，pH8．3Tris—Gly电极缓冲液，联苯胺溶液(O．29联苯胺+1．5ml冰醋酸+8．5ml蒸馏水)，5％EDTA溶液．4％NH。cl溶液，O．3％H：0：溶液，0．01『fIol／L邻苯二酚一O．2mol几磷酸钾(pH7．0)一O．05％对苯二胺，0．01mol／LVc，2．5×10、’mol／LNBT，2．8×10—m。1／L核黄素，2．8×10一“m01几EDTA，3．6×10～m01／LpH7．8磷酸钠缓冲液，0．75％可溶性淀粉，1％醋酸，0．1mol／LpH7．0磷酸缓冲液，O．06mol／L硫代硫酸钠，3％H。O。，O．23m01／LKI溶液，1％HCl，甲醇，丙酮，72％硫酸，O．05mol／L重铬酸钾一硫酸，0．5m01／L硫代硫酸钠。3试验方法3．1青枯菌的分离、培养和保存[23】将新鲜的初发病的番茄植株茎基部消毒后。剥去表皮，露出褐变的维管束，用灭菌的剪刀剪下病组织，放入无菌水中约半小时后，将病组织取出，此悬浊液作为病原菌的分离源。采用划线分离法，原液稀释10倍，用移植环蘸取菌液在TTc培养基上划蛇形线，同时接种3个培养皿，在30℃下恒温培养48小时后，菌落呈不规则圆形，乳白色，中心部位淡红色，具有流动性，此菌落致病性强。青枯病菌用无菌水长期保存，既简便又不易发生变异。分离后的病原菌，用移植环蘸取菌落中间淡红色部分，轻轻放入盛无菌水的试管，加塞放入4℃恒温冰箱中可保存1年时间。20m1无菌水中放入l移植环菌源，菌的浓度大约10卜8CFU／m1的条件下适合保存。3，2致病性测犁”J·3．2．1过敏性反应将培养48小时的青枯菌配制成107～108CFu／m1的菌悬液，用无菌注射针将菌悬液从烟草下表皮注入普通烟叶肉细胞间，以无菌水为对照。接种的烟草植株保持在25℃左右，相对湿度85％，F1照16小时条件下，24小时内出现枯斑的为阳性反应。 3．2．2常规致病性测定【3J将培养48小时的青枯菌配制成3×108CFu／m1的菌悬液，用伤根接种法接种苗龄为6周的强丰，每个菌株接种10株，每处理重复3次。接静后，将番茄置于30℃的光照培养箱中，每天浇水保湿，接种2周后调查发病株率。3．3青枯菌生化变种的测定㈣将3种双糖(麦芽糖、乳糖、纤维二糖)和3种己醇(甘露醇、山梨醇、甜醇)6种化合物，按Hayward的方法，配成10％溶液，灭菌后分别加入基础培养基，最终浓度为1％。将各菌株分别在NA平板上划线培养48小时，用灭菌水稀成浓度为3×lO℃FU／ml的菌悬液，分别接种含糖醇基础培养基中，每菌株每种糖醇基础培养基接种3管。并设不接菌空白对照1管，重复3次。接种后嚣于28℃温箱中培养2ld，观察各菌株对6种糖醇化合物的利用情况，按Hayward的划分标准，确定菌株的生化型。3．4青枯菌胞外酶活性的测定【84】3．4．1粗酶液的制备各菌株在TTc培养基上培养48h，挑取毒性菌落在NA斜面上培养48h，用无菌水配成3×108CFu／m1的菌悬液，取4ml菌悬液接种于loomlNB培养液中，于30℃下120rpm振荡培养，培养1、3、5、7、9天后每菌株分别取10ml，于100009离心10min去除细菌菌体，得细菌培养上清液，放入冰箱备用。3．4．2酶活性的测定3．4．2．1果胶酶活性的测定在50℃恒温条件下，编号空白管与样品管。在空白管中加入10mll％的果胶溶液与10ml去离子水，在各个样品管中加入10m11％的果胶溶液，5ml去离子水和5ml待测酶液，反应总体积为20ml。然后在50℃水浴中保温2h。取5ml反应液加热煮沸，使酶灭活。冷却后将反应液倒入50m1三角瓶中，分别加入lmllNNa2C03，5m10．1M12一KI溶液，摇匀，加塞于室温下放置20min。再加2ml2NH2S04，摇匀，用O。05NNa2S203滴定至淡黄色，再加0．5％淀粉指示剂1ml，继续滴定至蓝色消失为止。记录标准Na2S203溶液的总用量：装有样品管中所消耗的Na2S203毫升数为A，空白管中所消耗的Na2s203毫升数为B。酶单位定义：在上述实验中，每小时释放lmM的还原基为一个活力单位。1U恤l=((B—A)N×O．5l×20)／(5×2×S)B为空白管所消耗的Na2S203的毫升数：A为样品管所消耗的Na2s203的毫升数；N为Na2S203当量浓度： 5为样品管中酶液毫升数；2为酶反应时间；s为吸取反应液的毫升数：O．5l为常数，即1毫克当量的Na2s203相当于O．51毫克当量的游离半乳糖醛酸。3+4．2．2纤维素酶活性的测定在40℃恒温条件下，取试管分别编号为空白管、样品管、标准空白管和标准管。先向标准管中加入葡萄糖标准溶液O．5m1，然后向空白管和样品管中各加入1ml待测酶液，再向空白管、样品管、标准空白管和标准管中分别加入imi，Iml，2ml，1．5mi的乙酸缓冲液，最后立即向各个样品管中加入6片新华一号中速层析滤纸(1×1cm2)，混合均匀后置40℃水浴中准确保温反应60min，立即取出。再加热煮沸10min，冷却后，分别在各试管中加入3，5一二硝基水杨酸显色剂3m1，在空白管中加入6片新华一号中速层析滤纸(1×1cm2)。然后将各试管置沸水浴中加热15min，冷却后分别在各管中加去离子水10ml并混匀，最后在550m波长处读0D瓠OD％OD镕，，0D#。酶活力定义：在40℃，每分钟催化分解滤纸产生相当于1微克分子葡萄糖的还原糖的酶量为1个酶活力单位。¨I，。l-(OD”OD2)×标准管中含葡萄糖的umol数(OD“．OD#2)×60×反应管中酶液m1数3．5番茄对青枯病的抗病性鉴定接种全部使用致病性最强的HF菌株。3．5．1苗期抗病性鉴定【23】处理设置：每个品种(系)为一个处理，每处理重复3次，以清水接种作为对照。病菌接种方法：增殖培养后的菌液稀释10倍镜检，菌液浓度确定为3×108cFu／m1。青枯病菌用无菌水调制成悬浊液。接种病菌前，在幼苗的一侧，距根1cm处用刀划3—5cm深沟断根，用50ml小烧杯定量取菌液，在断根侧灌注菌液，lO株灌注50ml(每株灌注菌液5ml左右)。接种后，喷清水洗净叶面，并在接种沟处少浇些水以增加湿度。以后每天浇水保持土壤湿润，不能忽干忽湿。病情调查方法：分别于接种后1星期、2星期、3星期进行发病调查。调查时以株为单位进行发病调查，把枯死植株拔掉，记录无病植株数，计算发病株率，以发病株率确定试验材料的抗性水平。抗性水平的划分方法【23J为：发病株率O～20％的为抗病；21％～40％的为中抗：41％～60％的为耐病；61％～100％的为感病。栽培概况：将种子催芽，于2003年6月29日在温室苗床播种。播种前对土壤进行高温闷和暴晒处理。各品种(系)7月1只均完全出苗，7月9同间苗。7月23日接种，分别于7月30R、8月6同、8月13同进行发病调查，8月14F1试验结束。3．5．2成株期抗病性鉴定【23j处理设置；每个品种(系)为一个处理，每处理重复2次，以清水接种为对照。病菌接种方法：将增殖培养后的菌液稀释10倍镜检，菌液浓度确定为6×108 cFu／ml。青枯病菌用无菌水调制成悬浊液。接种病菌前，在番茄成株(进入开花盛期)根的一侧，距根5cm处用刀划10cm深沟断根，用50m1小烧杯定量取菌液，在断根侧灌注菌液，每株灌注50m1。接种后，在接种沟处少浇些水以增加湿度。以后每天浇水保持土壤湿润，不能忽干忽湿。调查方法：接种后，从第9天开始每隔3天调查一次，调查记载植株枯死数，枯死的植株调查后不拔掉。接种青枯菌后9天内枯死植株抗性指数为l，以后每隔3天加1分。最强的抗性指数为13，超过13的按13计算，最弱的抗性指数为l。统计时，先计算单株的相应得分，然后计算抗性指数，根据抗性指数确定试验材料的抗性水平。抗性水平的划分方法【23】为：抗性指数l～4．9为感病品种(系)，5～9．9为中抗品种(系)，10～13为抗病品种(系)。计算方法：抗性指数：∑(桔死株数×相应得分)／总株数栽培概况：番茄种子催芽后，2003年3月12日播种于温室苗床，4月15日假植，5月2日定植，6月10日接种，接种后进行发病调查。3．6番茄抗青枯病的生理生化机制3．6．1酶活性测定试验材料：使用抗病性鉴定试验中的植株。苗期抗病性鉴定中，接种前每个品种(系)各取2株，接种后分别于1、3、5、7天每个品种(系)处理组和对照组各取2株，以叶片作为试验材料；成株期抗病性鉴定中，接种前每个品种(系)取l株，接种后分别于2、4、6、8、10天每个品种(系)处理组和对照组各取1株，以根和叶片作为试验材料。各处理每个样品重复3次，取平均值。3．6．1．1过氧化物酶(PoD)的提取及活性测定参照张龙翔等185】(1997)方法稍有改动，提取并测定POD活性的步骤如下：(1)酶液提取：取试验材料19，加入少量液氨研磨成粉末，加入5m10．02mol／L的磷酸盐缓冲液(pH6．O)后转移至离心管中，在12000转／分下离心3min，上清液即为酶粗提液，贮于冰箱备用。(2)配制反应混合液：配制0．1mol几磷酸盐缓冲液(pH6．0)50m1于烧杯中，加入愈创木酚28斗l，于磁力搅拌器上搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19肛1混合均匀，保存于冰箱中。(3)测定：取光径1cm的比色皿2只，在1只比色皿中加入反应混合液3ml，磷酸盐缓冲液lml，作为校零对照。另1只比色皿中加入反应混台液3ml，取上述酶液Iml，立即丌启秒表计时，用分光光度计于470nrfI处测定吸光值，每隔1min读数一次，以每分钟吸光度变化值，即oD盯。变化值大小表示为一个酶活力单位。活性变化率(％)=(E。一E0)／E0×100E；一接种处理组酶活性；E。．一未接种CK的酶活性。以下同。 3．6．1．2多酚氧化酶(PPO)的提取及活力测定参照朱广廉等[86】(1990)方法稍有改动，提取并测定PP0活性的步骤如下：(1)酶液提取：取试验材料19，加少量液氮研磨成粉末，加入5ml的O．05m01／L磷酸缓冲液(pH6．O)，于l0000转／分下离心20min，上清液即为酶粗提液，贮于冰箱备用。(2)测定：取上述酶液O．2ml，加3．5ml的磷酸缓冲液，O．1mol／L邻苯二酚1m1混匀后嚣30℃水浴反应30min，立即用10％磷酸终止酶反应，用分光光度计于525硼处测定吸光值，以0Ds。n值变化O．0191Fwminl为一个酶活力单位，以沸水煮失活酶液为对照。3．6．1．3苯丙氨酸解氨酶(PAL)的提取及活性测定参照薛应龙【87】(1983)方法提取并测定PAL活性，步骤如下：(1)酶液提取：取试验材料lg，加入少量液氦研磨成粉末，加入5ml的硼酸缓冲液(O．1mol几，pH8．8，含巯基乙醇2mm01几)，经4层纱布过滤后．在10000转／分下离心20min，上清液做酶活力测定。(2)测定：取上述酶液O．2m1，加2m1的O．01m01几硼酸缓冲液，1m10．02m01几苯丙氨酸．1m1蒸馏水混匀后置30℃水浴反应60min，用6mol几盐酸0．2ml终止反应，用分光光度计于290nm处测定吸光值，以oD：。值变化0．0191Fwh。1为一个酶活力单位。3．6．1．4超氧化物岐化酶(SOD)的提取及活性测定参照张宪政等【s81(1994)的方法提取粗酶液，并按Giannopolitis和Ries(1977)方法略作改动测定sOD活性步骤如下：(1)酶液提取：取试验材料lg，加少量液氮研磨成粉末，加入5m1的0．05mol几的磷酸缓冲液(pH7．8)，在4℃下以13000转／分离心20min，上清液即为酶粗提液，贮于冰箱备用。(2)活性测定：3ml反应液中含甲硫氨酸15锄ol／L、氯化硝基四氮蓝(NBT)65岫ol／L、10姗01几EDTA—Na。、核黄素2．0№ol几和50mmol／L的pH7．8磷酸缓冲液。加入200m酶液后在25℃，4000lx的光照15min后于黑暗下终止反应，立即在560nm下测定光密度(吸光值A)，以缓冲液代替酶液作空白对照。酶活性采用抑制NBT光化学还原50％的酶液量为一个酶活性单位。sOD活性=2(0D。空白—0D。。处理)×稀释倍数／oDm空白3．6．1．5过氧化氢酶(cAT)的提取及活性测定参照陈利锋等[89】(1997)方法经改动提取并测定CAT活性，步骤如下：(1)酶液提取：取试验材料19，加少量液氮研磨成粉末，加入5ml的0．05mol／L磷酸缓冲液(pH7．0)，在4℃下以10000转／分离心20min，上清液即为酶粗提液，贮于冰箱备用。 (2)测定：在比色皿中加入3m10．05mol几磷酸缓冲液，10m30％H。O：，0．1ml酶液混匀，立即开始计时，用分光光度计于240nm处测定吸光值，每隔1min读数一次，cAT活性以吸光值的降低值(△OD。／gFwmin)来表示。3．6．2生化物质的测定试验材料：使用成株期抗病性鉴定中的植株，接种前每个品种(系)取1株，接种后分别于2、4、6、8、10天每个品种(系)处理组和对照组各取l株，以根和叶片作为试验材料。各处理每个样品重复3次，取平均值。3．6．2．1木质素的提取及含量测定参照x．H．波钦诺克的方法190J(1981)，提取并测定木质素的步骤如下：取试验材料快速干燥后，称取干样O．059，先用1％醋酸、丙酮等分离出水溶性和脂溶性化合物，再用72％硫酸水解除去纤维素和半纤维素，2500r／min离心后倒去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤后，用lOml0．05mol几重铬酸钾一硫酸氧化水解样品中的木质素，过量的重铬酸钾采用碘量法滴定，在终点前加lml淀粉指示剂，然后滴定到绿色，根据标准液的消耗量计算样品中木质素的含量。具体可按下式计算木质素含量：木质素含量(％)=堕掣K：Na：S。SO。的浓度；Dw：样品干重；a：滴定对照液所用0．5mol／LNa：S：S晚体积(m1)；b：滴定样品液所用O．5m01几Na：S：SO，体积(m1)3．6．2．2总酚的提取及含量测定参照庄炳昌等⋯(1993)的方法，提取并测定总酚的步骤如下：称取试验材料O．59剪碎后，加入5ml含1％HCl的甲醇液于4℃提取24h，取lml提取液稀释至50ml，测定oD。，值，以0D。值代表总酚相对含量高低。3．6．3同工酶电泳试验材料：使用成株期抗病性鉴定中接种后第2天的植株，每个品种(系)处理组和对照组各取一株，以根和叶片作为试验材料。采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的同工酶分析技术192。10“。3．6．3．1POD同工酶电泳用lO％的分离胶和4％的浓缩胶，电极缓冲液为PH8．3Tris—Gly，吸取各酶液30u1加样，在4℃下电泳，上层胶电压150v，下层胶电压200v，约7小时。染色液为改良的联苯胺溶液。用联苯胺溶液(O．29联苯胺+1．5m1冰醋酸+8．5ml蒸馏水)10m1。5％EDTA溶液10ml，4％NH。Cl溶液10m1和O．3％H。O：溶液10ml，反应5—10分钟，显带 后用自来水冲洗剩余染色液，拍照。3．6．3．2PP0同工酶电泳分离胶、浓缩胶和电极缓冲液与POD同，加样量30“1，在4℃下电泳，上层胶电压为150v，下层胶电压为250v，电泳约8h。染色液参照李靖等(1991)的方法。用100ml的O．01mol／L邻苯二酚一O．2mol几磷酸钾(pH7．O)一O．05％对苯二胺，染色10min。然后用100mlO．01m01／LVc停止反应。5分钟后流水冲洗2天。显带后拍照。3．6．3．3SOD同工酶电泳用7．O％的分离胶和3．5％的浓缩胶，加样体积为20“1，电泳约4h。染色参照罗广华(1983)的方法。将电泳的凝胶片于黑暗中浸泡在2．5×10一‘mol／LNBT中60min后，再将其移入含2．8×10‘5mol／L核黄素，2．8×10～mol几EDTA，3．6×10一‰ol几DH7．8磷酸钠缓冲液中，在日光灯下照射15min，直至蓝色背景上出现无色透明区带，即sOD同工酶谱带，然后拍照。20 结果与分析1致病性测定1．1过敏性反应经烟草过敏性试验测定，各菌株接种烟草叶片后均出现枯斑，其中HF菌株接种后枯斑出现最早也最典型(见附图1)，其余菌株接种后枯斑出现较晚且较小，而对照叶片未出现任何反应，表明所分离的青枯菌菌株均有致病性，其中HF菌株致病性最强。1。2常规致病性测定常规致病性测定结果如表2所示。从表中可以看出，各菌株致病性存在一定差异，HF菌株致病性最强，番茄发病株率为97％，其次是Hx菌株，番茄发病株率为93％，HNl和HN2两个菌株致病性最差，番茄发病株率分别为63％和67％，显著低于HF和HX2菌株，Ys和FY菌株致病性介于中间，番茄发病株率分别为87％和73％，致病性中等。表2不同菌株致病性比较table2ThecoⅡ1parisonofpaChogenicityofdi丘色rentstrains表中小写字母表示s％显著水平，太写字母表示l‘‘掘显著水平．以下同。2青枯菌生化变种的测定青桔菌生化变种的测定结果如表3所示。结果表明：仅FY菌株不能利用甜醇但能使3种双糖和另外2种己醇产酸，属生化变种III的一个亚型，即III—l；而HF、HNl、HN2、Hx、Ys5个菌株均能利用3种双糖和3种己醇，属生化变种III。 表3不同菌株对3种双糖和3种己醇氧化产酸结果table3Ther℃sultofoxidationofdi丘宅rentstrainsto3bisugarsand3hexoses注：+为产酸．一为不产酸3青枯菌胞外酶活性的测定3．1果胶酶活性的测定结果表4不同菌株果胶酶活性的变化情况(U)table4Thechangesofdi仃erentstrains’PGactiV时注：表中数据为3次重复的平均值，以下同。 各菌株果胶酶活性的测定结果如表4所示。从表中可以看出，各菌株培养1天后果胶酶活性都很低，只有0．0026～O．0038U，此后酶活性迅速升高，并随着培养时间的延长，酶活性逐渐升高，并且各菌株培养7～9天果胶酶活性均达最大值，但酶活性最大值与菌株致病性之间相关性不大(r=O．6371)，所以果胶酶在青枯菌致病过程中的作用还有待于进一步研究。3．2纤维素酶活性的测定结果各菌株纤维素酶活性的测定结果如表5所示。从表中可以看出，随着培养时间的延长，各菌株纤维素酶活性逐渐升高，且各菌株表现一致，培养9天后酶活性均达最大值，并且各菌株酶活性最大值与致病性高度正相关(r=0，9526)，说明纤维素酶与青枯菌的致病过程紧密相关，是青枯菌致病过程中的重要因子。表5不同菌株纤维素酶活性的变化情况(U)table5Thechaflgesofdifrerentstrains’cellulaseactivi移4番茄对青枯病的抗病性鉴定4．1苗期抗病性鉴定番茄苗期伤根菌液灌注法接种鉴定发病株率调查结果如表6，各品种(系)的发病程度比较如图l。从表6和图1可以看出，接种1星期后，供试各品种(系)发病株率都超过60％，，但品种(系)闯存在显著差异，新星的发病株率最低，只有61．1％，强丰最高，为95．2％。随着时间的推移，各品种(系)发病程度逐渐加重，接种2星期后，除新星外，其余各品种(系)发病株率都超过90％，新星的发病株率只有77．8％，品种(系)间存在显著差异。到第3周，除新星外，其余各品种(系)发病株率都接近l0096，强丰已达100％，而新星发病株率仅为83．3％，与其余品种(系)存在显著差异。综合上述三个时期调查结果表明，虽然品种(系)间发病株率存在显著差异， 但各品种(系)均属感病品种(系)。表6番茄青枯病苗期抗病性鉴定结果1hble6Resistanceidemi五cationresuItsoftomatoseedlingtobacterialwilt发病株率(％)品种(系)7月30日8月6日8月13日重复l重复2重复3平均重复l重复2重复3平均重复1重复2重复3平均新星66．772244．461．1aA83．366．777．8aA88．983．377．883，3a夏钻石77，390．981．883．3bB90．995．590．992．4bB95．590．994．0b黄山l号eO．986．487．9bcB95．590，990．992．4bB100．095．590．995．5bE黄山2号90，585．790．588，9bcB95．290．595．293．6bBloo．090．595．295．2bE强丰96．492．996．495．2cB100．096．497．6bB100．0lOO．O100．0c100『g80}薹．藿e。}蒺专no}划％’．苎20-凸0。删棚栅7月30日8月6日8月13日时间口新星团夏钻石口黄山1号口黄山2号■强丰图1番茄苗期发病株率比较Fig．1Comparisonofdiseasedplantincidenceintomatoseedling4．2成株期抗病性鉴定番茄青枯病成株期抗性鉴定结果如表7。从表7可以看出，新星、夏钻石、黄山l号3个品种(系)的抗性指数都很高，分别为12．9、12．3、10．9，均属抗病品种(系)。黄山2号的抗性指数为8．9，属中抗品种(系)。而强丰的抗性指数只有2．5，属感病品种(系)。24 表7番茄青枯病成株期抗性鉴定结果T曲1e7Resistanceidentificationresultsoftomatoadultstobacterialwilt5番茄苗期接种青枯菌后叶片防御酶活性的变化5．1pOD酶活性的变化不同番茄品种(系)接种青枯菌后叶片POD酶活性测定结果如表8所示，未接种cK叶片POD酶活性变化如图2，接种后叶片POD酶活性变化如图3，接种后POD酶活性变化率如图4。表8接种青枯菌后叶片POD酶活性测定结果(△0D儋Fwmin)table8ThevaluesofPODactivityofleaves8Rcfinoculationwith足∞坛玎“∞口，“珑新星CK夏钻石cK黄山l号cK黄山2号cK强丰CK新星夏钻石黄山l号黄山2号15．416．O15，O16415．615．416．015．016417．116．816．215．417．718618．117．417．618．718．517．815．216．221．820．419．018．016．217．3t6．617．615022．621．321．018．717．017．417．518．016．918．319．018，217．9强丰15．617．917．116．415．O25 掣妲容24蓬劳蚓展lU一一‘1一Ol3i7时间(d)TiⅢe+新星CK+夏钻石CK十黄山1号CK*黄山2号CK—*一强丰cK图2未接种cK叶片POD酶活性变化F嘻2PODactiv埘challgesofIe“eswithoutinoculalion10一⋯。1⋯——．_O1357时间(d)Time+新星+夏钻石十黄山l号+黄山2号—*卜强丰i性变化rlg．jruuacuvL叫cnangesofIeaveswithinoculation时闻(d)Time+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号+强丰图4POD活性变化率F幢4cbangeratjoofPODactiv时从图2可以看出，未接种处理各品种(系)叶片PoD酶活性上下波动，没有规律。从图3可以看出，接神后，各品弛(系)叶片P∞酶活性均升高，强丰接种后1天达到酶活性高峰，此后迅速下降，3天后一直低于其余各品种(系)；而新星、夏钻石、黄山l号、黄山2号接种后POD活性持续上升，第5天达到活性高峰，此后缓慢下降，而且各品种(系)峰值的高低与品种(系)苗期感病性呈显著负相关，而与成株期抗性水平呈显著正相关，所以，苗期叶片POD酶活性可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标。从图4可以看出，接种后，除强丰第7天低于对照外，其余各品种(系)叶片POD活性始终高于对照，新星、夏钻石、黄山1号接种后3～5天增幅最大。5天后迅速下降，黄山2号接种后l一3天增幅最大，3天后开始下降．强丰接种后POD活性上升缓慢．增幅一直低于其余各品种(系)，且5天后迅速下降，第7天活性低于对照。宣^l_gool豇“就虬“0“虬口I^#是凸o“苫o；2岛g￡u^gu瓣芒制单蜒Ⅱo(I 5．2PPO酶活性的变化不同番茄品种(系)接种青枯菌后叶片PPO酶活性测定结果如表9所示，未接种CK叶片PP0酶活性变化如图5，接种后叶片PP0酶活性变化如图6，接种后PPO活性变化率如图7。表9接种青枯菌后叶片PPO酶活性测定结果(△OD／gFwmin)table9ThevaluesofPP0activ峙ofleavesa髓rinocuIationwimRsD，口聆dcP酊“m处理处理时间(d)Ol3576一‘～一二0l357时问(d)Time+薪星CK+夏钻石cK+黄山1号CK+黄山2号cK—*卜强丰CK图5未接种cK叶片PP0活性变化F-95PPoactiv时changesofleave3w“houtjnoculation16蚤14萎{他釜210山860l357时间(d)Time+新星+夏钻石十黄山l号+黄山2号—*一毽秦慢柙后盯斤Pru晴活性变化删b慢柙后盯斤Pru晴活性变化Fig．6PPOactiv时ch种gesofleaveswit}linocuIation蝎M挖加0备I^一_篇。山厶掣蟮odd 时问(d)Time十新星+夏钻石十黄山l号+黄山2号—*卜强丰图7PP0活性变化率F嘻7chaflgeratioofPP0activicy从图5可以看出，未接种处理各品种(系)PPO活性都有先升后降的趋势，但品种(系)间活性差别不大。从图6可以看出，接种后，新星、夏钻石、黄山1号PP0活性迅速升高，并始终高于其余两个品种(系)，第3天达到高峰，此后缓慢下降，并一直处于较高水平；黄山2号和强丰接种后PPO活性缓慢升高，前者于第3天达到高峰，此后缓慢下降，且始终高于后者，而后者于第5天达到高峰。此后迅速下降。各品种(系)PP0活性峰值的高低与品种(系)苗期感病性呈显著负相关，而与品种(系)成株期抗性水平呈正相关，所以，苗期叶片PPO酶活性可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标。从图7可以看出，接种后，强丰除第1天高于对照外，表10接种青枯菌后叶片PAL酶活性测定结果(△0D／gFwh)tablelOThevaluesofPALactivityofleaVesaRerinoculation、vithR．sD抽n日fP口r蜊如∞加m0m*p_}H—u日。山山晌oo州_日-。∞a日LIo^gv*鼍斟掣蜒odd 其余各天均低于对照，而其余4个品种(系)始终高于对照，且接种后1—3天增幅都很高，此后均下降。5．3PAL酶活性的变化不同番茄品种(系)接种青枯菌后叶片PAL酶活性测定结果如表10所示，未接种cK叶片PAL酶活性变化如图8，接种后叶片PAL酶活性变化如图9，接种后PAL活性变化率如图10。帮喜。l髟錾拿∥姆吾0l357时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK+黄山l号cK+黄山2号cK—*卜强丰cK图8未接种cK叶片PAL酶活性变化Fig．8PALactivi砂changesofleaveswithOutinOculaIiOn20oL⋯．⋯⋯—。一0l357时间(d)Time+新星+夏钻石十黄山1号+黄山2号+强丰图9接种后叶片PAL酶活性变化F唔9PALactiv时changesofleaveswithinoculation昏『问f^)TimP+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号+强丰图10PAL活性变化率Fig10Cha“geratioofPALactivity从图8可以看出，未接种处理各品种(系)叶片PAL活性有升高的趋势，但品种(系)间差别不大。从图g可以看出，接种后，强丰PAL活性缓慢上升，第3天达到高峰，此后迅速下降：其余4个品种(系)接种后PAL活性迅速升高，第3天达到高峰，此后缓慢下降，并一直保持较高水平。从整体看，接种后强丰PAL活性始终低于其余品种(系)，且活性峰值也低于其余品种(系)。各品种(系)PAL活性峰值的高低与苗期感病性呈显著负相关，而与成株期抗病性呈显著正相关，所以，茁期叶片印∞∞加0加蚰苦；=u∞J《‘koo=芒。吐c日矗o^gv瓣搴制掣蜒J《“ PAL酶活性可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标。从图10可以看出，接种后，除强丰PAL活性5天后一直低于对照外，其余品种(系)均高于对照。各品种(系)在接种后3天内都有较大增幅，而后开始下降。5．4sOD酶活性的变化表11接种青枯菌后叶片sOD酶活性测定结果(△OD幢FWmin)table11TheVal鹏sofSODactiv耐ofleavesafterjnoculation谢也R．sof研口c8口rⅣ聊不同番茄品种(系)接种青枯菌后叶片SOD酶活性测定结果如表11所示，未接种cK叶片SOD酶活性变化如图1l，接种后叶片sOD酶活性变化如图12，接种后sOD活性变化率如图13。∥赢彬董i10w’Ol357时间(d)Time+新旱CK+夏钻石CK+黄山l号CK十黄山2号CK—》卜强丰cK图11未接种cK叶片s00酶活性变化Fig11sODactiV时changesofleave8wlthoutinoculationO～一。一—oO1357时问(d)T1me+新星十夏钻石+黄山l号+黄山2号十强丰圉12接种后叶片s0D酶活性变化Fig12s0DactiV卸changesofIeaveswithinoculaIion加坫m0扫I^一荟oo∞单烬oo∽ 时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号牛强丰图13sOD活性变化率F嘻13change呲ioofsODaccivity从图11可以看出，未接种处理各品种(系)sOD活性总体上有上升的趋势，品种(系)间差别不大。从图12和图13可以看出，接种后各品种(系)SOD活性比较紊乱，忽高忽低，毫无规律，推测其原因可能是青枯菌侵入后的短时间内，机体本身的活性氧调节突然失去平衡，所以，苗期叶片SOD酶活性是否可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标还有待于进一步研究。5．5cAT酶活性的变化表12接种青枯菌后叶片CAT酶活性测定结果(△0D馆FWmin)tabIe12ThevaluesofCAractiv畸ofleaVesaRerinoculationwith尺．Jo肠门口cP口r“研处理处理时间(d)0新星CK夏钻石CK黄山1号cK黄山2号cK强丰cK新星夏钻石黄山l号黄山2号强丰8．815．28．16．113·2不同番茄品种(系)接种青枯菌后叶片CAT酶活性测定结果如表12所示，未接种CK叶片cAT酶活性变化如图14，接种后叶片CAT酶活性变化如图15，接种后CAT活性变化率如图16。从图中可以看出，未接种处理各品种(系)cAT活性变化比较平0O0O30●o1qq{蚤IA—p等口o∞％。一—臣廿妯a至u^gv粹睾制掣蜒口o∞07●564名¨m蚍"吼＆吼¨mm¨464259m76”&文mm&H吼06●537O∞93989“6K2●94●』2啦引鲫¨㈨眈6943869438989 稳，而接种处理各品种(系)cAT活性交化比较大，忽高忽低，无规律性，从而迸一步说明青枯菌侵入后的短时间内，机体本身的活性氧调节突然失去平衡，导致活性氧清除剂cAT和sOD变化紊乱，所以，苗期叶片cAT酶活性是否可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标还有待于进一步研究。蚤i刘：i棼吾u《U呐黪鳓舌毫，一Y、lP‘、∥·：一0l357时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK+黄山1号cK+黄山2号cK—*}强丰CK图14未接种cK叶片GAT酶活性变化Figl4cATactiV时changesofleave3wichoutinocuIation黔篓：趸o‘：≯一60．Ol357时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号牛强丰闰15接种后叶片c^T酶活性变化Figl5CATactjvitycha119esofleaveswithjnculation时阅(d)Time+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号*强丰图16cAT活性变化率Fig16ChangeratioofCATaciivity6番茄成株期接种青枯菌后的生理生化变化6．1酶活性的变化6．1．1POD酶活性的变化6．1．1．1根部POD酶活性的变化不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后根部POD酶活性的测定结果如表13所示，未接种CK根部PoD酶活性变化如图17，接种后根部POD酶活性变化如图18，接种后PoD活性变化率如图19。从图17和18可以看出，未接种处理各品种(系)POD酶活性变化不大，均较稳定，抗性品种(系)和中抗品种(系)PoD酶活性始终高于感病品种(系)。接种后，抗性品种(系)和中抗品种(系)PoD酶活性迅速升高，第4-I|vU¨oo一薏k∞管BqU^_j6_)爵罩制掣蜒罢u 天达到活性高峰，此后略有下降，而后又缓慢上升；而感病品种(系)PoD活性缓慢上升，第6天才达到高峰，此后迅速下降。总体上，抗病品种(系)和中抗品种(系)PoD酶活性始终高于感病品种(系)，活性高峰的出现也早于感病品种(系)，且峰值的高低与品种(系)抗性呈显著正相关。从图19可以看出，接种后，抗病和中抗品种(系)POD活性始终高于对照，且接种后4天内增幅都很大，此后缓慢下降，后期略有上升；而感病品种(系)接种后8天内都高于对照，到第lO天时低于对照。表13接种青枯菌后根部PoD酶活性的测定结果(△OD／gFWmin)table13TheValuesofPODactiv时ofmotsaRerinocuIationwith兄sD肠船钾酊姗l30蚤25：三20琶15810厶50246810时间(d)Time+新星CK+夏钻石CK十黄山l号cK+黄山2号cK—*}强丰cK圉17未接种cK根部P00酶活性变化Fjg．17PODactivjtychangesofrootswithoutinculalion50茸40毫3。日820凸一100246810时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号*强车囤18接种后根部POD酶活性变化Fjgl8PODactiv时“aDgesofrootswithinocuIation荽蜒aoL掣蜒口o“ 100誊§80簸蓉6—20一40时间(d)T1me+新旱+夏钻石+黄山l号+黄山2号诈强丰图19POD活性变化率Fig．19ChangeralioofPODactjvity6．1．1，2叶片PoD酶活性的变化表14接种青枯菌后叶片POD酶活性的测定结果(△0D佗Fwmin)table14TheVaIues0fPODactiVityofIeavesmerinocuIationwith足∞砌2口cP甜“肌不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后叶片POD酶活性的测定结果如表14所示，未接种CK叶片PoD酶活性变化如图20，接种后叶片PoD酶活性变化如图2l，接种后POD活性变化率如图22。从图20可以看出，未接种处理各品种(系)PoD酶活性虽有波动，但变化不大，比较平稳，抗病和中抗品种(系)均高于感病品种(系)。从图21可以看出，接种后，3个抗病品种(系)PoD活性迅速上升，于接种后第4天达到高峰，此后缓慢下降，并一直保持较高水平：中抗品种(系)和感病品种(系)接种后，PoD活性缓慢上升，前者第4天达到高峰，此后缓慢下降，而后者第6天才达 到高峰，此后迅速下降。从总体上看，抗病品种(系)POD活性始终高于中抗品种(系)，而中抗品种(系)又高于感病品种(系)，抗病品种(系)和中抗品种(系)活性高峰的出现早于感病品种(系)，并且峰值的高低与品种(系)抗性水平里显著正相关。从图22可以看出，接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)POD活性始终高于对照，而感病品种(系)接种8天内高于对照，第10天低于对照。从增幅看，抗病品种(系)2—4天增幅最大，新星为81．7％，夏钻石为73．6％，黄山l号为70．9％，显著高于中抗品种(系)和感病品种(系)显著，且各品种(系)最大增幅的高低与品种(系)抗性呈正相关0246810时间(d)Time+新星CK+夏钻石CK+黄山l号cK十黄山2号cK—※一强丰CK图20耒接种cK叶片POD酶活性变化Fi920PODactiv时chBngcsofleaVeswithoutinocuIatjon祷芭蚤鼗OO806040200至30三譬20o2lo+新星+夏钻石+黄山I号+黄山2号+强丰圈21接种后升片POD酶活性变化Fig21PODactiv耐chanBesofleaveswithinoculalion一20。0246810时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号—*卜强丰雷22POD活性变化军Fi922cha“geraIIo吖PODac【lVlly综合番茄成株期接种青枯菌后根部和叶片POD酶活性的变化情况可以看出，接种后番茄体内POD酶活性与品种(系)抗青枯病性密切相关，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。一o__一8嘴一n一6一∞4(L问～。时一00譬 6．1．2PP0酶活性的变化6．1．2．1根部PPO酶活性的变化不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后根部PP0酶活性的测定结果如表15所示，未接种cK根部PP0酶活性变化如图23．接种后根部PP0酶活性变化如图24，接种后PP0活性变化率如图25。表15接种青枯菌后根部PPO酶活性的测定结果(△OD／萨wmin)table15ThevaluesofPPOactivityofrootsaRerinoculationwithR．JD，口肝口ce口，“m0246810时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK+黄山1号cK+黄山2号cK—*一强丰CK图23未接种cK根部PP0酶活性变化F嘻23PPOactivnychangesofrootswithoucinoculatiOn刘蠼量三苗日。壹02468lO时间(d)Time十新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号+强丰图24接种后根部PPO酶活性变化F嘻24PPOactiv时changesofrootswithinoculation从图23可以看出，未接种处理各品种(系)PPO活性变化都比较小，没有规律。从图24可以看出，接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)PPO活性迅速升高，∞撕加坫占IA一芑∞o山厶掣烬odd 第4天达到高峰，其后抗病品种(系)缓慢下降，8天后又略有上升，而中抗品种(系)迅速下降，8天后也有所上升。感病品种(系)接种后PP0活性缓慢上升，第4天达到高峰，此后迅速下降。总体上，接种后抗病品种(系)PP0活性一直高于中抗品种(系)，中抗品种(系)又高于感病品种(系)，且峰值的高低与品种(系)抗性呈正相关，峰值越大，抗性也越高。从图25可以看出，接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)的PP0活性一直高于对照，而且第4天的增幅都很高，新星为135．3％，夏钻石为122．2％，黄山l号为166．7％，黄山2号为97．8％，均显著高于感病品种(系)。感病品种(系)接种后4天高于对照，此后一直低于对照。+新星+夏钻石+黄山2号牛强丰图25PP0活性变化率Fig25changeratioofPPOactjv时6，1，2．2叶片PP0酶活性的变化表16接种青枯菌后叶片PP0酶活性的测定结果(△OD／gFwmin)table16ThevaluesofPPOactivityofleavesa‰rinoculation谢thR．sD砌t口cPⅡr“m处理处理时间(d)0246新星cK夏钻“cK19．618．0】8．417．5】9．716．820．】19．418．717．4】8，319．O强丰18322．026．521．820．3z8．6堪如射弛四如控55■5五0击”墙伸"¨弭M89543DJ船m加强”弘”745屉4DJ拓∞体∞弘扣驺9634名Dc：竹他M勰她卯孔●2360，2一吼&吼良一口=xK(号号K号号●2C石●2山山丰星诂山山黄黄强新夏黄黄 不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后叶片PPO酶活性的测定结果如表16所示，未接种CK叶片PP0酶活性变化如图26，接种后叶片PPO酶活性变化如图27，接种后PPO活性变化率如图28。从图26和27可以看出，未接种处理各品种(系)叶片PPO活性变化不大，没有规律。接种后，各品种(系)PPO活性均迅速升高，第4天达到高峰，此后均缓慢下降，抗病品种(系)一直维持较高水平。总体上，接种后抗病品种(系)PPO活性高于中抗品种(系)，中抗品种(系)又高于感病品种(系)，且活性峰值的高低与品种(系)抗性水平成正相关。从图28可以看出，接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)PPO活性始终高于对照，而感病品种(系)接种后4天内高于对照，此后接近或低于对照。抗病品种(系)和感病品种(系)第4天增幅最大，新星、夏钻石、黄山1号分别为107．1％、128．6％、133．5％，而强丰只有43．2％；中抗品种(系)黄山2号第6天增幅最大，为75．7％，介于抗病品种(系)与感病品种(系)之间。时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK+黄山l号cK+黄山2号cK—和强丰CK圈26未接种CK叶片PP0酶活性变化F嘻26PP0activ时changesofIeaveswithoutinoculation02468lO时问(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号+强丰图27接种后叶片PP0酶活性变化Fig．27PPOactivitychangesofIeaveswithinoculation时问(d)Time+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号+强丰图2BPP0活性亚化翠F培28ChangcratIoOfPP0actiVlty综合番茄成株期接种青枯菌后根部和叶片PPO酶活性的变化情况可以看出，接种∞龉∞垢∞00扫I^；等^)d厶掣烬odd蕊∞O∞若；08o““uoa—I_妥u伽口≮篮UH#v桀掣斛艄黼。黜 后番茄体内PPO酶活性与品种(系)抗青枯病性密切相关，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6．1，3PAL酶活性的变化6．1．3．1根部PAL酶活性的变化不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后根部PAL酶活性的测定结果如表17所示，未接种CK根部PAL酶活性变化如图29，接种后根部PAL酶活性变化如图30，接种后表17接种青枯菌后根部PAL酶活性的测定结果(△0D儋FWh)table17ThevaluesofPALactiv时ofrootsanerinocul砒ion砸th尼sD，d肋cB甜姗PAL酶活性变化率如图31。从图29和30可以看出，未接种处理各品种(系)根部PAL活性上下波动，但变化幅度不大，抗病品种(系)始终高于中抗品种(系)，而后者始终高于感病品种(系)。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)PAL活性迅速升高，第2天达到第一个活性高峰，第4天有所下降，但此后又升高．于第6天达到第二个高峰，且峰值大于第一个峰值，随后又开始下降，并～直维持较高水平。感病品种(系)接种后反应比较迟钝，2天内PAL活性缓慢升高，2天后才迅速升高，并于第4天达到高峰，此后又迅速下降。总体上，接种后抗病品种(系)PAL活性始终高于中抗品种(系)，中抗品种(系)又高于感病品种(系)，抗病品种(系)和中抗品种(系)第一个活性高峰的出现早于并高于感病品种(系)，且峰值的高低与品种(系)抗性成正相关。从图3l可以看出，接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)的PAL活性始终高于对照，而感病品种(系)接种后8天内都高于对照，第lO天低于对照。各品种(系)的最大增幅出现在第2—6天，新星为110．6％，夏钻石为93．1％，黄山l号为104，7％，黄山2号为107．1，而强丰只有72，4％。39 120掣：i萼i山矗U。～～”1⋯一1O246810时M(d)Time+新星CK+夏钻石cK+黄山l号cK+黄山2号cK—*一强丰CK图29未接种cK根部P^L酶活性变化F嘻29PALactivI【ychangesofrootswithoutinoculation}引20246810时问(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号—*卜强丰图30接种后根部PAL酶活性变化Fig30PALactivitychangesofmotswithinOculatiOn时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号+强丰图31PAL活性变化率Fig．3lChMgeratioofPALact；v时6．1_3．2叶片PAL酶活性的变化不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后叶片PAL酶活性的测定结果如表18所示，未接种CK叶片PAL酶活性变化如图32，接种后叶片PAL酶活性变化如图33，接种后PAL活性变化率如图34。从图32和33可以看出，叶片PAL活性变化与根部基本相似。未接种处理各品种(系)叶片PAL活性变化比较小，且各品种(系)叶片PAL活性要低于根部。总体上，抗病品种(系)高于中抗品种(系)，而后者又高于感病品种(系)。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)叶片PAL活性迅速升高，第2天达到第一个高峰，第4天略有下降，此后又上升，第6天达到第二个高峰，且峰值低于第一个峰值。随后又下降，但始终维持较高水平。感病品种(系)接种后叶片PAL活性缓慢上升，第4天达到高峰，此后开始下降，第lO天已降至接种前水平。总体上，接种后抗病品种(系)PAL活性高于中抗品种(系)，后者又高于感病品种(系)，抗病品种(系)和中抗品种(系)第一个高峰的出现早于并高于感病品种(系)，且峰值的瓢叭豇●瓠11．一置l^一莒J《山koo一苗-啦∞善llu^ljbv醑晕锹掣烬1vl 表18接种青枯菌后叶片PAL酶活性的测定结果(△OD幢Fwh)table18ThevaluesofPALactiv时ofleavesanerinoculationwithR．so肠门们已甜“mOZ468lO时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK+黄山l号cK+黄山2号cK—*卜强丰cK图32未接种cK叶片P^L酶活性变化Fig．32PALactjvilychangesofIeave5withoutinoculatjon掣!}g一一～L·L～0246810时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号*强丰圈33接种后叶片PAL酶活性变化Fig_33PALactiV时ch帅gesofleaveswjthinoculatiOn高低与品种(系)抗性水平呈显著正相关，但各品种(系)叶片PAL活性峰值均低于相应品种(系)根部PAL活性峰值。从图34可以看出，接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)叶片PAL活性始终高于对照，感病品种(系)8天内高于对照，第10天低于对照，各品种(系)最大增幅出现在接种后2—6天，且明显低于根部最大增幅。扫J^℃≈，Ivd掣蜒1vk 时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号—※一强丰固34PAL活性变化率F嘻34Cha九geratioofPALactiVi‘y综合番茄成株期接种青枯菌后根部和叶片PAL酶活性的变化情况可以看出，接种后番茄体内PAL酶活性与品种(系)抗青桔病性密切相关，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6．1．4SoD酶活性的变化6．1．4．1根部SOD酶活性的变化不同抗性番茄品种(系)接种青桔菌后根部SOD酶活性的测定结果如表19所示，未接种cK根部s0D酶活性变化如图35，接种后根部SoD酶活性变化如图36，接种后SOD活性变化率如图37。从图35和36可以看出，未接种CK根部s0D活性总体上有表19接种青枯菌后根部SoD酶活性的测定结果(△OD佗FWmin)table19ThevaluesofSODactiv时ofrootsa丘erinocul“onwithR．sokndce甜“埘缓慢的先升后降的趋势，但品种(系)活性都显著升高，第2天都达到高峰，间差异较小。接种后，各品种(系)根部SoD此后开始下降，但抗病品种(系)和中抗品种慕即∞∞肋0舶雪一主苗≈．■《山钆oo—p窭u世c《I{u^gv棒释姒掣蝗锚4 (系)下降比较缓慢，并维持较高水平，抗病品种(系)8天后又开始上升，而感病品种(系)下降迅速，4天后已下降到接种前的水平。总体上，接种后，抗病品种(系)SOD活性高于中抗品种(系)，后者又高于感病品种(系)，且峰值的高低与品种(系)抗性水平成正相关。从图37可以看出，接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)sOD活性始终高于对照，而感病品种(系)只有第2天高于对照，此后一直低于对照。各品种(系)接种后第2天增幅最大，新星为81．8％，夏钻石为67．9％，黄山1号为71．3％，no—181再Ja‘玉40。瓣jM垂稽舅820f-葛星黍一∽15L∽i￥i0Z4b810时间(d)Time+新星CK+夏钻石CK+黄山l号CK+黄山2号CK—*一强丰CK图35未接种cK根部s0D酶活性变化Fig．35SOD8靠ivjlychangesofrootswithout{noculation，、坌100詈禽80簪苫h600246810时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号*强丰图36接种后根部sOD酶活性变化Fig．36SODactjvj妙changesofrootSwithinoculatiOn黄山2号为46．3％，强丰只有27．9％，此后，抗病品种(系)增幅缓慢下降，中抗品种(系)和感病品种(系)则迅速下降，但8天后，各品种(系)增幅又开始上升。6．1_4．2叶片sOD酶活性的变化不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后叶片sOD酶活性的测定结果如表20所示，未接种cK叶片sOD酶活性变化如图38，接种后叶片根部soD酶活性变化如图39，接 种后SOD活性变化率如图40。从图38和39可以看出，未接种CK叶片SOD活性成波浪式变化，没有规律，品种(系)间差异不大。接种后，各品种(系)叶片soD活性开始上升，第4天达到高峰，滞后于相应品种(系)根部SOD活性高峰，此后都开始下降，但抗病品种(系)下降比较慢，且始终维持较高水平，感病品种(系)8天后已降到接种前水平。总体上，接种后表20接种青枯菌后叶片sOD酶活性的测定结果(△OD幢Fwmin)table20ThevaluesofSODactiVityofleaVesaRerinoculationwithR．sD肠以日cP口r“m0246810时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK+黄山1号cK+黄山2号cK—*一强丰CK图38未接种cK叶片s00酶活性变化F嘻38sODactivitychangesofleaveswiIhoutinocuIation555045403530252015100246810时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山1号+黄山g号—*一强丰图39接种后叶片sOD酶活性变化Fig．39sODactivnychangesofleaveswilhinoculation抗病品种(系)sOD活性高于中抗品种(系)，后者又高于感病品种(系)，且峰值的高低与品种(系)抗性成『F相关。从图40可以看出，接种后抗病品种(系)和中抗品种(系)叶片soD活性始终高于对照，而感病品种(系)6天内高于对照，此后一扫I^召u日凸o∞掣蜒oo∽裂蜒oo∞ 直低于对照。抗病品种(系)接种后6天内增幅一直比较高，第8天最低，随后又上升，而中抗品种(系)只有前4天比较高，此后都比较低。时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号—*卜强丰图40s00活性变化率F嘻40changeratioofsODactiv时综合番茄成株期接种青枯菌后根部和叶片SoD酶活性的变化情况可以看出，接种后番茄体内soD酶活性与品种(系)抗青枯病性密切相关，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6．1．5CAT酶活性的变化6．1．5．1根部cAT酶活性的变化表21接种青枯菌后根部CAT酶活性的测定结果(△OD儋Fwmin)table21ThevaluesofCATactivityofrootsa舶rinoculationw“hR．sD肠甩仰P甜“加不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后根部cAT酶活性的测定结果如表21所示，未接种cK根部cAT酶活性变化如图4l，接种后根部cAT酶活性变化如图42，接种后0O0O02086424扫I^一乞日oo∞』oo一甚。嚣u旦o^lj}v静暮锹掣蜒口。∽ CAT活性变化率如图43。0246810时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK+黄山1号cK+黄山2号cK—*一强丰CK囤41未接种CK根部CAT酶活性变化Fig．4lcATactjv时ch柚gesofrootswithoutinoculaliOn35>、30嚣耘孽}竺15u舌lo0246810时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号*强丰图42接种后根部CAT酶活性变化F唔42cATactiVi珥chaHgesofrootswithinOculatjon+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号+强丰图43cAT活性变化率F嘻43changeratioofcATactiv时从图4l和42可以看出，未接种cK各品种(系)根部CAT活性变化比较平稳，差别不大。变化没有规律。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)cAT活性开始下降，第2天降到最低，此后迅速升高，并于第6天达到高峰，随后又缓慢下降，而感病品种(系)接种后反应比较迟钝，2天后开始缓慢升高，第6天达到高峰，此后迅速下降，第10天已降到接种前的水平。总体上看。接种后第2天，感病品种(系)cAT活性高于中抗品种(系)，后者又高于抗病品种(系)，而接种4天后，抗病品种(系)和中抗品种(系)一直高于感病品种(系)，且峰值的高低与品种(系)抗性成正相关。从图43可以看出，抗病品种(系)和中抗品种(系)根部CAT活性接种后4天内低于对照，此后一直高于对照，而感病品种(系)除第6天高于对照外，其它时间均低于对照。无论是最大增幅还是最大减幅，抗病品种(系)都高于中抗品种(系)，后者又高于感病品种(系)。0O05050扫I^～芑日卜《UlIo．o一_￡oMc里U^96v*掌制掣蜒皇u 6，l_5．2叶片CAT酶活性的变化不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后叶片CAT酶活性的测定结果如表22所示，未接种cK叶片CAT酶活性变化如图44，按种后叶片CAT酶活性变化如图45，接种后CAT活性变化率如图46。表22接种青枯菌后叶片CAT酶活性的测定结果(△OD倌Fwmin)table22ThevaluesofCATactiv时ofleavesa&rinoculationwithR．5D肠门叩P甜“州30蚤25『舞{；：『暑皇10}u5L0oO2468lO时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK十黄山l号cK+黄山2号cK—※一强丰CK图44未接种cK叶片c^T酶活性变化Fig．44CATac【ivitychallges0fle驯eswithoucinoculalionO246810时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号—※一强丰图45接种后叶片cAT酶活性变化Fig．45cATactjv时ch甜gesofleave5withinoculation从图44和45可以看出，各品种(系)未接种CK叶片cAT活性变化都比较小，品种(系)问差别也不大。接种后，各品种(系)叶片CAT活性变化趋势与根部变化趋势相似，抗病品种(系)和中抗品种(系)都是先降后升，然后再降，第2天最低，第6天最高，而感病品种(系)接种后cAT活性则缓慢上升，第6天达到高峰，此后 迅速下降，并一直低于其余品种(系)，且各品种(系)峰值的高低与品种(系)抗时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号—*}一强丰图46c^T活性变化率Fig．46ChangeratioofCATactivi母性成正相关。从图46可以看出，接种后，抗病品种(系)CAT活性立即降低，低于对照，接种后4天一直高于对照，中抗品种(系)接种后CAT活性始终高于，而感病品种(系)接种后6天内高于对照，此后低于对照。抗病品种(系)和中抗品种(系)接种后6一lO天CAT活性增幅都比较高，而且各品种(系)叶片CAT活性变化，无论是增幅还是降幅都小于相应的根部变化。综合番茄成株期接种青枯菌后根部和叶片CAT酶活性的变化情况可以看出，接种后番茄根部与叶片cAT酶活性变化不太一致，而且接种初期cAT酶活性下降原因不明，所以，CAT酶活性是否可以作为番茄抗青枯病的生理生化指标还需进一步研究。表23接种青枯菌后根部木质素含量的测定结果(mg／100mgFw)table23ThelignincontentofrootsaRerinoculationwithR．so，删口cP口r“Ⅲ∞印蚰加O鲫∞^ll^一苗日-L舌_}oo一董＆§￡u^#一瓣掣斟蚶蜒尝u 6．2生化抗病物质的变化6，2．1木质素的变化6．2．1．I根部木质素含量的变化不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后根部木质素含量的测定结果如表23所示，未接种cK根部木质素含量变化如图47，接种后根部木质素含量变化如图48，接种后木质素含量变化率如图49。从图47和48可以看出，各品种(系)未接种cK根部木质素积累极其缓慢，含量变化也很小，但抗病品种(系)木质素含量高于中抗品种(系)，后者又高于感病品种(系)。接种后，各品种(系)根部木质素含量显著增加，接种后6天内最显著，此后木质素含量又趋于稳定，并始终维持较高水平，而且抗病品种(系)木质素含量一直高于中抗品种(系)，中抗品种(系)一直高于感病品种(系)，这说明木质素含量与番茄品种(系)抗青枯病性有密切关系。从图49可以看出，接种后6天内，各品种(系)木质素含量增幅很明显，而且抗病品种(系)增幅大于中抗品种(系)，后者又大于感病品种(系)，此后各品种(系)增幅明显减缓。喜6．5“一bi洋：}∥缸。4．5F懈d，一——一一世1*O246810时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK+黄山l号cK+黄山2号cK—静一强丰CK图47未接种cK根部木质素含量变化F嘻47L噜n．nconten!cban寥sofmotswithoutjnocuIa“on毫善15襞i10篓墨iO246810时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号—*}一强丰图48接种后根部末质素含量变化F培48Lignincontentch锄gesofr00tswithinocuIaljon 时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号+强丰图49木质素含量变化率Fig．49Ch肌geratioofllgnincontent6．2．1．2叶片木质素含量的变化不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后叶片木质素含量的测定结果如表24所示，未接种cK叶片木质素含量变化如图50，接种后叶片木质素含量变化如图51，接种后木质素含量变化率如图52。表24接种青枯菌后叶片木质素含量的测定结果(mg／100mgFw)table24ThelignincontentofleavesaRerinocuIationwithR．Jo肠玎∞P胛甜m处理时间(d)处理02468新星cK夏钻石CK黄山1号cK黄山2号cK强丰CK新星夏钻7i黄山l号黄山2号4．2504．2254．2383．9813．6054．2504．2254．2383．9814．2644．24842464．0083．6505．94054605．6725．0144．28l427042944．1533．6976．7566．5196．4836．1184．2944．2894．3084．1993．7408．3508_3388．2907．8234．3lO4．3404．3174．2113．8418．9408．8828．7647．99043834|36l4．3704．2533．9159．0259．0108．8918237强丰3．6054．1584．2484．5985．7925．940绣Ⅱ眦双0一cu_couc—u暑lI’}o。一_ED∞c日L{U—gu辟掌制删啦搬峰长 丢l4’川￡￡参幸聿j襄．引曼雾饕瓢s}—∥*“3-一一⋯一10；芒9V磐8·彰}02468lO时间(d)Timo+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号+强丰图51接种后叶片木质素含量变化Fig．51L．gnincontentchangesofleaveswithinoculatjon从图50和51可以看出，各品种(系)未接种cK叶片木质素含量变化与根部木质素含量变化相似，变化非常小，但各品种(系)叶片木质素含量明显低于相应根部木质素含量。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)接种后6天内木质素含量变化很明显，此后趋于平缓．而感病品种(系)接种后6天内变化比较小，第8天木质素含量明显增加，随后趋于平缓。总体上，接种后抗病品种(系)叶片木质素含量一直高于中抗品种(系)，后者又高于感病品种(系)。从图52可以看出，接种后，抗病品种(系)在8天内增幅最明显，随后趋于稳定，中抗品种(系)在6天内增幅最明显，而感病品种(系)第8天增幅最明显，而且抗病品种(系)和中抗品种(系)的增幅明显大于感病品种(系)，但均低于相应根部的增幅。褂：芒写#制：警襄茎i訾：萤l辞02468lO时问(d)Time+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号+强十图52木质素含量变化率F嘻52Ch卸geratiooflignincontent综合番茄成株期接种青枯菌后根部和叶片木质素含量的变化情况可以看出，接种后番茄体内木质素含量与品种(系)抗青枯病性密切相关，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。 6．2．2总酚含量的变化6．2．2．1根部总酚含量的变化表25接种青枯菌后根部总酚含量的测定结果(OD280va】ue)table25ThetotalphenolicscontentofrootsaRerinoculationwith月．5D肠”口cPdr“m不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后根部总酚含量的测定结果如表25所示，未接种cK根部总酚含量变化如图53，接种后根部总酚含量变化如图54，接种后总酚含量变化率如图55。O．1窖0．08一磐亏o．06罄篙0．04o0．02O0246810时间(d)Time+新星cK+夏钻石cK+黄山l号CK+黄山2号CK—-*一强丰cK图53未接种cK根部总酚含量变化Fig．53TOtaIphenolicscOntentchangesofrootswithoutinOculatiOn蚓。瓮口o．250．2．15O．1r．050246810时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号*强丰图54接种后根部总酚含量变化Fi954TotaIphenolicscontentchangesOfroOtswithinOculatiOn从图53和54可以看出，各品种(系)未接种cK根部总酚含量有先升后降，然后再升的趋势，但变化都不大，抗病品种(系)和中抗品种(系)总酚含量高于感病品种(系)，说明没接种条件下，根部总酚含量与品种(系)抗病性有重要关系。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)根部总酚含量迅速增加，接种后第2天达到 第一个高峰，第4天略有下降，第6天达到第二个高峰，但峰值小于第一个峰值，此后总酚含量迅速下降。感病品种(系)接种后根部总酚含量增加比较缓慢，第4天达球一攒二基制d掣《忙蛊趱200150售100暑50u0Z46810时问(d)TiⅢe+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号—*卜强丰图55总酚含量变化率Fi955changeratiooftotaIphenolicscontent到高峰，此后～直保持稳定。总体上，接种后各品种(系)总酚含量峰值的高低与品种(系)抗性成正相关。从图55可以看出，接种后，各品种(系)根部总酚含量一直高于相应对照，抗病品种(系)和中抗品种(系)接种后2—6天增幅很大，第2天和第6天各出现一个增幅高峰，第6天后迅速降低，第8天后低于感病品种(系)的增幅，而感病品种(系)接种后4—8天增幅较高，第4天达到第一个增幅高峰，此后下降，第8天达到第二个增幅高峰，且第二个峰值低于第一个峰值，此后增幅又开始下降。表26接种青枯菌后叶片总酚含量的测定结果(0D280value)table26Thetotalphenolicscontentofleavesafterinoculationwi血R．占o，册dcP口，跏∞兰oc∞盖j01Joo焉-盐c至u 6．2．2．2叶片总酚含量的变化0．1∞0．08翟jo．06营营o．04u0．02i眵矽图目龟0．2一詈0．15．型罩莒赛o．1‘。禽o，05．02468100246810时fUJ(d)Tlm。时间(d)Time+新星cK+夏钻石CK+黄山l号cK+黄山2号CK—-*一疆：_}二CK图56未接种cK叶片总酚含量变化Fig．56TotalphenoIicscontentchangesofleavcswithOutinoculation+新星+夏钻石+黄山1号+黄山2号—*一强中图57接种后叶片总酚含量变化F嘻57Totalphenolicscontentchangesofleaveswithinoculation不同抗性番茄品种(系)接种青枯菌后叶片总酚含量的测定结果如表26所示，未接种cK叶片总酚含量变化如图56，接种后叶片总酚含量变化如图57，接种后总酚含量变化率如图58。从图56和57可以看出，各品种(系)未接种CK叶片总酚含量的变化比较小，品种(系)间差别不大，总体上有升高的趋势。接种后，各品种(系)叶片总酚含量变化规律与相应根部总酚含量变化规律相似，但峰值均低于相应根部的峰值。从图58可以看出，接种后抗病品种(系)和中抗品种(系)叶片总酚含量迅速升高，2天内增幅最大，此后下降，第6天又升高，随后迅速下降。而感病品种(系)叶片总酚含量增加比较缓慢，第6天增幅最大，此后缓慢下降，并一直高于其余品种(系)。UZ468lO时间(d)Time+新星+夏钻石+黄山l号+黄山2号+强丰图58总酚含量变化率Fig．58ChangeratiooftotalphenoIlcscontent∞∞∞加∞∞∞∞∞0～量c8¨2～o{4一蛊olJoo焉J。舵写工u^#)|斛掣斟嘲妊窿凄 综合番茄成株期接种青枯菌后根部和叶片总酚含量的变化情况可以看出，接种后番茄体内总酚含量与品种(系)抗青枯病性密切相关，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6．3同工酶变化6．3．1PoD同工酶的变化接种后不同抗性番茄品种(系)根部POD同工酶电泳结果如图59，叶片PoD同工酶电泳结果如图60。从图59可以看出，未接种处理抗病品种(系)和中抗品种(系)根部POD同工酶都有6条谱带，即Dl、D2D、D3、D4、D5、D6，其中，D1、D4、D5、D6为极强带。D2、D3为较强带，丽感病品种(系)没有D2酶带，Dl和D4酶带也明显比其余品种(系)弱。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)没有新酶带出现，只是各条酶带颜色加深，尤其是Dl和D3酶带最为明显，而感病品种(系)出现D2酶带，但颜色很淡，D1和D3酶带颜色也明显加深。从图60可以看出，未接种处理抗病品种(系)和中抗品种(系)叶片POD同工酶谱带只有5条，比根部少D3酶带，D2酶带比根部强，其余酶带则比根部弱，而感病品种(系)只有3条酶带，即D4、D5、D6酶带，比根部少D1和D3酶带。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)没有新酶带出现，只是各酶带有所增强，而感病品种(系)出现Dl酶带，其余酶带也增强。l23456789tO12345678910l～lO依次代表夏钻石、夏钻石cK、黄山1号、黄山l号cK、黄山2号、黄山2号CK、新星、新星cK、强丰、强丰cK图59接种后根部PoD同1二酶谱带Fig59IsozymespectraofPODinrootsa角玎inoculation1～lO依次代表夏钻石、夏钻石CK、黄山1号、黄山l号CK、黄山2号、黄山2号CK、新足、新展CK、强丰、强丰CK图60接种后叶片PoD同】：酶谱带Fig．60Iso珂mespectraofPODinleavesafterinoculatiOn叭眦m阱2雪 6．3．2PPO同工酶的变化l23456789101～10依次代表黄山l号、黄山1号cK、黄山2号、黄山2号cK、夏钻石、夏钻石cK、新星、新星cK、强丰、强丰cK图61接种后根部PPO同工酶谱带Fjg．6IIso纠mespectraofPPOjnrootsaRerinoculat{onl2345678910l～10依次代表黄山l号、黄山l号cK、黄山2号、黄山2号cK、夏钻石、夏钻石CK、新星、新星cK、强丰、强丰cK图62接种后叶片PPO伺工酶谱带Fig．62IsO纠mespectraofPPoinleavesaRerinocuIa“on接种后不同抗性番茄品种(系)根部PPO同工酶电泳结果如图61，叶片PPO同工酶电泳结果如图62。从图6l可以看出，未接种处理抗病品种(系)和中抗品种(系)根部有4条酶带，即P1、P3、P4、P5，而感病品种(系)只有P3、P4、P5酶带，没有P1酶带，而且P3酶带很弱。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)出现一条新酶带P2，而感病品种(系)出现2条新酶带，即P1和P2，其余酶带都增强。从图62可以看出，未接种处理抗病品种(系)和中抗品种(系)叶片PPO同工酶只有3条酶带，即P3、P4、P5，比根部少了P1酶带，而感病品种只有P4和P5酶带，El：根部少了P3酶带。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)出现新酶带P1，而感病品种(系)出现P1和P3两条新酶带。6．3．3SoD同工酶的变化接种后不同抗性番茄品种(系)根部SOD同工酶电泳结果如图63，叶片SOD同工酶电泳结果如图64。从图中可以看出，各品种(系)根部和叶片SOD同工酶变化是一致的。未接种处理抗病品种(系)有4条酶带，即S2、S3、S4、S5，而中抗品种(系)和感病品种(系)只有3条酶带，即s2、s4、s5。接种后，抗病品种(系)出现2条新酶带，即s1和s6，中抗品种(系)出现3条新酶带，即Sl、S3、S6，而感病品种(系)也出现2条新酶带，即Sl和s6。¨金="N：￡ SlS2S4S5S6l23456789lOl～10依次代表新星、新星cK、夏钻石、夏钻石cK、黄山1号、黄山l号cK、黄山2号、黄山2号cK、图63接种后根部SOD同：[酶谱带Fig，63IsozymespectraofSODinrootsafccrinocuIation12345678910l～10依次代表新星、新星CK、夏钴ti、夏钻石cK、黄山l号、黄山l号cK、黄山2号、黄山2号cK、强丰、图64接种后叶片sOD同1二酶谱带Fig．64IsOzymespectra0fSODinleaVesaRerinoculatiOn57 讨论1青枯菌致病性的测定青枯菌致病性的测定方法主要有针刺法、注射法、蘸根法、灌注法等【831，但后两种方法更接近于青枯菌自然侵染方式，比较适合于青枯菌致病性测定。本试验采用伤根菌液灌注法，人为造成了伤口，打破了番茄表皮这一天然屏障，使青枯菌更容易侵入寄主体内，可能使番茄发病株率高于自然条件下的发病株率，不能真正反映各菌株的致病性。2青枯菌生化变种的测定国内对青枯菌生化型的研究较多。许多报道表明旧24，26，102，m】，我国青枯菌有4个生化变种，即II、III、Ⅳ、V，其中生化变种III和Ⅳ占优势，番茄上主要是生化变种III。本试验结果表明，安徽省有代表性的番茄产区青枯菌均属生化变种III。但本试验所测定的菌株数较少，尚不能反映安徽省所有地区青枯菌的生化变种类型，有待于进一步研究。3青枯菌胞外酶活性的测定果胶酶和纤维素酶两种酶在青枯菌致病中有一定作用。已经清楚的是纤维素酶能影响病害的发展速度，而果胶酶是青枯菌迅速侵入植物根系和体内定殖所必须的，但它们在致病中的真正作用还未完全弄清。本试验结果表明，青枯菌在人工培养条件下，随培养时间的延长，果胶酶和纤维素酶两种酶活性都逐渐升高，培养7～9天酶活性均达最大值，但果胶酶活性最大值与菌株致病性之间相关性不大(r=O．6371)，所以果胶酶在青枯菌致病过程中的作用还有待于进一步研究，而各菌株纤维素酶活性最大值与致病性高度正相关(r=O．9526)，说明纤维素酶与青枯菌的致病过程紧密相关，是青枯菌致病过程中的重要因子。4不同番茄品种(系)苗期抗病性鉴定抗病性鉴定是抗性资源筛选、抗病品种(系)选育过程的一个至关重要的环节，是选育优良抗性品种(系)的基础，能够真实地反映材料抗性水平是抗病性鉴定的关键。从国内外研究现状看，对番茄抗青枯病鉴定在病原菌的保存增殖、接种方法、接种浓度及接种时期等多方面各不相同，缺乏规范化。青枯病菌较易变异，保存和增殖方法不同，可能使病菌在致病性方面产生变异。接种浓度过大可能使抗性中等、经济性状优良的资源被漏掉，接种浓度过小，可能将不具抗性或抗性较差的材料误认为是抗性材料。接种方法对抗性也有显著的影响，如伤根接种与不伤根接种相比，许多材料的抗性主要表现在抗侵入，而伤根法却打破了这一天然屏障，让病菌自由进入寄主体内，难以真实反映材料的自然抗性。李海涛较为全面地研究了番茄对青枯病的最适抗病鉴定方法，认为幼苗伤根灌58 注法和浸根法均是番茄幼苗期适宜的抗病性鉴定方法，但前者比后者更经济、省力，是抗病性鉴定的首选方法。采用伤根灌注法接种，接种苗龄为20天，接种病菌的适宜浓度为1～lO×108个菌／ml，接种后3周进行发病调查，可获得准确的鉴定结果。他的研究结果认为：多数番茄品种(系)苗期抗性和成株期抗性具一致性，幼苗2升期接种能够有效的筛选抗性材料，与4～5叶期接种相比，时间提前，但结果是一致的，不同苗龄的番茄幼苗可能存在抗性分化，苗龄越小，抗性越强【2弼。相反，有些研究发现，番茄品种(系)在茁期测定都是感病的，有些茁期感病的品种(系)在植株生长至六、七周之后测定就表现为抗病，表现出成株期抗性l¨⋯。本研究采用伤根灌注法，在茁龄4周时，用浓度为3×104个菌／ml的菌悬液接种5个番茄品种(系)，接种后l周、2周、3周进行发病株率调查。结果表明，接种后1周，5个品种(系)发病株率均已超过60％，均为感病品种(系)。但品种(系)闻发病栋率存在显著差异．强丰最高，为95．2％，新星最低，只有61．1％。随着时间的推移，各品种(系)发病株率不断升高，到第3周，强丰发病株率已达100％，而新星只有83．3％，其余3个品种(系)发病株率为94％～95．5％，品种(系)间存在显著差异。此结果说明5个品种(系)在4周苗龄时均为感病品种(系)，与前人的研究结果相同。5不同番茄品种(系)成株期抗病性鉴定关于番茄苗期与成株期抗性的相互关系，李华平"2]发现抗病品种(系)苗龄3星期和7星期植株的抗性是各自独立的，苗期7星期的抗病水平不能说明苗龄3星期的抗病程度，反之亦然，认为番茄不同龄期抗病或感病依品系不同而不同，抗病性鉴定应分别测定苗期和成株期的抗性。而林维英认为无论成株期或苗期接种效果是一样的，无需进行分别鉴定。李海涛在研究中发现多数番茄品种(系)苗期抗性和成株期抗性具有一致性，但苗期鉴定不能取代成株期鉴定，只有将二者结合起来，才能选育出抗性及经济性状皆优的材料。本研究采用伤根灌注法对5个品种(系)进行成株期抗病性鉴定，结果表明．新星、夏钻石、黄山l号3个品种(系)为抗病品种(系)，抗性指数分别为12．9、12．3、10．9，黄山2号抗性指数为8．9，属中抗品种(系)，而强丰抗性指数为2．5，属感病品种(系)。由此可以看出，苗期感病的5个品种(系)在成株期出现了抗性分化，因此，在番茄抗青枯病育种过程中仅靠苗期的抗性鉴定是不行的，必须结合成株期抗性鉴定，才能选育出优良的抗性品种(系)。6番茄品种(系)抗青枯病的生理生化机制植物对病原菌的防御系统大致可分为三道防线ll“J。第一道防线是一些结构因素如细胞壁等；第二道防线是感染位点的局部激活来阻止病原茵的扩展。一旦病原菌攻破这两道防线，被感染位点及其周围的细胞局部死亡(过敏反应)，使病原菌被限制在侵染部位周围不能扩散。过敏反应通常伴随着系统获得性抗性(sAR)的出现，SAR就是植物防御的最后一道防线。SAR是通过诱导一些防御相关蛋白的 形成或活性增加来获得的。各种防御酶系就是其中很重要的一类。6．1酶活性与抗瘸性的关系6．1．1PoD酶活性与抗病性的关系POD是细胞内一种重要的防御酶，不仅是重要的内源活性氧清除剂(经SoD歧化和Habel～weiss反应(O。一+H：O：一·OH+O。)可产生对细胞危害性更重的H。O：和·OH，而它们的清除均与POD活性有关)，而且参与了木质素的聚合过程，细胞壁的高度木质化对病原菌的侵染和扩展有一定的限制作用【105J。此外，PoD还与植保素的合成及酚类物质的氧化有关【Ⅲ，10”。惠勒1108】在研究中发现，POD与乙烯的生物合成和吲哚乙酸的氧化作用有关，这两种激素会造成整个代谢的巨大变化，并与POD一起影响酚类化合物代谢。关于POD活性与植物抗病性的关系已有大量报道阢96，1睁¨6】，一般认为植物感染病原菌后，PoD活性显著增强，但存在的分歧也比较大。有些研究结果表明，植物感染病原菌后，PoD活性显著增强．抗病品种(系)POD活性高于感病品种(系)。但是也有研究结果与此相反，感病品种(系)PoD活性比抗病品种(系)的活性增加得快而且高。还有的研究结果不同于上述结果，徐郎莱研究显示小麦对赤霉病的抗性与种子的POD活性相关，而与叶片的POD活性无关，朱睦元等认为大麦分蘖期PoD活性与大麦对BYMv的抗性无关。本研究结果表明，番茄苗期接种青枯菌后，各品种(系)叶片POD活性均增强，强丰接种后1天达到活性高峰，此后迅速下降；而其余4个品种(系)第5天才达到高峰，此后虽有下降，但始终维持较高水平：强丰的峰值低于其余4个品种(系)，而且峰值的高低与发病株率呈显著负相关，而与品种(系)成株期抗性呈正相关，所以，苗期叶片POD酶活性可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标。番茄成株期未接种处理，无论是根部还是叶片，抗性品种(系)和中抗品种(系)POD活性始终高于感病品种(系)。接种后，各品种(系)PoD活性均升高，抗病品种(系)和中抗品种(系)高于感病品种(系)，活性峰值的出现早于并高于感病品种(系)，且峰值的高低与品种(系)抗性呈显著正相关。说明PoD与成株期抗性有重要关系，所以PoD活性可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6．1．2PPO酶活性与抗病性的关系PPO是酚类物质氧化的主要酶，氧化可产生醌类(咖啡酸、绿原酸等)，以杀死病原菌：或形成木质素合成的前体一预苯酸，从而修复伤口、抑制病原菌的繁殖【l”J。故经以上两种功能PPO起到保护寄主的作用，使寄主免于病原菌的危害，表现为抗病。在抗病机制的研究中，大多数学者认为一般在亲和性互作中PPO活性降低，非亲和性互作中PPO活性升高，PPO的含量与抗病性成正比。如黄瓜感染黑星病菌【l“J、霜霉斟¨9】、烟草感染TMv【”61后，PPo活性均升高，在接种前抗病品种(系)PPo含量比感病品种(系)高，接种后的增幅也大于感病品种(系)，且黄瓜感染霜霉菌后抗性品60 种(系)出现了2条新的酶带，中抗品种(系)只增加1条，而感病品种(系)没有新酶带出现。这些充分体现了PPO在抗病中的作用。但陈建中等⋯2】在研究苹果被轮纹病菌侵染后PPO活性的变化时得出感病品种(系)感染轮纹病菌后PPO活性升高，活性高峰出现早，且高活性持续时间长。Ekbote等【眩o】的研究也指出花生的感锈病品种(系)在显症前PP0活性明显升高，而抗病品种(系)则变化不大。邵金旺等【12l】在研究甜菜感染丛根病时发现，感病品种(系)感病后PPO活性增加，但在抗病品种(系)中未见一致的活性变化规律。本研究结果表明，番茄苗期接种青枯菌后，抗病品种(系)和中抗品种(系)叶片PP0活性均升高，第3天达到高峰，且始终高于对照；而感病品种(系)接种后除第l天高于对照外，以后一直低于对照。各品种(系)PPO活性峰值的高低与发病株率呈显著负相关，而与成株期抗性呈正相关，所以，苗期叶片PP0酶活性可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标。番茄成株期接种青枯菌后，无论是根部还是叶片，各品种(系)pPO活性均增强，第4天达到高峰，峰值的高低与品种(系)抗性呈『F相关，而且抗病品种(系)和中抗品种(系)PPO活性始终高于对照，而感病品种(系)到后期则低于对照，说明PPO与品种(系)抗性有重要关系，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6．1．3PAL酶活性与抗病性的关系一些植物体特别是抗性品种(系)受到病原菌侵染时，会积累从莽草酸或乙酸途径合成的大量酚类化合物，而PAL是莽草酸途径的关键性酶，是酚代谢的主要酶之一””】。同时，PAL的活性与酚类化合物的合成密切相关，活性愈大，酚类合成代谢愈强，品种(系)的抗病性也就愈高。由于PAL是一种诱导酶，所以寄主被病原物侵染后，即可诱导丽大量产生。PAL也是酚类及类黄酮化合物合成的一种控制酶，能催化苯丙氨酸转化为肉桂酸，产生的许多次生产物(木质素、酚类、香豆素、黄酮等)【123，投4】具有抵抗病原物侵害的作用。基于PAL的以上作用，一般由亲和性互作引起的感病反应中PAL活性降低，非亲和性互作引起的抗病反应中PAL活性升高。许多学者的研究也证明了这一点：白叶枯病菌侵染水稻⋯41，枯萎病菌侵染西瓜【125】，黑星病菌‘1‘81、镰刀菌⋯5】侵染黄瓜叶组织后P札活性均显著上升，感性品种(系)叶组织反应迟钝，活性增加微小，抗性品种(系)的增加幅度明显大于感病品种(系)。但是，铃木直治等【l叫则认为，健全植物在被病原菌侵染后，为了生成～些抗菌物质，已有的PAL已很充分，PAL并不参与抗病反应．关于酶活性的变化趋势，多数学者认为感病后植物体内PAL活性的变化呈一迅速上升的单峰曲线⋯4，⋯】；但吴元华掣¨31在研究烟草接种PVY，叶茂柄等{Ⅲl在研究中发现，小麦感染赤霉病后PAL活性变化有2个高峰，且活性一直较对照高。他们认为PAL出现第一个酶活性高峰是由于病原菌侵染后诱发了寄主以提高PAL活性为枢纽的防御反应，从而抑制病原菌在寄主中扩展：第二个高峰在显症时出现，可能是由 于病原物的生长和繁育已造成寄主细胞的破坏而刺激了寄主PAL活性的升高。本研究结果表明，番茄苗期接种青枯菌后，各品种(系)叶片PAL活性均升高，第3天达到高峰，峰值的高低与品种(系)发病株率呈显著负相关，而与成株期抗性呈正相关，而且接种后抗病品种(系)和中抗品种(系)PAL活性始终高于对照，而感病品种(系)接种后3天内高于对照，此后低于对照，所以，苗期叶片PAL酶活性可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标。番茄成株期接种青枯菌后，无论是根部还是叶片，各品种(系)PAL活性均升高，抗病品种(系)和中抗品种(系)于第2天和第6天出现两个活性高峰，但根部第一个峰值低于第二个，叶片j下好相反，第一个高于第二个，而感病品种(系)只在第4天出现一个高峰，且峰值低于抗病品种(系)和中抗品种(系)，峰值的高低与品种(系)抗性呈正相关，说明PAL与品种(系)抗性有重要关系，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6．1．4SOD酶活性与抗病性的关系1969年，McCord和Fridivich第一次报道了从牛血红细胞中发现的超氧化物歧化酶的酶学特征，并证明其功能是清除O：。。之后在植物体中也发现了此种酶，其主要功能是将0。‘一歧化为H：0：(20。一+2H+一H。O：+O。)。植物体中SoD主要以Fe—s0D、Mn—sOD和cu／zn—sOD形式存在于细胞质、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中，金属离子位于酶活性中心，其存在与否直接影响酶活。SOD一部分是组成型表达，另一部分是诱导型或受生长发育调节的。不同植物病害系统中soD活性变化一般是不同的㈣¨4，¨9，127．∞]。陈利峰等在研究接种赤霉病菌后小麦品种(系)间酶活性变化时指出抗病品种(系)望水白接种后sOD活力显著降低，始终低于对照；中抗品种(系)扬麦4号接种后12小时比对照有较明显下降，之后一直高于对照：感病品种(系)宁麦6号接种后12—14小时soD活力略有下降，之后也一直高于对照。并且接种前扬麦4号和宁麦6号健穗纽织soD活力较低，且越到后期酶活力越低：而望水白中SOD活力各个时期均比其它两个品种(系)高。BuonaurioR等研究菜豆感染锈菌时也得出了相似的结果。同时，陈利峰等、王雅平等在研究小麦感染赤霉病后SOD活性变化时发现，感病品种(系)有新同工酶出现。以上试验证明，SOD活性与植物感病性成正比，与抗病性成反比。但也有不少相反的报道‘¨9，‘291。本研究结果表明，番茄苗期接种青枯菌后，各品种(系)叶片SoD活性变化紊乱，忽高忽低，其原因可能是青枯菌侵入后，寄主体内活性氧代谢紊乱，失去平衡，导致SOD变化紊乱，说明活性氧可能在寄主与青枯菌互作中起着至关重要的作用，所以，苗期叶片SOD酶活性是否可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标还有待于进一步研究。番茄成株期接种青枯菌后，无论是根部还是叶片，各品种(系)SOD活性均升高，但根部第2天达到高峰，而叶片第4天才‘达到高峰。soD活性峰值的高低与品种(系)抗病性呈正相关，说明SOD与品种(系)抗性有重 要关系，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6，1．5CAT酶活性与抗病性的关系cAT也是～种重要的内源活性氧清除剂．与POD在清除活性氧方面的作用基本一致．对H。O。和·OH也有清除作用，虽然该反应速度快，但由于CAT对H?O：和·OH的亲和性低，因此在清除病原物与植物相互作用过程中产生的H：O。时作用可能有限。不过，某些POD对H：O。的亲和性要比cAT高得多。二者协调作用，以维持植物体内H：O。和·OH的正常代谢水平lJ“J。与soD活性变化基本一致，一股由亲和性互作引起的感病反应中CAT活性升高，非亲和性互作引起的抗病反应中CAT活性则基本不变甚至略有下降，大部分植物病理学家的研究都证明了这一点㈣川】。而李兰真等fb21的研究指出，小麦籽粒形成期之后，无论抗锈品种(系)还是感锈品种(系)旗叶的CAT活性都升高。汪耀富等【l”1的研究也与上述情况不一致。本研究结果表明，番茄苗期接种青枯菌后，各品种(系)叶片cAT活性变化也很紊乱，进一步说明青枯菌侵染后，体内活性氧代谢变得很紊乱，从而导致SOD和CAT活性变化紊乱，说明活性氧可能在寄主与青枯菌互作中起着至关重要的作用，所以，苗期叶片CAT酶活性是否可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标还有待于进一步研究。番茄成株期接种青桔菌后，各品种(系)根部cAT活性先降低后升高，第6天达到高峰，抗病品种(系)和中抗品种(系)接种后4天内低于对照，此后一直高于对照，并始终维持较高水平，而感病品种(系)除第6天高于对照外，其余各天均低于对照。从叶片来看，接种后抗病品种(系)cAT活性下降，第2天降至最低，此后开始升高，第4天后一直高于对照，第6天达到高峰；中抗品种(系)接种后2天内基本没有变化，此后升高，并始终高于对照，第6天达到高峰；感病品种(系)接种后cAT活性缓慢升高，第6天达到高峰，此后下降，第8天后一直低于对照。关于接种初期cAT活性下降的原因可能是青枯菌侵入后。寄主体内产生了水杨酸，而水杨酸结合蛋白与过氧化氢酶高度同源，并且有过氧化氢酶活性，所以CAT活性有所下降。综上所述．接种后番茄根部与叶片cAT酶活性变化不太～致，而且接种初期cAT酶活性下降的真『F原因尚不清楚，所以，cAT酶活性是否可以作为番茄抗青枯病的生理尘化指标还需进一步研究。6．2生化物质与抗病’}生的关系6．2．1木质素与抗病性的关系木质素是植物体内一种重要的物理抗菌物质。它与HRGP(富合羟脯氢酸糖蛋白)一起作为结构屏障物，起强固细胞壁的作用，保护细胞免受病原菌的侵害。在植物一病原物互作过程中，木质素的增加是植物抵御病原物，增强抗病性的重要机制之一。现己有研究表明：在病原菌与寄主植物互作中抗病品种(系)木质素的积累速度和积累量高干感病品种(系)Ⅲ31，随着植物年龄的增长，在组织中的 木质素含量显著增加Il”j。在植物一病原菌相互作用中，寄主细胞壁木质化是抗病反应的特征之一。木质素与植物的抗病性密切相关，作为阻止病菌生长繁殖的屏障，是近年来受到重视的抗病物质。它是通过莽草酸苯丙烷类代谢途径形成的，是许多小分子酚类聚合在一起形成的一种分子量很大的高聚物。木质素的形成与苯丙烷代谢产生的松柏醇有关，松柏醇产生的甲基化酮与HRGP之间共价交错相连，从而导致了木质素在细胞壁的沉积。木质素物质的累积是抗侵入的主要因素，这些物质可抑制病菌生长，干扰外多聚半乳糖醛酸的降解，并使侵入的菌丝木质化¨351。很多研究结果表明[125136。Ⅲ】，病原菌侵染植物后，木质素含量增加，且抗病品种(系)高于感病品种(系)。本研究结果表明，番茄成株期未接种处理，无论是根部还是叶片，木质素含量与品种(系)抗病性梯度一致。接种后，无论是根部还是叶片，木质素含量均升高，抗病品种(系)始终高于中抗品种(系)，后者又高于感病品种(系)，而且木质素含量增幅与品种(系)抗病性梯度一致，说明木质素在番茄抗青枯病过程中起着重要作用，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6．2．2总酚含量与抗病性的关系酚是植物重要的次生代谢产物，参与许多生理生化过程，如氧化还原反应、木质化反应和对病原菌毒素的反应旧，。4。，川”。植物组织为了抵抗病原菌的扩展，需要有酚类物质的参与。病原菌侵入可以引起酚类物质以及与酚类代谢有关的几种酶活性变化【”3114‘”。酚类化合物的作用有如下几点：(1)植物特别是抗病品种(系)在受到病原菌侵染时会积累从莽草酸途径或乙酸途径合成的大量酚类化合物，其中很多类有抗菌素的性质，既能杀死寄主细胞，引起过敏反应，也能杀死侵染的病原物陬⋯】；(2)酚类代谢物质被证实是潜在的抗病因素．酚被氧化成活性更高的醌，而醌对病原菌十分有毒，酚和醌是氧化磷酸化的强烈解偶联剂[1引1142】；(3)酚类物质能够有效地抑制病原菌细胞降解酶的活性㈣j。宋铁等[H2】报道抗病性梨品种(系)比感病品种(系)固有酚含量高，而且病原侵入后，酚含量升高很快。陈捷等[14“，庄炳昌等⋯报道酚类物质与抗病性有密切关系。但是，谢为龙【”M研究苹果褐纹病时发现游离酚与苹果对褐纹病抗性无关。本研究结果表明，番茄成株期接种青枯菌后，无论是根部还是叶片，各品种(系)总酚含量均升高，抗病品种(系)和中抗品种(系)第2天和第6天出现两个高峰，且第一个峰值高于第二个，而感病品种(系)第4天达到高峰，峰值显著低于其余品种(系)，这与PAL活性变化规律一致。接种后，各品种(系)总酚含量均始终高于对照，且峰值高低与品种r系)抗性梯度一致，说明酚类与品种(系)抗病性密切相关，可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。6．3同工酶与抗病性的关系近年来，植物抗病性生化机制的研究已成为热点，许多学者试图运用同工酶 作为工具来研究植物抗感病问题⋯1·H4t¨引。因为同工酶是基因表达后分子水平的表型，研究同工酶谱就有可能联系基因、基因表达和代谢、细胞和整体表型的关系。它是生物体中的天然标记，可反映出生物体内的各种变化，其中包括感病后发生的变化。对于同工酶与抗病的关系，徐秀芳等¨46J对接种TMV后不同抗性番茄同工酶的分析表明苗期根中过氧化物酶同工酶的活性，抗性品种(系)先于敏感品种(系)降低，总谱带数减少；叶片中过氧化物酌同工酶总谱带数变化规律与根中一致，因此，同工酶可作为一种生化指标鉴定和筛选抗性品种(系)。由此推断，这些变化是病毒参与代谢的结果，说明基因表达状况与抗病有相关性。吕余殿等【14”也得出了类似的结论，他们测定了棉花枯萎病菌的42个菌系的酯酶同工酶，其主酶带区分为三个类型。他们认为同工酶谱是病菌内部生化特征的反映，与病菌致病力有～定相关性，可作为鉴别寄主、鉴定棉花枯萎病菌生理型的辅助方法。多细胞植物的发育是一系列基因依次顺序表达的过程，同工酶在植物体内的普遍存在以及与生长发育的关系提供了基因表达的灵敏指标。同工酶的变化是寄主对病原物入侵的保卫反应，但是还没有证据说明植物的病害是由于阻遏了特殊基因的表达。这与用生长素(1AA)处理后引起的酶谱变化不同，而是所有被侵染组织的酶活性都成比例地增加，而且接种后感病品种(系)比抗病品种(系)产生新的酶带多。正如沈其益【M8l所提出的，高度抗病的品种(系)接种后同工酶变化最小。另有一些意见不同的报道认为，接种后同工酶活性的升高，是抗性品种(系)适应病原侵染所引起的变化，以延迟由于病原物侵入引起的衰老，从而体现其抗病性。张士文等【¨91的研究指出，番茄芽期到花芽分化期酯酶同工酶活性较弱，现蕾期开始增强．第一花序结果时最强，以后随着植物的衰老而减弱，这一实验结果为上述观点提供了佐证。同样，有人【150】分析了烟草感染cMV后，发现叶中过氧化物酶同工酶的变化时指出，CMv感染引起植物过氧化物酶活性的升高和植物衰老引起的酶活性的变化相似。因此，可以推测，通过延迟衰老可能也是一种抗病的抵御机制。有的作者还提出【151¨“，不同植物的感病机制不完全相同，抗病性与同工酶基因表达之间的关系依同工酶的种类不同也有不同。目前抗病性的生化机制尚不完善，有些现象还不能用现有的机制来解释。但己有研究表明，感病性通常是由一个显性基因或细胞质控制(可能是线粒体基因)。与抗性组织相比，感病性组织对病原产生类似的但更为强烈的生化反应。生物体内的同工酶是基因与外部性状的连结物，为了有效防治病害造成的减产甚至绝产，可见利用同工酶与抗病性之间存在的相关性，深入探讨植物抗病的生化机制是十分必要的。本研究结果表明，番茄成株期接种青枯菌后，抗病品种(系)和中抗品种(系)根部和叶片P。D同工酶没有出现新酶带，只是各条 酶带颜色加深，活性增强，而感病品种(系)根部和叶片各出现l条新酶带，其余酶带均增强。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)的根部和叶片PP0同工酶均出现1条新酶带，其余各条酶带均增强，而感病品种(系)的根部和叶片均出现2条新酶带．其余酶带也增强。接种后，抗病品种(系)和感病品种(系)的根部和叶片SOD同工酶均出现2条新酶带，而中抗品种(系)根部出现3条新酶带，叶片出现2条新酶带，其余酶带均增强。由此可以看出，番茄感染青枯菌后，抗病品种(系)和中抗品种(系)的P【)D和PPO同工酶变化比感病品种(系)小，而抗病品种(系)和感病品种(系)的SOD同工酶变化比中抗品种(系)小，所以，同工酶与番茄抗青枯病性的关系有待于进一步研究。 结论1致病性测定经过烟草过敏试验和常规接种测定，供试6个青枯菌菌株均具有致病性，且致病性由强到弱依次为HF、Hx、Ys、FY、HN2、HNl。2青枯菌生化变种的测定青枯菌生化变种的测定结果表明，仅FY菌株不能利用甜醇，但能使3种双糖和另外2种己醇产酸，属生化变种III的一个亚型，即III．1，而其余5个菌株均属生化变种III。3青枯菌胞外酶活性的测定青枯菌胞外酶活性的测定结果表明，随培养时间的延长，果胶酶和纤维素酶两种酶活性都逐渐升高，培养7～9天酶活性均达最大值，但果胶酶活性最大值与菌株致病性之间相关性不大(r：O．6371)，而各菌株纤维素酶活性最大值与致病性高度正相关(r=O．9526)。4不同番茄品种(系)苗期抗病性鉴定番茄苗期采用伤根灌注法接种，接种浓度为3×108个菌／ml。分别于接种后1周、2周、3周进行发病株率调查。结果表明，接种后l周，5个品种(系)发病株率均已超过60％，均属感病品种(系)，但品种(系)间发病株率存在显著差异，强丰最高，为95．2％，新星最低，只有6l-1％，其余品种(系)介于两者之间。随着时间的推移，各品种(系)发病株率继续升高，但品种(系)问仍存在显著差异，强丰最高，为100％，新星最低，只有83．3％，其余品种(系)介于两者之问。5不同番茄品种(系)成株期抗病性鉴定番茄成株期采用伤根灌注法接种，接种浓度为6×108个菌／m1。接种后，从第9天丌始每隔3天调查一次，调查记载植株桔死数。结果表明，新星、夏钻石、黄山l号3个品种(系)为抗病品种(系)，抗性指数分别为12．9、12．3、10．9，黄山2号抗性指数为8．9，属中抗品种(系)，而强丰抗性指数为2．5，属感病品种(系)。6番茄苗期接种青枯菌后防御酶活性的变化不同番茄品种(系)苗期未接种处理各品种(系)叶片中5种防御酶(PoD、PPO、PAL、sOD、CAT)酶活性均在一定范围内波动，但幅度不大。接种后，叶片中POD、PPO、PAL3种酶活性均升高，但品种(系)问差别较大。新星、夏钻石、黄山1号、黄山2号4个品种(系)接种后第3天，PPO和PAL活性达到高峰，PoD活性第j天达到高峰，此后3种酶活性均下降，但始终维持较高水平；而强丰叶片POD活性第l天就达到高峰，PAL活性第3天达到高峰，PP0活性第5天达到高峰。总体上，接种后新星、夏钻石、黄山l号、黄山2号4个品种(系)3种酶活性均高于对照，3种 酶活性峰值和最大增幅均高于强丰，且峰值和最大增幅与品种(系)发病株率呈负相关。接种后，各品种(系)叶片SOD和CAT活性变化紊乱，没有规律。综上所述，接种青枯菌后番茄叶片POD、PP0、PAL3种酶可以作为早期筛选抗病品种(系)的一项辅助指标，而sOD和CAT2种酶还有待于进一步研究。另外，由于本研究所使用的番茄品种(系)较少，得到的结果可能存在一定偏差，还需在更多番茄品种(系)上进行进一步研究。7番茄品种(系)抗青枯病的生理生化机制不同番茄品种(系)成株期未接种处理各品种(系)根部和叶片5种防御酶(POD、PPO、PAL、sOD、CAT)酶活性均在一定范围内波动，但幅度不大。抗病品种(系)和中抗品种(系)根部和叶片POD和PAL活性始终高于感病品种(系)。接种后，无论是根部还是叶片，各品种(系)POD、PP0、PAL、soD4种酶活性均升高，其中PAL和SoD表现较为敏感，活性高峰出现得比另外2种酶早，而且PAL出现两个活性高峰，其余3种酶只有一个活性高峰。各品种(系)根部PoD、PP0、PAL酶活性的峰值和最大增幅均高于叶片，SoD恰好相反。总体上，无论是根部还是叶片，接种后抗病品种(系)和中抗品种(系)4种酶活性均高于对照，而感病品种(系)前期高于对照，后期低于对照。各品种(系)4种酶活性峰值的高低与品种(系)抗病性均呈正相关。接种后，各品种(系)根部CAT活性均先降低后升高，第6天达到高峰，且峰值和最大增幅与品种(系)抗病性呈正相关。抗病品种(系)叶片cAT活性变化与根部相同，中抗品种(系)接种后2天内基本没有变化，此后升高，弗始终高于对照，第6天达到高峰：感病品种(系)接种后cAT活性缓慢升高，第6天达到高峰，此后下降，第8天后一直低于对照。综上所述，番茄成株期接种青枯菌后体内POD、PPO、PAL、soD4种酶可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标，而cAT还有待于进一步研究。另外，由于本研究所使用的番茄品种(系)较少，得到的结果可能存在一定偏差，还需在更多番茄品种(系)上进行进一步研究，而且接种后番茄体内各种酶活性发生变化是现象还是本质，这个问题对番茄抗青枯病的机制非常重要，它的解决将为彻底搞清番茄抗青枯病的机制打下翠实的基础。番茄成株期未接种处理，无论是根部还是叶片，木质素含量与品种(系)抗病性梯度一致。接种后，无论是根部还是叶片，木质素含量均升高，抗病品种(系)始终高于中抗品种(系)，后者又高于感病品种(系)，而且木质索含量增幅与品种(系)抗病性梯度～致。番茄成株期接种青枯菌后。无论是根部还是叶片，各品种(系)总酚含量均升高，抗病品种(系)和中抗品种(系)第2天和第6天出现两个高峰，且第一个峰值高于第二个，而感病品种(系)第4天达到高峰，峰值显著低于其余品种(系)，这与PAL活性变化规律一致。接种后，各品种(系)总酚含量均始终高于对照，且峰值高低与品种(系)抗性梯度一致。综上所述，番茄成株期接种 青槠菌后体内木质素含量和总酚含量可以作为番茄抗青枯病的一项生理生化指标。番茄成株期接种青枯菌后，抗病品种(系)和中抗品种(系)根部和叶片POD同工酶没有出现新醇带，只是各条酶带颜色加深，活性增强，而感病品种(系)根部和叶片各出现1条新酶带，其余酶带均增强。接种后，抗病品种(系)和中抗品种(系)的根部和叶片PPO同工酶均出现l条新酶带，其余各条酶带均增强，而感病品种(系)的根部和叶片均出现2条新酶带，其余酶带也增强。接种后，抗病品种(系)和感病品种(系)的根部和叶片SOD同工酶均出现2条新酶带，而中抗品种(系)根部出现3条新酶带，叶片出现2条新酶带，其余酶带均增强。 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