假单胞菌lip35低温脂肪酶基因地克隆及其在毕赤酵母中地表达研究

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1、摘要低温脂肪酶能在低温的条件下有效发挥催化作用，一般由低温微生物产生。但低温微生物需要在低温的环境下培养而且表达量非常低，这就严重制约了低温脂肪酶的生产和应用。而将低温脂肪酶基因在常温宿主中表达即基因工程菌的构建为这一问题的解决提供了新的思路。近几年，国内外学者对微生物低温脂肪酶的基因工程研究做了大量工作，并取得了很多重要成果。到目前为止已克隆了多种微生物的低温脂肪酶基因，尤其是假单胞菌属的研究最为深入。但假单胞菌脂肪酶基因具有较高的G+C含量，且氨基酸序列同源性不高，因此通常采用构建基因文库，氨基酸测序及杂交的方法来得到假单胞菌脂肪酶基因序列。本研究通过P

2、CR扩增得到试验菌株Pseudomonassp．1ip35的16SrDNA序列，核苷酸序列测定和同源序列搜索后确定本试验菌株Pseudomonassp．1ip35为第三亚组脂肪酶产生菌。因此，从GenBank中下载多条第三亚组脂肪酶基因序列，利用DNAMAN6．0软件进行多重序列比对(MultipleAlignment)，根据第三亚组脂肪酶中具有很高保守性的活性中心区域设计克隆起始上游引物，然后又在其下游一个较保守的区域设计下游引物。克隆得到活性中心区域序列，通过测序和同源搜索发现所克隆序列确实为脂肪酶基因序列并且目的基因为第三亚组脂肪酶基因。然后采用普通P

3、CR与反向PCR相结合的方法，成功的从试验菌株Pseudomonassp．1ip35中克隆得到脂肪酶lipA基因全长序列和lipB基因部分序列。其中lipA基因全长1701bp，可编码567个氨基酸残基，一级结构中包括第三亚组脂肪酶中高度保守的Gly-His．Ser-Leu-Gly-Gly序列(在氨基酸残基的153．158位)。起始密码子为ATG，终止密码子TAG。由该核苷酸序列推导出的氨基酸序列与已发表脂肪酶氨基酸序列一致性最高为74％。lipB基因部分序列长1251bp，此克隆序列的氨基酸残基205．210处为脂肪酶的高度保守区域即活性中心序列GHSLG

4、G。密码子ATG5’端相隔7bp是“GAGG”序列，符合原核生物SD序列的特点。以pPIC9K为表达载体，以GSll5为表达宿主菌，成功构建重组表达质粒pPIC9K．1ipA，经甲醇诱导表达，能够分泌有脂肪酶活性的表达产物，因此证明本研究所克隆的脂肪酶基因lipA确实为脂肪酶开放阅读框。另外本研究就重组毕赤酵母构建方法和低温脂肪酶基因的表达做了初步研究。Pseudomonassp．1ip35的16SrDNA序列已在GenBank中注册，注册序列号为：EU439251；lipA基因序列及由其翻译得到的氨基酸序列已在GenBank注册，登录号分别为EU41428

5、8，ABY86751。关键词：低温脂肪酶；基因克隆；表达；毕赤酵母；Pseudomonassp．1ip35Thegenecloningofcold-adaptedfipasefromPseudomonassp。Hp35andexpressioninPichiapastorisAuthor：．Cai-hongWangSupervisor．．Y'mg-minJiaRun—fangGuoMajor：．microbiologyAbstractLow··adaptedlipasesproducedbylow··temperaturemicroorganismscall

6、catalysisatlowtemperature．However,low-temperaturemicroorganismsneedlowtemperaturegrowenvironmentsandhavelowexpressionleveloflipasewhichhaverestricteditsindustrialproductionandapplication．Moreover,genecloningandheterogenousexpressiongiveanowapproachtopotentialindustrialutilizationof

7、low-adaptedlipases。However,owingtothelowhomologyobservedamongdifferentlipasegenes，anovellipasegeneisverydifficulttobeamplifiedbyPCR．Theusualstrategyfor曲乏aill主玎glipasegenesistoconstructaDNAlibrary,toanlyzetheaminoacidssequenceortohybridduetohigllG+Cvalueandlowsimilaritiesoflipasegen

8、es．Usingthesemethodssevera