猪嵴病毒vp1基因克隆与表达及抗体检测elisa方法的建立

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田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立研究生：田野导N-秦爱建。教授摘要猪嵴病毒(Porcinekobuvirus，PKV)是微RNA病毒科嵴病毒属的成员，可能是导致猪胃肠炎的病原之一。自2007年首次发现以来，在全球大多数养猪国家陆续发现该病毒的感染。急性胃肠炎是导致幼儿、幼畜死亡的一个主要原因，虽然猪嵴病毒感染与猪胃肠炎之间的关系尚不明确，但是临床发现该病毒与宿主存一定的适应关系。研究表明，猪群各个生长阶段均可感染PKV，且该病毒常与其他肠道病毒混合感染，或是其他疾病发生的诱导因素，其给现代养猪业带来了潜在危害。猪嵴病毒尚不能在体外细胞中进行培养，给该病毒的相关研究工作造成一定的困难。在猪嵴病毒感染的检测与诊断方面，主要采用RT-PCR技术直接检测临床样本，血清学技术用于猪群中猪嵴病毒感染状况的调查与分析尚未见文献报道。因此，建立特异、敏感的血清学技术，并用于猪群中猪嵴病毒感染的血清流行病学调查是十分必要的。PKV的结构蛋白VPl具有良好的免疫原性。本研究对VPl基因进行了克隆和原核表达，并利用表达的VPl蛋白建立了检测PKV抗体的间接ELISA方法，以期为PKV感染的血清学调查与监测提供一种可靠的技术手段。1．猪嵴病毒VPl基因的克隆与表达运用分子生物学软件DNAstar和ABCpred对猪嵴病毒XD株的VPl蛋白进行了抗原表位信息分析，结果显示猪嵴病毒VPl蛋白的785aa一1038aa区域具有较高的抗原性和亲水性。设计扩增编码该区域基因片段的引物，应用RT—PCR方法特异性扩增XD株VPl基因片段，将其克隆至原核表达载体，成功构建得到重组质粒pET一32a—XDVPl，并在Ecoli(DE3)中诱导表达。在诱导温度为28。C，IPTG终浓度为0．05mmol／L，诱导3h的条件下可获得 扬州大学硕士学位论文2高效表达的可溶性重组蛋白VPl。用大肠杆菌细菌裂解液对临床猪血清进行吸收，去除非特异性抗体，然后再利用重组蛋白VPl进行Westernblotting检测，筛选获得PKV阳性血清。2．猪嵴病毒抗体检测ELISA方法的建立用纯化的重组蛋白VPl为包被抗原建立了检测PKVVPl抗体的间接ELISA方法，且确定了ELISA的最适工作条件。结果显示，重组蛋白最适包被浓度为0．4pg／mL，待检血清适宜稀释度为1：50，HRP．山羊抗猪IgG工作浓度为1：4000，待检血清和酶标二抗的反应条件为37。C30min，阴阳性临界值为O．35。建立的ELISA方法具有良好的特异性，与猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒阳性血清无交叉反应。应用建立的ELISA方法对临床采集华北地区的8个猪场的720份猪血清样本进行了PKV抗体检测。结果表明，猪场PKV抗体阳性率介于33．33％．98．89％，总阳性率为81．25％，提示我国华北地区猪场PKV感染较为普遍，但猪场之间的感染状况有所不同。综上结果，本研究建立的PKVVPl抗体检测ELISA方法可用于PKV感染的血清学调查与监测。关键词：猪嵴病毒；VPl；原核表达；间接ELISA 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立3GeneCloneandProkaryoticExpressionofStructuralProteinVP1ofPorcinekobuvirusandDevelopmentofELISAforDetectionofAntibodytoVP1AbstractPorcinekobuvirus(PKV)isamemberofthegenuskobuvirus，familyPicomaviridae．SomepapersreportedthatPKVispotentiallyassociated、析tIlporcineacutegastroenteritis．Swineinfectionwiththevirusarefoundinmostcountriesalloftheworldsince2007．Acutegastroenteritisisamajorcauseofdeathforyoungchildrenandyounganimals．TherelationshipbetweenPKVandswinegastroenteritisisnotclear,butthevirusWasfoundinclinicanadaptiontothehost．PigsatthedifferentagesCanbeinfected、析thPKV,whichwereCO—infected、析t11otherenterovirus．Itmaybeadisease-inducedfactor,haspotentialharmtomodernpigindustry．Atpresentwehavesomedifficultiestodoresearchonthevirus，becausePKVcannotbeculturedinvitro．OnlyRT-PCRandserologicaltechniqueswereusedforthevirusdetectionofclinicalsamplesandepidemicinvestigation．PKVanalysishasnotbeenreported．Inthisstudy,weclonedandexpressedPKVVP1gene，andestablishedanindirectELISAmethodforPKVVP1antibodiesdetection．ItwillpromotetheserologicaldiagnosisandsurveillanceofPKV．1．GeneCloneandProkaryoticExpressionofStructuralProteinVPlofPorcinekobuvirusTheantigenepitopesinformationofVP1proteinofPKVXDstrainwasanalyzedbythemolecularbiologysoftwareDNAstarandABCpred．Theresultsshowedthefragmentbetween785aato1038aainVPlhasstrongantigenicityandhydrophilicity．Theprimersweredesignedbasedonthisfragment．ThefragmentofVP1geneofXDstrainWasamplifiedbyRT-PCR,thenitWasclonedintotheprokaryoticexpressionvectortoconstructrecombinantplasmidpET-32a-XDVPlfortheinducibleexpressioninE．coli(DE3)．Thehigh-levelexpressionofsolublerecombinantproteinVPlWasobtainedunder28。Cofinducedtemperature，0．005mmol／LofIPTGfinalconcentrationfor3hours．ThepositiveswineserumtoPKVWasidentifiedbywestemblotting，whichWasfirstCO—incubatedwitlllysateofEscherichacolitoabsorbnon．specificreaction． 扬州大学硕士学位论文42．DevelopmentofELISAforDetectionofAntibodytoVPlAnindirectELISAmethodforthedetectionofPKVVP1．wasestablishedwiththepurifiedrecombinantproteinVP1．OptimaloperatingconditionsoftheELISAreactionweretested．Theresultsshowedthat0．4烬／mLwasfortheoptimalcoatingconcentrationoftherecombinantprotein；1：50forthetestserum；1：4000forHRP--labeledgoatanti--pigIgG；37"Coftemperatureand30minincubationfortheantibodyreaction．ThethresholdforthepositiveserumwasODvalueO．35．TheELISAmethodshowedgoodspecificityandnocross—reactionwiththeserumtOporcineepidemicdiarrheavirusandpositivetransmissiblegastroenteritisvirus．720porcineserumsamplesfrom8pigfarmswerecollectedanddetectedwitlltheestablishedmethod．TheresultsshowedthattheVPlantibodypositivefrom33．33％tO98．89％，averagepositiveWas81．25％，whichindicatedthatthepositiverateofPKVWasvariousindifferentpigfarms．Conclusions：TheVPlindirectELISAcanbeusedinPKVsera-diagnosisandclinicalmonitoring．Keywords：Porcinekobuvirus，viralprotein1，prokaryoticexpression，indirectELISA 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立目录摘要⋯⋯⋯⋯o⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3图表目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7英文缩写对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111国内外研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．1猪嵴病毒的分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．2猪嵴病毒基因组结构及功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．3猪嵴病毒的发现与感染状况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．4猪嵴病毒的危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯151．5猪嵴病毒感染的诊断与监测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162研究目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163研究内容与技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．1研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．2技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．1猪嵴病毒阳性样本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．191．2血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．3载体与菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．4主要试剂和溶液⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．5主要仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．6猪嵴病毒核苷酸参考序列⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．1原核表达重组质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2重组质粒pET-32a-XDVPl的诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．3表达产物的检测、鉴定和纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．4PKVVPl抗体检测ELISA方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．5猪嵴病毒抗体检测ELISA方法的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37 扬州大学硕士学位论文6结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯381．猪嵴病毒VPl抗原表位分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．表达猪嵴病毒VPl基因重组质粒的构建与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．382．1PKVVPl基因片段的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．2PKVVPl原核表达重组质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯392．3PKVVPl原核表达重组质粒的序列测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403PKVVPl原核表达重组质粒的诱导表达和重组蛋白的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403．1．PKVVPl原核表达重组质粒的诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403．2重组蛋白的可溶性及纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯423．3重组蛋白的Westernblotting分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯444PKVVPl抗体检测ELISA方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．444．1重组蛋白包被浓度和二抗稀释度的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯444．2重组蛋白包被条件的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯454．3血清稀释度的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯464．4封闭液及血清稀释液的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．5封闭时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．6血清样本反应时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯484．7酶标二抗反应时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯494．8底物反应时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯494．9阴阳性临界值的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯504．10交叉反应试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．524．11．重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．524．12PKV抗体检测的间接ELISA方法的操作程序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯535PKV抗体检测ELISA方法的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．54讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立7插图清单图表目录图1猪嵴病毒(S．1．HUN株)基因组结构及与人类爱知病毒和牛嵴病毒(U．1株)的基因组结构比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13图2爱知病毒和牛嵴病毒(U．1)的SDS．PAGE检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．14图3pET-32a-XDVPl原核表达重组质粒的构建模式图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．30图4PKVXDVPl抗原指数和亲水性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38图5PKVXDVPl基因片段的RT-PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39图6菌液PCR扩增PKVXDVPl基因片段⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39图7原核表达重组质粒pET-32a-XDVPl的酶切鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．40图8不同时间诱导表达的重组蛋白VPl的SDS．PAGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41图9重组蛋白VPl不同温度的诱导表达的SDS．PAGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41图10重组蛋白VPl在不同浓度IPTG的诱导表达的SDS．PAGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯42图11重组蛋白XDVPl的可溶性的SDS．PAGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43图12纯化的重组蛋白VPl的SDS．PAGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一43图l3重组蛋白VPl的Westemblotting分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一44表格清单表1用于扩增XDVPl基因的引物序列⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26表2重组蛋白VPl最佳抗原包被浓度和酶标二抗稀释度的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．45表3重组蛋白VPl最佳包被条件的确立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．46表4最佳血清稀释度的确立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一46表5封闭液和血清稀释液的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．47表6最佳封闭时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一48表7血清样本反应时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．48 扬州大学硕士学位论文表8酶标二抗反应时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．49表9底物反应时间的确立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．50表10阴阳性临界值的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51表11ELISA的交叉反应试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52表12PKVVPl．ELISA的批间重复试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52表13PKVVPl．ELISA的批内重复试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53表14我国8个猪场PKV检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一54 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立9英文缩写对照表 扬州大学硕士学位论文PEDVporcineepidemicdiarrheavirus～猪流行性腹泻病毒PKVporcinekobuvirus猪嵴病毒PNoVporcinenorovirus猪诺瓦克病毒PSaVporcinesapovims猪札幌病毒RT-PCreversetranscriptionpolymerasechain反转录多聚酶链式反应Rreactionr／minrevolutionperminute转／分钟RNAribonucleicacid核糖核酸RNasiribonucleaseinhibitor核糖核酸酶抑制剂nRT-PCreversetranscription-polymerasechain反转录聚合酶链式反应RreactionUTRsuntranslatedregions非编码区VPgviralproteingenome—linked病毒末端结合蛋白Ssecond秒SDstandarddeviation标准差SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SPFspecificpathogenflee无特定病原TMBtetrabenzidine四甲基联苯胺TGEtransmissiblegastroenteritisofswine猪传染性胃肠炎岭microgram微克此microliter微升 田野：猪嵴病毒vPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立11引言猪嵴病毒(Porcinekobuvirus，PKV)于2007年在匈牙利首次发现。2008年Reuter等人相继从猪粪便样本中检测到该病毒，并将其命名为S-1一HUNn吲。此后PKV感染陆续在亚洲的中国、泰国、韩国、日本，南美洲的巴西以及大洋洲的新西兰等地报道拈。71。PKV是微RNA病毒科嵴病毒属发现的新种，迄今为止，嵴病毒属包含两个已确定的成员，即爱知病毒(Aichivirus)、牛嵴病毒(Bovinekobuvirus)和一个暂定成员——猪嵴病毒。在世界各地，特别是在发展中国家，急性胃肠炎是导致幼儿、幼畜死亡的主要原因之一，许多新发现的病毒(包括PKV)与急性胃肠炎的发生密切相关嘧。1引。尽管临床发现，在有腹泻症状的猪群中，PKV感染阳性率远高于无腹泻症状的猪群，但实际上PKV感染与猪急性胃肠炎以及腹泻性疾病之间的关系尚不明确，提示该病毒与宿主存在良好的适应关系n1。最初的研究报道认为PKV仅存在于胃肠道内，但后来证实临床健康的猪血液中也有该病毒的存在n⋯。由于猪嵴病毒的检出率相对较高，其可能与其他肠道病毒发生混合感染，亦或是疾病发生的诱导因素，甚至有可能对动物的健康造成潜在的威胁，且具有公共卫生意义n1|。目前，人们对PKV的致病特性以及在一些腹泻性猪病中的地位尚不清楚。因此，建立可靠的诊断与监测技术，开展PKV感染的血清流行病学调查是十分必要的。1国内外研究现状1．1猪嵴病毒的分类2012年ICTV第9次分类报告确立了微RNA病毒目(Picomavirales)。在分类上，猪嵴病毒属于微RNA病毒科(Picornaviridae)、嵴病毒属的成员。除嵴病毒属而外，微RNA病毒科还包括肠病毒属(Enterovirus)、心病毒属(Cardiovims)、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)、肝病毒属(Hepatovirus)、捷申病毒属(Teschovirus)、马鼻病毒属(Erbovirus)、禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)、赛内卡病毒属(Senecavirus)、呼肠孤病毒属(Parechovims)、猴禽猪肠病毒属(Sapelovims)、震颤病毒属(Tremovirus)112]。嵴病毒属的成员目前包括爱知病毒(Aichivirus)、牛嵴病毒(Bovinekobuvirus)和猪嵴病毒(Porcinekobuvims)113]，它们的原型毒株分别为A846／88-AB040749、U．1-AB084788和S．I-HUN，其中爱知病毒分 扬州大学硕士学位论文为A、B、C三个基因型【13州】。爱知病毒和牛嵴病毒最早于日本发现，“KOBU，，一词来源于日语“鼓起”或“颠簸”，因为嵴病毒的表面在电镜下是崎岖不平的【141。1．．2猪嵴病毒基因组结构及功能微RNA病毒科的成员为单股正链、无囊膜的RNA病毒，其基因组大小介于7．2kb．8．5kb之间【l5‘。爱知病毒、牛嵴病毒和猪嵴病毒的基因组全长分别为8280nt、8374nt和8210nt，它们的基因组结构具有微RNA病毒科成员的典型特征，即含有病毒末端结合蛋白(Ⅵralproteingenome-linked，VPg)、5’非编码区(Untranslatedregions，UTRs)、1个开放阅读框(openreadingframe，OI江)以及3’端非编码区(UTRs)。猪嵴病毒基因组所编码的多聚蛋白翻译后经过多级切割，最终产生3个结构蛋白和7个非结构蛋白。该多聚蛋白的氨基端为非结构蛋白L(Leaderprotein)，紧接其后为结构蛋白VP0、VP3、和VPl以及非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D(图1)。Yamashita等人经SDS．PAGE分析发现，爱知病毒和牛嵴病毒的VPl蛋白分子量分别为29kDa和27kDa(图2)。嵴病毒的基因组特点与病毒宿主密切相关12j，其与微RNA病毒科成员的不同之处在于：嵴病毒属的基因组包含有编码1个前导蛋白(Leaderprotein)和3个结构蛋白(VP0、VP3、VPl)的基因，而其它微RNA病毒，如马鼻病毒、肝炎病毒的基因组缺少编码前导蛋白的基因，口蹄疫病毒基因组具有编码4个结构蛋白的基因(VPI--VP4)[171。病毒末端结合蛋白(ViralProteinGenome一1inked，VPg)是基因组5’端共价连接的一个蛋白质，在许多动植物病毒中都存在。VPg在稳定病毒基因组结构和核定位等方面具有重要功能，其在病毒入侵过程中不同功能的体现与其剪切形式有关n8|。在5’UTRs区域，前108个核苷酸可形成茎环结构域(SL-A、SL-B和SL-C)，对病毒粒子形成和RNA复制至关重要n9J。除此之外，在5’UTRs的3’端存在有潜在的新型内部核糖体进入位点(internalribosomalentrysites，IRESⅣ)曙叫。L蛋白是编码区编码的第一个蛋白质，是嵴病毒属成员中核苷酸同源性最低的区域，但其功能尚不明确n71。Pl多聚体蛋白基因编码病毒的结构蛋白VPO—VP3一VPl，缺少VPO切割位点是嵴病毒与其它微RNA病毒的不同之处。已有研究表明，VPl是衣壳蛋白中暴露最多的免疫显性蛋白，是微RNA病毒分属的重要依据n0’2¨。2A蛋白有一个保守的结构基元(Motif)，这个基元是调控细胞增殖皿23和病毒复制窿引的细胞蛋白(H—revl07)家族所特有。2B蛋白功能不清楚。2C蛋白中含有一个高度保守的结构基元GXXGXGKT，该基元是微RNA病毒解旋酶的核苷酸结合区。3A蛋 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立13白和3B蛋白分别包括90和34个氨基酸，其中3B和VPg的氨基酸序列相同。3C蛋白是一种半胱氨酸蛋白酶，该蛋白酶切割所有的切割位点n⋯。3D区中含有RNA依赖的RNA聚合酶中的三个结构基元，KDELR、YGDD和及FLKR‘U．1fbovir}e》S—l—HUN(porcine}Aichifhuman》PIi’：11j—————●——·—_—_—__——-—_—■—一————■-I—-_—-l_·—■—-一—·————■—-_·_·_i__—--——_——●●—-一5"-tTR1。VP0、P3、pl王、2B2C3A3B3《’呻删诺^钾斜；伽躺；聊∞郇I麟琳％I110i船鼬瓣j№艚5lOOqi臻2鳓5‘陬!4101741873672232静134l酗3於钳∞1啦㈣+莛专盎●t十千十，争专，5lil；l墨纂著磊基霎磊美‘÷‘●◆毒◆●r罐5l㈣㈣762Ⅻ％们晒ml幢％1407l酣l计‰m拥1％195·371590弘I鸵468+十l§i!专，童薯马溶◆午鑫奢霉◆十0≥更★十皇矗请‘+l：◆翌摹÷◆J卜2鬯毋0呻删qer岬州蚋郴掣^娜∞|7445lOIIm∞7釉ⅫMl(*】52酶Sl5，014072i71Ⅺm跹3婪313616533595嚣l嚷}№。1w‘}a甲t龆ofa30-a．mimr-actdf90nucl。otkk：s)hq；班ndeHll2p姻lln2BI。$“m图l猪嵴病毒(S．1．HUN株)基因组结构及与人类爱知病毒和牛嵴病毒(U．1株)的基因组结构比较(引自Reuter等，2008)P1：结构蛋白；P2、P3：非结构蛋白；基因框中上方数字：核苷酸长度；下方数字：氨基酸长度；基因框纵向箭头之间／上方数字：上下两种病毒相同核苷酸数目；基因框纵向箭头之间／下方数字：上下两种病毒相同氨基酸数目：基因框纵向箭头之间％：上下两种病毒的氨基酸同源性(百分比)；基因框上方：N端切割位点。Fig．1GenomeorganizationofporcinekobuvirusS-I．HUNandcomparisonofitsstrncturewithhumanAichivirusandbovinekobuviruse(U一1)P1representsviralstructuralproteinsandP2andP3representnonstructuralproteins．Nucleotide(uppernumber)andaminoacid(10wernumber)lengthsareindicatedineachgenebox．NucleotideandaminoacididentitybetweenS-1-HUNandmembersofthetwootherspeciesofkobuvirusesareindicatedinpercentage(nucleotide／aminoacid％)ineachgene．PredictedN-terminalcleavagesitesareindicatedatthetopoftheborderineachgenebox．中p乏擎幕 扬州I大学硕士学位论文1439VPO29VPl27VPl22VP3图2爱知病毒和牛嵴病毒(U．1)的SDS．PAGE检测结果VPl的蛋白分子量分别为29kDa和27kDa(引自Yamashita等，2003)Fig．2SDS．PAGEanalysisofAichivirusandbovinekobuvirus(u—1)proteinsThemolecularmassesofVPlare29kDaand27kDa,respectively1．3猪嵴病毒的发现与感染状况爱知病毒和牛嵴病毒最早分别于1991年和2003年在日本发现【20】。爱知病毒毒株A846／88分离白急性胃肠炎患者的排泄物，牛嵴病毒U．1株从临床健康的牛只血清和粪便中检测到【241。目前，亚洲、欧洲、南美洲等地都有检测到爱知病毒的报到【16,20,25]。猪嵴病毒于2007年在匈牙利发现⋯，Reuter等人在检测杯状病毒(Calicivirus)时意外发现了猪嵴病毒。他们对2007年采集的15份10日龄以下健康猪只的粪便样本进行了RNA提取和RT-PCR检测，琼脂糖电泳结果发现所有样品中都有一条约1100nt的清晰条带。后经测序确定该基因片段大小为1065nt。序列比对结果显示，该序列与爱知病毒(A846／88株)和牛嵴病毒(U．1株)的3C(87nt)、3D(978nt)区域的同源性较高，核苷酸同源性为73％一79％，推导的氨基酸序列同源性为69％．70％。演化分析确定了S-1．HUN毒株属于嵴病毒属的一个新发现种【2¨。同年，他们对另外60份健康仔猪粪便样品，包括10日龄以下、21日龄、3月龄、6月龄各15份样品，进行杯状病毒检测时又出现了相同的结果，于是根据爱知病毒(A846／88株)、牛嵴病毒(U．1株)以及猪嵴病毒(S．1．HUN株)的保守区(3D)重新设计引物进行RT-PCR检测，结果发现60份样品中嵴病毒阳性率分别为100％(15／15)、93．3％(14／15)、20％(3／15)和46．7％(7／15)【28】。 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立152009年，虞结梅等人采用RT-PCR检测杯状病毒在中国猪场的感染状况时检测到了1185nt的非特异性条带，测序后根据该片段设计引物对2006．2007年收集的322份15日龄以下健康仔猪粪便样品(来自河北省泸县的3个猪场及其他一些散养户)进行检测，结果表明，97份样品为阳性。随后，根据牛嵴病毒(U．1株)和爱知病毒(A846／88株)的3D片段、VP0片段设计引物，RT-PCR检测发现，此新型病毒与牛嵴病毒(U—l株)和爱知病毒(A846／88株)的3D片段、VP0片段的核苷酸同源性分别为73％(与牛嵴病毒)和70％(与爱知病毒)、69％(与牛嵴病毒)和71％(与爱知病毒)[71。迄今为止，在泰国、韩国、日本、巴西以及新西兰陆续报道了猪嵴病毒的感染状况，其病毒检出率分别为99％、52％、45％、53％和17％【2．51。1．4猪嵴病毒的危害在亚洲、欧洲等地区已有猪、牛、羊和蝙蝠等动物感染嵴病毒的报导，可以从这些动物的粪便或者血清中检测到该病毒，但其与动物腹泻的确切关系尚不明了【2】。Barry等人发现，在巴西检测到的猪嵴病毒与猪腹泻有一定的相关性(p=0．0002)，并且猪嵴病毒有不存在持续感染，可发生二次感染的特点[21。然而，关于猪感染嵴病毒能否导致腹泻还是腹泻引起猪嵴病毒的感染之间的关系，目前还没有充分的证据【4J。迄今为止，6篇文献报道有腹泻样品的检测，其中，2篇文献中只采集了腹泻猪只的肛拭子样品，而没有涉及非腹泻猪只样品，腹泻样品中嵴病毒阳性率均在90％以上【9，29】；巴西、韩国、中国的3篇文献报道数据表明，腹泻猪只的肛拭子样品嵴病毒检出率高于无明显腹泻症状猪只样本【2，3，29】，而另1篇来自韩国的文献报道的数据则与之相反【301。韩国的An等人分别从3个省份的3个饲养环境良好的猪场收集119份猪只粪便样品。经检测：猪嵴病毒的阳性率为36．1％(43／119)；除此之外，119份样品中未检出猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)，A群轮状病毒(GARV)的阳性率为11．8％(14／119)；猪嵴病毒与A群轮状病毒共感染的样品有9份【30l。这意味着猪嵴病毒的感染与其他肠道感染病原可能存在一定关系。为进一步分析猪嵴病毒与猪只腹泻的关系，Park等人检测了84份样品，其中猪嵴病毒的阳性率为84．5％(71／84)，仅有3份样品为猪嵴病毒单一感染，其它68份样品均与其他肠道感染病原，包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、A群轮状病毒(GARV)、猪诺瓦克病毒(PNoV)、猪猴禽猪肠病毒(PSaV)、产气荚膜梭菌 扬州大学硕士学位论文16(Clostridiumperfringens)、螺旋体、沙门菌以及大肠杆菌等混合感染‘31。显而易见，猪嵴病毒在导致猪腹泻性疾病中有一定的作用，但是要确定猪嵴病毒是导致腹泻的病原之一，仍需进行深入的研究。1．5猪嵴病毒感染的诊断与监测涉及引起猪腹泻的病原很多，其中病毒与细菌是主要病原。目前，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)对养猪生产的危害最大【3l。34】。特别是近年来，PEDV变异毒株在我国广泛流行，引起3．10日龄仔猪的高发病率和高死亡率，给养猪业造成了巨大经济损失【35】。近年来，猪嵴病毒的感染受到国内外的广泛关注【4，7，29，361，猪嵴病毒与其他病原的混合感染也受到重视。因此，开展猪嵴病毒感染的诊断与监测，深入分析其与其他病原混合感染及在猪腹泻性疾病中的地位和作用具有十分重要的意义。目前，猪嵴病毒尚不能在体外细胞中进行培养，给该病毒的相关研究工作造成一定的困难。在猪嵴病毒感染的检测与诊断方面，主要采用RT-PCR技术直接检测临床样本，血清学技术用于猪群中猪嵴病毒感染状况的调查与分析尚未见文献报道。因此，建立特异、敏感的血清学技术，并用于猪群中猪嵴病毒感染的血清流行病学调查是十分必要的。2研究目的与意义猪群中猪嵴病毒的感染已十分普遍，对养猪业的潜在危害值得关注。本研究拟通过利用原核表达技术表达猪嵴病毒结构蛋白VPl，并利用重组蛋白建立检测猪嵴病毒抗体的间接ELISA方法，以期为猪嵴病毒感染的血清学诊断与监测提供一种可靠的技术手段。3研究内容与技术路线3．1研究内容3．1．1猪嵴病毒VPl的抗原表位信息分析利用分子生物学软件DNAstar和ABCpred对猪嵴病毒XD株的VPl蛋白进行抗原表位信息分析，主要包括抗原性(Antigenicity)、可接近性(Accessibility)、亲水性(Hydrophilicity)、主键柔韧性(Flexibility)和抗原表位的定位(Determinant)，以确定要 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立17表达的目的基因片段。3．1．2猪嵴病毒VPl基因的克隆和原核表达应用RT-PCR方法特异性扩增猪嵴病毒XD株VPl基因，并将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)，在E．coli(DE3)中诱导表达。通过对诱导表达的时间、诱导表达的温度及诱导剂的浓度等条件的优化，获得重组融合蛋白XDVPl。采用过Ni柱方法对表达的重组融合蛋白进行纯化，经Westernblotting方法检测重组蛋白的特异性。3．1．3猪嵴病毒抗体检测ELIsA方法的建立用纯化后的重组蛋白XDVPl作为包被抗原，建立检测猪嵴病毒抗体的间接ELISA方法。通过方阵法确定重组蛋白的最适包被浓度、待检血清及酶标二抗的最佳稀释度、最佳封闭液和血清稀释液以及血清和酶标二抗的最佳反应条件和时间等一系列ELISA反应的工作条件。用猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清进行交叉反应性试验，以验证检测方法的特异性。3．1．4猪嵴病毒抗体检测ELIsA方法的应用利用建立的ELISA方法对临床采集的猪血清样本进行猪嵴病毒抗体的检测，分析其感染状况。 扬州大学硕士学位论文183．2技术路线上蚤 田野：猪嵴病毒vPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立191材料1．1猪嵴病毒阳性样本材料与方法PKV阳性粪便样本(XD株)：由中国农业大学农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室保存；1．2血清PKV感染猪阳性血清：利用重组蛋白VPl经Westernblotting筛选阳性的临床猪血清为PKV阳性血清。性。PKV阴性血清：为SPF猪血清，利用重组VPl蛋白经Westernblotting检测结果为阴猪传染性胃肠炎病毒阳性血清、猪流行性腹泻病毒阳性血清：由中国农业大学农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室保存。1．3载体与菌株表达载体pET-32a(+)：Novagen公司产品；克隆载体pEASY-BluntsimplecloningVector，E．coliDH5a感受态细胞，E．coliBL21(DE3)感受态细胞：均为北京全式金生物技术有限公司产品。1．4主要试剂和溶液1．4．1试剂TransZol：北京全式金生物技术有限公司。 扬州大学硕士学位论文20WATERSTERILENUCLEASE．FREE：Biotech公司。TransStartFastPfuDNA聚合酶：北京全式金生物技术有限公司产品。2xNI．TaqPCRMasterMix：NEWBIOINDUSTRY产品。Trans2KPlusDNAMarker：北京全式金生物技术有限公司产品。ReverseTranscriptaseM—MLV酶：Promega公司产品。RNasin(40U／lxL)：威格拉斯公司产品。dNTPs(2．5mMeach)：威格拉斯公司产品。EB替代染料：北京普利莱基因技术有限公司产品产品。Trans2KPlusDNAMarker：北京全式金生物技术有限公司产品。ReverseTranscriptaseM-MLV和T4DNA连接酶：Promega公司产品(Madison，WI，USA)：PrimeSTAR刑HSDNAPolymerase(含5xPrimeSTARⅢBuffer、dNTPMixture)：宝生物工程(大连)有限公司产品；琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒：Promega公司产品：限制性内切酶BamHI与SalI：NewEnglandBiolabs(NEB)公司产品；高纯质粒小量提取试剂盒(柱离心型)：威格拉斯生物技术(北京)有限公司产品；低分子量蛋白Marker：天根生化科技(北京)有限公司产品；非预染蛋白Marker：Fermentas(MBI)公司产品；预染蛋白Marker：北京全式金生物技术有限公司产品；三羟甲基氨基甲烷(瞄s．碱)和甘氨酸：上海生物工程公司产品；N’N’一二甲基甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺和IPTG：华美生物工程公司产品；辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG(H+L)．JacksonImmunoResearchLaboratories公司产品；六联组氨酸标记蛋白高水平表达纯化试剂盒：QIAGEN公司产品。；ProteinAssayKithBIO．RAD公司产品。1．4．2试验用溶液及其配制1．4．2．1RNA提取用溶液75％乙醇(VⅣ)：用WATERSTERILENUCLEASE．FREE溶液和新开封的无水乙醇按 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立21比例配制成浓度为75％的乙醇，．20"C贮存备用。100％异丙醇：新开封试剂，．20℃保存备用。100％三氯甲烷：新开封试剂，．20℃保存备用。1．4．2．2琼脂糖凝胶电泳用溶液50xTAE(Tris-乙酸)贮存液：24．2gTris-碱，5．71g冰醋酸，10mLO．5mol／LEDTA(pH8．O)，去离子水定容至100mL，室温保存。6xDNA上样缓冲液(100mL)：“每100mL溶液中含溴酚蓝o．25g，蔗糖40g。1．2％琼脂糖凝胶：称取1．2g琼脂糖粉末溶于100mL1xTAE电泳缓冲液中，溶化后加入5肛LEB替代染料。1．4．2．3转化及诱导表达用溶液氨苄青霉素(Amp)贮存液：按100mg／mL比例将Amp粉剂溶于去离子水中，过滤除菌，分装，．20。C保存。200mg／mLIPTG贮存液：称取IPTG29溶于10mL去离子水中配制成200mg／mLIPTG，过滤除菌，分装，．20℃保存，备用。LB液体培养基：称取Tryptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g加入蒸馏水950mL，用10mol／LNaOH调节pH至7．4，然后定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。LB／Amp+液体培养基：于LB液体培养基中，按终浓度100舭加入Amp贮存液。LB／Amp+固体培养基：琼脂粉1．5g溶于100mL液体LB中，121℃高压灭菌20min，冷却至50。C左右，加入Amp至终浓度为100lxg／mL，浇制平板。2xYT液体培养基：称取Tryptone16g，Yeastextract10g，NaCl5g加入蒸馏水950mL，用10mol／LNaOH调节pH至7．4，然后定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。2xYT／Amp+液体培养基：于2xYT液体培养基中，按终浓度1001．tg／mL加入Amp贮存液。1．4．2．4SDS-PAGE电泳用溶液30％丙烯酰胺(w／V)：丙烯酰胺29g，N’-N’甲叉双丙烯酰胺lg，去离子水定容至100mL，pH不能超过7．0，过滤，40C于棕色玻璃瓶贮存。 扬州大学硕士学位论文221．5mol／LTris‘C1(pH8．8)："Iris-碱18．17g溶于80mL去离水中，加入约3mL的浓盐酸调pH8．8，定容至100mL。lmol／LTris。C1(pH6．8)：Tris-碱12．1g，溶于80mL去离水中，加入约7mL的浓盐酸调pH6．8，定容至100mL。10％SDS：SDS10g，100mL去离子水，68。C水浴助溶。10％过硫酸胺：过硫酸胺5g，加去离子水定容至50mL。5xTris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液(pH8．3)：在900mL去离子水中溶解15．1g嘣s碱和94g甘氨酸，然后加入50mL10％(W／V)的电泳级SDS贮存液，定容至1000mL。2xSDS力H样缓冲液：100mmol／LTris+C1(pH6．8)200mmol／L二硫苏糖醇(DTT)或5％13-巯基乙醇(临用前加入)2％SDS0．03％溴酚蓝20％甘油考马斯亮蓝染色液：90mL甲醇：H20(1：1v，v)和lOmL冰乙酸的混和液中溶解0．25g考马斯亮蓝R250，用Whatman滤纸过滤，以除去颗粒状物质。脱色液：按甲醇：冰乙酸：水(3：1：6)的体积配制成脱色液。1．4．2．5蛋白纯化用溶液O．01mol／LPBS(pH7．2-7．4)：NaCl8．0gKCl0．2gNa2HP04‘12H203．628gKH2P040．24g用蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌后室温保存。0．01mol／LPB(pH7．2-7．4)：KCl0．2gNa2HP04·12H203．628gKH2P040．24g 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立23用蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌。0．5mol／LEDTA(pH8．0)：18．61gNa2EDTA·12H20溶于80mL蒸馏水中，NaOH调节pH至8．0，定容至100mL，121℃高压灭菌后室温保存。裂解液(pH8．O)：每配制100mL的溶液，分别取0．01mol／LPBS(pH7．2-7．4)98mL和2mLO．5mol／LEDTA相混合，121℃高压灭菌后室温保存。1．4．2．6Westernblotting用溶液蛋白转印缓冲液(pH8．2)：Tris碱1．93g甘氨酸9g甲醇20％加蒸馏水定容至1000mL。10x丽春红贮存液：丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水扬酸30g加蒸馏水定容至100mL。使用时用蒸馏水作1：10稀释，用后应予废弃。PBS-T(pH7．2)：NaCl8gKH2P04O．24gNa2HP04(无水)1．44gKCl0．2g37℃加热溶解后，定容至1000mL，加入500lxLTween．20，121℃高压灭菌，室温保存。封闭液(血清稀释液)：含10％脱脂奶粉的PBS．T。1．4．2．7酶联免疫吸附试验(ELISA)相关溶液包被液(O．05mol／LpH9．6的碳酸盐缓冲液)： 扬州大学硕士学位论文24Na2C031．59gNaHC032．93g准确称取后，溶于950mL的蒸馏水中，调pH值为9．6，定容到1L；PBS．T洗涤液：1000mL10mmol／LpH7．4的PBS中加入O．5mLTween．20；封闭液和血清稀释液：含有10％L【j羊血清的PBS．T缓冲液，含有10％马血清的PBS．T缓冲液，含有10％dx牛血清的PBS．T缓冲液，含有I％BSA的PBS—T缓冲液，含有5％BSA的PBS．T缓冲液，含有10％BSA的PBS．T缓冲液，含有5％脱脂奶粉的PBS．T缓冲液，含有10％脱脂奶粉的PBS．T缓冲液；大肠杆菌裂解液：将pET-32a(+)空质粒转化至EcoliBL21(DE3)，在LB／Amp+液体培养基中震荡培养过夜，离心收集菌体，用PBS重悬菌体后，进行冰浴超声裂解，后14000r／min离心10min，收集上清。血清稀释液：按照大肠杆菌裂解液与封闭液之比为l：20配制。底物溶液：O．1mol／L的柠檬酸溶液(21g柠檬酸C6H607·H20溶解于去离子水，定容至1L)24．3mL，0．2mol／LNa2HP04·12H20(71．6gNa2HP04·12H20溶解于去离子水，定容至1L)25．7mL混匀，加入50mg的四甲基联苯胺(TMB)，临用前加入50此的30％H202；终止液(2mol／LH2S04)：由蒸馏水177．8mL和浓硫酸22．2mL混和而成200mL终止液。1．5主要仪器设备MIKRO220R台式冷冻高速离心机：德国Hettich公司产品。MIKRO120台式高速离心机：德国Hettich公司产品。Minispin小型离心机：德国Eppendorf公司产品。MLS．3020型高压蒸气自动灭菌器，日本SANYO电气公司产品；DZG．6021型真空干燥箱：上海森信实验仪器有限公司产品。2720型PCR仪：美国AppliedBiosystems公司产品。C1000型PCR仪：美国BID．RAD公司产品。PowerpacTMBasic型电泳仪：美国BID．RAD公司产品。 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立DYY-11B型三恒电泳仪：北京市六一仪器厂产品。MolecularImagerGelDocTMXR凝胶成像分析系统：美国BID-RAD公司产品。AF200型制冰机：意大利FRIMONT公司产品。WH．861型涡旋混合器：北京科尔德科贸有限公司产品。3111型水套式二氧化碳细胞培养箱：美国FormaScientific公司产品。DK．8D型电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司产品。TW8型水浴槽：德国Julabo公司产品。991型一80℃超低温冰柜：美国ThermoScientific公司产品。培英HYG．A型全温摇瓶柜：江苏太仓市实验设备厂产品。SW-CJ．IF型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司产品。SW-CJ．2FD双人单面垂直净化工作台：苏州安泰空气技术有限公司产品。DH6000B型电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司产品。HeliosGamma型紫外分光光度计，英国ThermoSpectronic公司产品；Model550型酶标仪美国BIO．RAD公司产品。1．6猪嵴病毒核苷酸参考序列本研究所用的参考毒株序列下载于GenBank。毒株于2007年在匈牙利发现，名称为swine／S-1-HUN／2007／Hungary，GenBank登录号为EU787450。2试验方法2．1原核表达重组质粒的构建2．1．1PKWPl抗原表位相关信息的分析利用分子生物学软件ABCpred和DNAstar对PKVXD的VPI进行抗原表位相关信息的分析，主要包括抗原性分析(Antigenicity)、可接近性分析(Accessibility)、Hopp．Woods的亲水性分析(Hydrophilicity)、主键柔韧性性(Flexibility)和抗原表位的定位(Determinant)，为下一步表达目的蛋白提供参考。 扬州大学硕士学位论文262．1．2PKWPl基因原核表达质粒的构建2．1．2．1总RNA的提取取250}tLPKV阳性样本上清，加入750此TranslZol剧烈振荡2Inin后室温静置6min：加入250此氯仿，剧烈振荡1min后室温静置4min；4"C14000r／rain离心15min：将上层水相吸出(约550uL)，转入新的1．5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温沉淀20min(或者．20。C沉淀lh)；4"C14000r／min离心15min，边旋转边缓慢弃去上清，用移液管尖端抵着离心管侧壁加入1mL75％乙醇对沉淀进行洗涤；4"C7500r／min离心5min，小心尽量弃尽上清；4"C7500r／min离心1min，用移液器吸去上清；55℃真空干燥箱中干燥15min后立即进行反转录。2．1．2．2引物的设计与合成根据PKVXDVPl的基因序列及相关抗原表位信息的分析结果，利用Prime5．0软件，设计合成两条PCR引物，引物两端的酶切位点为别为BamHI和SalI，上下游引物如表1所示(斜体表示保护性碱基，下划线表示加入的酶切位点)，VPl基因片段预期扩增产物长度为766bp，引物合成工作由北京擎科新业生物技术有限公司完成。表1用于扩增XDVPi基因的引物序列Table1TheprimersforamplificationofXDVPlgenefragment2．1．2．3cDNA模板的制备依据所扩增片段，采用相应的下游引物，参照M．MLV反转录酶使用说明书进行，eDNA合成方法具体为：在真空干燥后样品总RNA中缓慢加入10xRTmix2“L，超纯dNTP2p,L，下游引物2此，QuantReverseTranscriptaselo,L，RNase—freeWaterl3p,L，37"C反 田野：猪嵴病毒vPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立27应60min。反转录反应体系(20pL)如下：10×I汀mix超纯dNTPs下游引物QuantReverseTranscriptaseRnaseflee水PCR反应体系(50pL)如下：2“L2pL2p．L1p．L131．tL三蒸水24此5xTransStartFastPfuBuffer(含M92+)101．tLdNTPMixture(各2．5mM)4此10pmol／lxL上下游引物各1此TransStartFastPfuDNA聚合酶(2．5U／I_tL)l“LcDNA模板10此反应程序如下：98℃30s，1个循环；(预变性)98。C10S(变性)，68。C(复性和延伸)lmin，共40个循环；72℃10min，1个循环；(延伸)经1．2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物。2．1．2．4PCR产物的纯化回收利用Promega公司的琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒纯化回收各段PCR产物，具体操作按产品说明书进行。琼脂糖电泳分离待回收的PCR产物，从凝胶上尽可能小的切下目的DNA片段，放于1．5mL离心管中(注意放入胶块前后对离心管进行称重)；胶块与胶溶液按重量体积比(1mg：luL)加入MemBindSolution，置于55．60℃水浴锅中溶胶，其间每隔1．2分钟上下颠倒摇动一次，直至胶块全部融化；装柱，室温孵育lmin，14000r／min离心60S，去掉废液：加入7001．tLMenWashSolution漂洗，14000r／min离心60s，倒掉废液；再加入500此MenWashSolution漂洗，14000r／min离心5min，倒掉废液；14000r／m离心60s(不 扬少I,I大学硕士学位论文盖离心机内盖)；干燥箱内干燥5min；转移柱子至1．5mL离心管，在柱子中央缓慢加入501iL水，室温放置60s，14000r／min离心60S，回收纯化产品可立即使用或～20℃保存。2．1．2．5PCR回收产物与pEASY—BIunt载体的重组连接连接体系(5灿)如下：PCR回收产物4pLpEASY-Blunt载体1此用移液器轻轻混合，室温静置15min(<1000bp)-15min(>1000bp)。2．1．2．6连接物的转化将．80℃保存的E．coliDH50【感受态细胞取出，冰浴至其刚刚融化，轻弹管壁混匀；在盛有连接产物的1．5mL离心管中加入50此感受态细胞，轻弹混匀，冰浴30min；42。C水浴热激90S后立即冰浴2min；加入孵育至室温的600gLSOC液体培养基，置于37。C，180r／min振荡培养60min；以4000r／min离心4min，弃去部分培养基(余250／aL左右)，重悬细菌沉淀，将菌液涂布于LB／Amp+平板上，37。C培养过夜(12-16h)，观察菌落生长情况，筛选重组转化体。2．1．2．7菌液的PCR鉴定菌液PCR反应体系(201tL)如下：双蒸水10xPCRBufferdNTPs(10mmol／L)上游引物(25pmol／llL)下游引物(25pmol／llL)EasyTaqDNAPolymerse(5U／此)菌液13．25“L2IlL2IlL0．5gL0．5IlLO．25此2IlL 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立29反应程序如下：94。C4min，1个循环；(预变性)94℃30S，56℃30S，72℃90S，共35个循环；72℃10min，1个循环；(延伸)经1．2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物。2．1．2．8插入片段的序列测定选取经PCR鉴定为阳性的克隆，利用位于pEASY-Blunt载体多克隆位点两侧的M13正、反向引物对DNA进行自动化测序，序列测定由北京擎科新兴生物技术有限公司完成，利用DNAMAN软件完成序列拼接。分析后将正确的阳性菌用碱裂解法提取质粒，将质粒命名为pEB．XDVPl。2．1．2．9质粒DNA的小量制备一碱裂解法参照威格拉斯生物技术(北京)有限公司提供的高纯质粒小量提取试剂盒(柱离心型)说明书。具体操作如下：柱平衡：在插入套管的离心柱内加入300ktLBufferPE，10000r／min离心30S，弃废液，再将离心柱插入套管。将PCR鉴定为阳性的菌液接种到3mL新鲜LB／Amp+液体培养基中(1：1000)，37。C，180r／min振摇培养过夜；将过夜培养的菌液转入1．5mLEP管中，12000r／min离心2min收集菌体，弃上清；加入200灿BufferP1，充分混悬震荡菌体沉淀15S，至菌体完全悬浮；加入200此BufferP2，立即轻缓颠倒离心管3～5次，室温放置2～3min，充分裂解菌体，裂解后溶液变清亮(注意：裂解时间不可超过5min)；加入300“LBufferP3，轻缓颠倒离心管4-6次，使其充分混匀，室温放置1～5min后可产生白色絮状物，4。C离心12000r／min离心8min。吸出中和后离心的质粒粗提物上清，将其转移至开始经平衡液处理过的离心柱中，12000r／min离心30S，弃去废液后将离心柱插回套管；加入BufferPWT(洗涤液T)500ktL，12000r／min离心30S，弃去废液后将离心柱插回管套；加入BufferPW(洗涤液)700ktL，12000r／min离心30S，弃去废液后将离心柱插回管套，再12000r／min离心2min甩干；取出离心柱，注意避免沾上套管内的废液，弃去套管；将离心柱放入一个新的1．5mLEP管，加入100此洗脱液于离心柱内硅胶膜的中心位置，注意不要接触硅胶膜；12000r／min 扬州I大学硕士学位论文30离心lmin，即获得纯化的质粒DNA溶液，可直接用于后续实验或．20。C保存备用。2．1．2．10构建原核表达重组质粒将PKV-XDVPI片段插入pEY-32a(+)表达载体构建原核表达重组质粒，如图3所示。图3pET-32a-XDVPl原核表达重组质粒的构建模式图Fig．3SchematicoftheexpressionconstructionofpET-32a-XDVPl2．1．2．11表达载体质粒pET-32a(+)与带目的基因质粒的酶切利用限制性内切酶BamHI和SalI对重组质粒pEB—XDVPl和表达载体质粒pET-32a(+)分别进行双酶切消化。酶切体系(50弘L)如下：lOxBuffer5pLBamHI1．5此SalI1．5此质粒DNA41p,LddH20补至50¨L加入各成分后瞬时离心混匀，37。C反应2．3h，1．2％琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒pEB-XDXPl和表达载体质粒pET-32a(+)产物。2．1．2．12酶切后的目的基因和表达载体DNA的回收琼脂糖凝胶上切取重组质粒pEB-XDVPl酶切产物上766bp的目的基因片段，在表达载体质粒pET-32a(+)产物切取约5800bp的载体片段。回收DNA片段方法参照2．1．2．4。 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立312．1．2．13目的基因与载体DNA的连接与转化连接体系(10pL)如下：10xT4DNA连接酶缓冲液l此表达载体pET-32a(+)DNA6lxL酶切回收后的目的基因DNA片段2此T4DNA连接酶(3U／pL)1“L瞬时离心，16℃连接过夜。连接产物转化至E．coliDH50【感受态细胞，得到重组克隆菌落后继续挑菌培养，选取PCR鉴定为阳性的克隆，碱裂解法小提质粒，经双酶切和PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序正确的重组质粒命名为pET-32a-XDVPl。转化方法和碱裂解法提取质粒方法分别参照2．1．2．5和2．1．2．8进行。2．1．2．14原核表达重组质粒的鉴定2．1．2．14．1PCR鉴定利用VPl的特异性引物XD-VPI(F)和XD—VPI(R)，以重组质粒pET-32a-XDVPl为模板进行PCR，电泳鉴定其扩增片段。2．1．2．14．2双酶切鉴定分别用BamHI和SalI双酶切重组质粒pET-32a．XDVPl，37"C反应3h，1．2％琼脂糖电泳检查插入片段的大小。2．1．2．14．3序列测定利用位于pET-32a(+)载体多克隆位点上游和下游的通用测序引物S．tag和T7ter，对插入VPl基因片段的阳性原核表达重组质粒pET-32a-XDVPl进行序列测定，测序工作由北京擎科新兴生物技术有限公司完成。 扬州大学硕士学位论文2．2重组质粒pET-32a-XDVPl的诱导表达2．2．1诱导表达时间的优化将原核表达重组质粒pET-32a-XDVPl转化至E．coli(DE3)感受态细胞，涂布于LB／Amp+平板后37"C过夜培养，利用Amp抗性筛选重组转化子。在3mLLB／Amp+液体培养基中接种阳性重组菌的单菌落，37。C180r／min振摇培养过夜，次日1：100转接种到2xYT／Amp+液体培养基中，37。C180r／min振摇培养至对数生长期(OD600nm=0．6～1．O)，加入IPTG诱导(终浓度为lmmol／L)，250C150r／min诱导，分别吸取诱导前和诱导后第1-6h菌液(1mL)至EP管内进行SDS．PAGE检测，从而确定诱导表达目的蛋白的最佳时间。2．2．2诱导表达温度的优化在3mLLB／Amp+液体培养基中接种阳性重组菌的单菌落，37*(2180r／min振摇培养过夜，次日1：100转接种到2xYT／Amp+液体培养基中，37"C180r／min振摇培养至对数生长期(OD600m=0．6~1．0)，加入IPTG诱导(终浓度为1mmoFL)，分别在25～28。C、37"C条件下150r／min诱导，在已经确定的最佳诱导时间，吸取各个不同温度诱导的菌液(1mL)至EP管内进行SDS．PAGE检测，从而确定诱导表达目的蛋白的最佳温度。2．2．3诱导剂IPTG浓度的优化在3mLLB／Amp+液体培养基中接种阳性重组菌的单菌落，37"(2180r／min振摇培养过夜，次日1：100转接种到2xYT／Amp+液体培养基中，37℃180r／min振摇培养至对数生长期(OD600nm=O．6～1．O)，在确定的最佳诱导温度，用终浓度分别为O．05mmol／L、0．1mmol／L、O．2mmol／L、0．4mmol／L、0．8mmol／L、1．0mmol／L、2．0mmol／L的IPTG150r／min进行诱导，在确定的最佳诱导时间吸取各个不同IPTG浓度诱导的菌液(1mL)至EP管内进行SDS．PAGE检测，从而确定诱导表达目的蛋白的最佳诱导剂IPTG浓度。 田野：猪嵴病毒vPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立332．3表达产物的检测、鉴定和纯化2．3．1SDS-PAGE电泳检测表达产物安装玻璃板，用0．5％的琼脂封住间隔条与玻璃之间的空隙。按4mL30％丙烯酰胺、3．3mL去离子水、100I．tLlO％过硫酸铵、4I．tLTEMED、100斗LIO％SDS、2．5mLl．5MTris(PH8．8)的配方配置浓度为12％的分离胶，混匀后将分离胶灌注于两玻璃板间隙，留出灌注浓缩胶的空间(约lcm)，在分离胶上覆盖一层75％酒精，将凝胶垂直置于室温下至聚合完成，倒出覆盖层液体。按0．5mL30％丙烯酰胺、2．1mL去离子水、30I．tLl0％过硫酸铵、3ItLTEMED、301xLl0％SDS、3801xLl．5MTris(PH6．8)的配方配置浓度为5％的浓缩胶，混匀后将其灌注于已经聚合的分离胶之上，立即插入梳子，避免混入气泡，待浓缩胶聚合后小心拔出梳子，取下胶条置于电泳槽中，倒入电泳液。将收集的菌液以12000r／min4"C离心5min，用适量PBS悬浮菌体沉淀，取10此样品加入等体积2×SDS上样缓冲液，混匀后煮沸8～10min。取10“L上样，同时设蛋白质标准分子量孔。恒压90V，待蓝色指示界面过浓缩胶后，改恒压120V。用至少5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，在摇床上过夜染色，再将凝胶浸泡于脱色液中脱色2~4h，其间换脱色液数次，直至有清晰条带出现，最后进行扫描与保存。2．3．2原核表达重组蛋白的可溶性检测将诱导表达后3h的细菌悬液12000r／min离心20min，弃培养液保留菌体沉淀，用适量细胞裂解液悬浮菌体沉淀，将悬浮菌体置于冰浴中做超声波破碎，条件如下：超声2S、间歇5S，共超声4min(不包括间歇时间)，波幅为25％。待超声菌液不浑浊时，4"012000r／min离心20min，分别收集上清和沉淀进行SDS．PAGE电泳，从而确定表达产物是存在于上清中(以可溶性形式存在)还是存在沉淀中(以包涵体形式存在)。2．3．3表达产物的纯化参照QIAGEN公司的六联组氨酸标记蛋白高水平表达纯化手册进行，具体操作步骤 扬州I大学硕士学位论文34为：加入溶菌酶终浓度为lmg／ml，冰上放置30min；超声破碎仪冰上放置进行超声；4"C，100009离心20．30min，保留上清；将上清装柱并在柱底部装上流出口盖；移去底部流出口盖，收集柱流出液，并保存流出液进行SDS．PAGE分析；用4ml清洗缓冲液清洗两次，收集清洗片段进行SDS．PAGE分析；检查回收蛋白是否为目的蛋J白。2．3．4蛋白浓度的鉴定及保存ProteinAssayKitI测定蛋白浓度，具体操作步骤如下：在96孔板中加入标准品A-I，每孔lOptL，重复两次；按照50A液：1B液的比例将A、B液混合后，每孔加入200I．tL，37"C避光孵育30min；562nm波长读数；与标准曲线比对，得出蛋白浓度。2．3．5WesternbIotting检测先将待检样品做SDS．PAGE检测。取6张Whatman滤纸和2张硝酸纤维素膜(NC膜)放于转印液中浸泡2h，注意滤纸和NC膜要避免与手接触，以防蛋白质污染。转印电极装置从负极到正极依次放置海绵垫、3层Whatman滤纸、SDS．PAGE凝胶、NC膜、3层Whatman滤纸和海绵垫，注意在放置时每层均用玻棒轻轻滚动除尽气泡；固定好转印电极后，将电极插入电转槽，注满转印缓冲液，冰浴60V恒压转印3h。转印完成后将膜取出并用去离子水漂洗一次；将NC膜浸泡于封闭液(5％脱脂奶粉)中4"C封闭过夜；次日用洗涤液PBST洗3次，每次5min。加入适当稀释的一抗溶液(以封闭液1：20稀释的PKV感染猪阳性血清)中，室温下振荡1～2h；PBST洗膜3次，每次10min；然后加入适当稀释的酶标二抗溶液(以封闭液1：10000稀释的HRP．山羊抗猪IgG)，室温振荡1~2h；同上洗涤。用吸水纸吸取膜上多余的洗涤液，将NC膜与超敏化学发光液(按每10cIn2面积NC膜加入O．5mLBufferA和0．5mLBufferB混匀)孵育5min，放入X光显影机中显影、定影并成相。2．4PKVVPl抗体检测ELISA方法的建立建立行之有效的ELISA方法需要摸索重组蛋白的包被浓度、包被条件，封闭液及封闭 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立j)条件，抗原抗体的工作浓度、反应时间，血清稀释液，底物的反应时间等，一般先通过方阵滴定法确定最适抗原包被浓度和最佳二抗稀释度，然后改变单一需要确定的条件，固定其他反应条件，根据阳性样品OD450砌值与阴性样品OD450砌值之比最大(P／N比值最大)，来逐一确定最佳反应条件。2．4．1确定重组蛋白的包被浓度和二抗稀释度将重组蛋白XDVPl分别稀释为1．6lxg／mL，0．8p．g／mL，0．4I．tg／mL，0．299／mL，0．1I．tg／mL，0．05pg／mL连续6个稀释度，100肛L／孔，每个稀释度重复两孔，4"C包被酶标反应板过夜。将HRP标记的山羊抗猪二抗分别做1：500、1：1000、1：2000和1：4000倍比稀释，每个稀释度重复两孔，100肛L／孔，组成方阵以确定重组蛋白的最适浓度和最佳二抗稀释度。其他步骤与常规ELISA方法相同。最后酶标仪测定各孔OD450啪值。先取阳性OD450m值在1左右的，再从中找出P／N值最大的反应孔，从而确定最适抗原包被浓度和最佳二抗稀释度。2．4．2确定重组蛋白包被条件在酶标板中每孔加入1001．tL最适抗原包被浓度的抗原进行包被，包被条件分为4组，分别为37。C包被2h加40C过夜；37℃包被1h加4。C过夜；4。C包被过夜；37。C包被2h。其他步骤与常规ELISA方法相同。酶标仪测定各孔OD450砌值，找出P／N值最大的反应孔，从而确定最佳的抗原包被条件。2．4．3确定血清稀释度将酶标板以最适抗原浓度和最佳包被条件包被，封闭后将己知的阳性血清和阴性血清分别作1：25、1：50、l：100、1：200、1：400和1：800连续几个稀释度稀释。其他步骤与常规ELISA方法相同。酶标仪测定各孔OD450m值，计算P／N值，从而确定血清的最佳工作浓度。2．4．4确定封闭液及血清稀释液将酶标板以最适抗原浓度和最佳包被条件包被，洗涤后，加入8组不同的封闭液，100 扬州大学硕士学位论文36pL／孔。封闭液分别为10％山羊血清、10％马血清、5％小牛血清、1％BSA、用5％BSA、用10％BSA、5％脱脂奶粉、l％脱脂奶粉。37。C封闭2h，其他步骤与常规ELISA方法相同。酶标仪测定各孔OD450m值，计算出P／N值，从而确定最佳封闭液和血清稀释液。2．4．5确定封闭时间将酶标板以最适抗原浓度和最佳包被条件包被，洗涤后，加入最佳封闭液，100pL／孔，分为4组，分别于37。C封闭3h、2h、1h、0．5h。其他步骤与常规ELISA方法相同。测定各孔的OD450nm值，计算出各组阴阳性血清的P／N值，从而确定最佳封闭时间。2．4．6确定血清样本反应时间按上步各个优化条件，加入PKV阳性血清进行反应，依据作用时间分为4组，分别为37。C作用30min、60min、90min、120min。其他步骤与常规ELISA方法相同。测定各孔的OD450nm值，计算出各组阴阳性血清的P／N值，从而确定待检血清样本反应的最佳时间。2．4．7确定酶标二抗反应时间按上步各个优化条件，加入PKV阳性血清进行反应，然后加入酶标二抗，依据二抗的作用时间分为6组，分别为37。C作用10min、20min、30min、40min、50min、60min。其他步骤与常规ELISA方法相同。测定各孔的OD450m值，计算出各组阴阳性血清的P／N值，从而确定待酶标二抗反应的最佳时间。2．4．8确定底物反应时间按上步各个优化条件，加入阳性血清进行反应，然后加入酶标二抗，作用后加入底物显色，按底物的作用时间分成6组，分别为37。C作用5min、10min、15min、20min、25min、30min。其他步骤与常规ELISA方法相同。测定各孔的OD450枷值，计算出各组阴阳性血清的P／N值，从而确定底物反应的最佳时间。 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立372．4．9确定阴阳性临界值取PKV阴性猪血清20份，以优化的反应条件进行间接ELISA。根据公式：阴阳性临界值=阴性样本OD450姗值平均值+3标准差(SD)，计算阴阳性临界值。2．4．10交叉反应试验及重复性实验用纯化后的重组蛋白XDVPl作为包被抗原，按照已经确立的间接ELISA操作程序，分别用猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒的阳性血清进行间接ELISA，分析其交叉反应情况。取4块不同批次包被的酶标板，检测已知阳性血清4份，每个样品每块板设置2个重复，计算批间变异系数CV=(SD／OD450Ilm平均值)×100％；在同一块酶标板上进行批内重复，检测已知阳性血清4份，每个样品设置4个重复，计算批内变异系数CV=(SD／OD450姗平均值)×100％。若变异系数CV<10％，则说明方法具有较好的重复性和稳定性。2．5猪嵴病毒抗体检测ELIsA方法的应用用建立的PKVVPl抗体检测ELISA方法对临床采集的8个猪场的720份猪血清样本进行检测。 扬少I,I大学硕士学位论文1．猪嵴病毒VPI抗原表位分析结果与分析：口木叼7丁17l运用DNAStarMegAlign中的ClustalW方法对PKVS．1．HUN株和XD株VPl蛋白进行氨基酸序列同源性比较，表明两个毒株推导的氨基酸序列相似性为86％。利用分子生物学软件ABCpred和DNAstar对PKVXD株VPl蛋白进行亲水性(Hydrophilicity)、抗原性(Antigenicity)、易接近性(Accessibility)、主键柔韧性(Flexibility)等进行分析。结果(图4)表明，VPl蛋白的第785aa至1038aa具有较高的抗原性和亲水性。碡HydrophilicityPlot-Alpha，AmphipathicRegions—Beta，AmphipathicRegions圈FlexibleRegions■AntigenicIndex口SurfaceProbabilityPlot图4PKVXDVPl抗原指数和亲水性分析Fig．4AnalysisofantigenicindexandhydrophilicityforPKVXDVP12．表达猪嵴病毒VPI基因重组质粒的构建与鉴定2．1PKVVPl基因片段的扩增提取PKV阳性粪便样品的总RNA，利用设计的特异性下游引物反转录，进行PCR 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立39扩增，1．2％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。结果表明，获得清晰且单一的大小为766bp的扩增条带，与预期的目的基因片段相符。1000bp——750却——黜话——Ml2图5PKVXDVPl基因片段的PCR扩增M．DL2000DNAMarker；1．水对照．；2VPl基因片段的PCR产物Fig．5AnalysisofVPlgenefragmentofPKVamplifiedbyPCRM．DL2000DNAMarker；1．negativecontrol；2．VP1genefragment2．2PKVVPl原核表达重组质粒的鉴定将目的片段克隆至pET-32a(+)表达载体，构建原核表达重组质粒，转化感受态细胞，获得重组菌。菌液经过质粒提取，重组质粒经PCR扩增，所获得产物大小与预期相符(图6)；用BamHI／SalI双酶切重组质粒pET-32a—XDVPl，分别得到5．8kb的pET-32a(+)载体片段和约766bp的目的基因片段(图7)，表明获得正确的阳性原核表达重组质粒。戮印◆一印图6菌液PCR扩增PKVXDVPl基因片段M．DL2000DNAMarker；1—5．菌液PCR扩增结果Fig．6AnalysisofVPlgenefragmentsamplifiedbyPCRM．DL2000DNAMarker；l-5．VP1genefragments 扬州大学硕士学位论文——5S00bp——766bp图7原核表达重组质粒pET-32a—XDVPl的酶切鉴定结果Fig．7RestrictionenzymedigestionoftherecombinantplasmidpET-32a-XDVPl2．3PKVVPl原核表达重组质粒的序列测定利用位于pET-32a(+)载体多克隆位点两侧的S．tag和T7ter通用引物对阳性重组质粒测序，结果表明重组质粒pET-32a．XDVPl中的相应基因序列与目的基因序列一致，没有发生突变和阅读框的改变，插入方向和位置与预期结果一致。3PKVVPl原核表达重组质粒的诱导表达和重组蛋白的鉴定3．1PKVVPl原核表达重组质粒的诱导表达3．1．1诱导表达时间的优化在37。C、IPTG的终浓度为lmmol／L的条件下诱导，分别吸取诱导前和诱导后不同时间的菌液，用12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS．PAGE电泳分析。结果显示(图8)，诱导后1h就有目的蛋白的表达，至3h目的蛋白的表达量达到高峰。二二渺渺够够∞∞如如 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立4143kDa26姬a17kDaMl234567-4--26kDa图8不同时间诱导表达的重组蛋白VPl的SDS—PAGE分析M．分子量蛋白Marker；1．．pET-32a-XDVPl诱导前：2．pET-32a-XDVPl诱导lh；3．pET-32a—XDVPl诱导2h；4．pET-32a-XDVPl诱导3h；5．pET-32a-XDVPl诱导4h；6．pET-32a-XDVPl诱导5h；7．pET-32a—XDVPl诱导6hFig．8SDS—PAGEanalysisoftherecombinantVPlinducedindifferenttimepointsM．10wmolecularweightproteinMarker；1．pET-32a-XDVPlbacteriawithoutinduced；2．pET-32a-XDVPlbacteriainducedfor1h；3．pET-32a-XDVPlbacteriainducedfor2h；4．pET-32a-XDVPlbacteriainducedfor3h；5．pET-32a—XDVPlbacteriainducedfor4h；6．pET-32a—XDVPlbacteriainducedfor5h；7．pET-32a-XDVP1bacteriainducedfor6h3．1．2诱导表达温度的优化在lmmol／LIPTG浓度诱导条件下，取不同温度诱导后3h的菌液，用12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS—PAGE电泳分析。结果(图9)显示，在28。C条件下诱导时蛋白表达量达到最高水平。43kDa26kDa17kDaMl23456卜26kDa图9重组蛋白VPl不同温度的诱导表达的SDS—PAGE分析M．f氐分子量蛋白Marker；1．pET-32a—XDVPl诱导前；2—5．pET-32a．XDVPl分别于25。C．28。C、37℃温度下诱导3hFig．9SDS-PAGEanalysisoftherecombinantVPlinducedunderthedifferenttemperaturesM．10wmolecularweightproteinMarker；1．pET-32a-XDVP1bacteriabeforeinduced；2-8．pET-32a-XDVPlbacteriainducedfor3hunder25。C，26。C，27。C，28*C，37"Crespectively 扬州大学硕士学位论文3。1．3诱导表达剂IPT6浓度的优化在28"C的诱导条件下，分别加入不同终浓度的IPTG进行诱导，取诱导后3h的菌液，用12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS．PAGE电泳分析。结果(图10)显示，IPTG浓度对诱导表达的影响很小，在0．005mmol／L时蛋白量已经达到较高水平。34Ir．Da．．．．．．．．．．—26咖——17irDa——Ml2345678扣筠l唾玩图10重组蛋白VPl在不同浓度IPTG的诱导表达的SDS．PAGE分析M．f氐分子量蛋白Marker；1．pET-32a-XDVPl诱导前：2-8．pET-32a-XDVPl分别于浓度为O．05mmol／L、0．1mmol／L、0．2mmol／、0．4mmol／L、0．8mmol／L、1mmol／L和2mmol／L的IPTG下诱导3hFig．10SDS—PAGEanalysisoftherecombinantproteinVPIinducedwithdifferentconcentrationofIPTGM．10wmolecularweightproteinMarker；I．pET-32a-XDVPlbacteriabeforeinduced；2～8．pET-32a-XDVPlbacteriainducedfor3hwiththeconcentrationof0．05mmol／L，0．1mmol／L，0．2mmol／,0．4mmol／L,0．8mmol／L，1mmol／Land2mmol／LIPTGrespectively3．2重组蛋白的可溶性及纯化于28℃、0．005mmol／LIPTG诱导3h后，收集菌液，离心弃培养液，保留菌体沉淀，悬浮沉淀，将悬浮细菌置于冰浴中做超声波破碎。裂解后将离心所得上清和沉淀进行SDS．PAGE电泳。结果(图11)显示，在超声波裂解后的上清中出现一条目的条带，在超声波裂解后的沉淀中该条带并较细。证实重组蛋白XDVPl在大肠杆菌E．coli(DE3)中主要以可溶形式表达。纯化的目的蛋白经SDS．PAGE分析，可见一条分子量约为26kDa的蛋白染色带条(图12)。经测定，提纯的目的蛋白浓度为1．514mg／nm。 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立43kDa．----．．．．．——26kDa1·_。______——17kDa——氛耋重23卜26kDa图11重组蛋白XDVPl的可溶性的SDS．PAGE分析M．白Marker；1．pET．32a-xDVPl诱导3h；2．pET-32a—XDVPlJ．船3h后裂解上清；3．pET．32a-XDVPl诱导3h后裂解沉淀：Fig·11SDS-PAGEanalysisofthesolubilityoftherecombinantproteinXDVPlM．proteinMarker；1．pET-32a‘XDVPlbacteriainducedfor3h；2．thesupematantsofpET-32a-XDVPlbacteriainducedfor3hafterultrasoniclysis；3．ThesedimentationofpET-32a-XDVPlbacteriainducedfor3hpostultrasoniclysis五2潭警罨擎≯誊鬻鬟冀豢；穆㈣穆ji_i一鬻鹱夔隳繁i43l【Da——獭峨一蠢。“一濑嗍麟一ii’螺26妣一嘲蔫—鼍卜26kDa17kDa——灞汹黼舔图12纯化的重组蛋白VPl的SDS—PAGE分析M．蛋I刍Marker；1．纯化的VPl；2．未纯化的VPlFig·12SDS-PAGEanalysisofthepurifiedrecombinantproteinVPlM．proteinMarker；1．thepurifiedrecombinantproteinVP1；2．pET-32a-XDVP1bacteriainducedfor3h 扬州大学硕士学位论文3．3重组蛋白的WesternbIotting分析用PIⅣ阳性猪血清对纯化I拘VPl重组蛋白进行Westemblotting检测。结果(图13)显示纯化的蛋白在26kDa处出现清晰且单一的特异性反应条带。表明表达的PKVVPl重组蛋白可被PKVFH性血清所识别。M1骥嘲黪i。j滋蛾瀚自i簟黼：43l【Da——蒿赫藤瓣26kDa一灞鞫隧誊|=羔⋯≯j毫．17Hh一鞲图13重组蛋白VPl的Westernblotting分析M．蛋白Marker；1．纯化蛋白与PKV阳性血清反应Fig．13WesternblottinganalysisoftherecombinantproteinVPlM．proteinMarker；1．thepurifiedVP1reactedwithpositiveseraagainstPKV4PKVVPl抗体检测ELISA方法的建立4．1重组蛋白包被浓度和二抗稀释度的确定将重组蛋白XDVPl分别稀释为1．6p．g／mL，0．8J．tg／mL，0．4¨g／mL，0．2p,g／mL，O．199／mL，O．05p．g／mL连续6个稀释度，100““孔，每个稀释度重复两孔，4℃包被酶标反应板过夜。将HRP标记的山羊抗猪二抗分别做1：500、1：1000、1：2000和1：4000倍比稀释，每个稀释度重复两孔，100gL／孑L，组成方阵以确定重组蛋白的最适浓度和最佳二抗稀释度。其他步骤与常规ELISA方法相同。最后酶标仪测定各孔OD450啪值。先取阳性OD450衄值在1左右的，再从中找出P／N值最大的反应孔，从而确定最适抗原包被浓度和最佳二抗稀释度。 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立45表2重组蛋白VPl最佳抗原包被浓度和酶标二抗稀释度的确定Table2DeterminationoftheoptimalcoatingconcentrationofVPlandHRP·labeledgoat-anti—porcineIgG1：20001：40003．6480．31711．52．60．2619．91．3310．19671．1490．12711．173．0480．30410．022．2420．2279．870．9481．1416．71．1100．1129．92．6520．2839．371．8360．2029．080．6320．Hl5．71．0970．10510．442．2220．2628．481．5240．1639．330．6250．0867．30．8320．1077．781．9820．2418．221．1340．1418．040．2640．0932．80．2630。1082．431．5430。2216．981．0020．1128．940．2130．0962．22O．2130．1101．93注：P表示阳性血清OD450。值；N表示阴性血清OD450。值；P／N表示阳性OD450nm值／阴性OD450。值(下同)由方阵结果所示，随着重组蛋白VPl浓度的递减和酶标二抗的稀释度的递增，阳性样品的OD450啪值不断减小，当重组蛋白包被浓度为0．4pg／mL，酶标二抗作1：4000稀释时，阳性血清的OD450nm值在1．0左右，重组蛋白包被浓度低，且二抗稀释度大。因此，确定VPl蛋白的包被浓度为0．4p,g／mL，酶标二抗最佳稀释度为1：4000。4．2重组蛋白包被条件的确定在酶标板中每孔加入1001．tL最适抗原包被浓度的抗原进行包被，包被条件分为4组，分别为37。C包被2h加4"C过夜；37"C包被1h加4"C过夜；4"C包被过夜；37*(2包被2h。其他步骤与常规ELISA方法相同。酶标仪测定各孔OD450m值，找出P／N值最大的反应孔，从而确定最佳的抗原包被条件。pN附PN附PN附PN蹦 扬州大学硕士学位论文表3重组蛋白VPl最佳包被条件的确立Table3DeterminationoftheoptimMcoatingconditionoftherecombinantproteinVPl阳性OD450。阴性OD450。P烈0．8060．1008．061．020．102lO1．070．10510．191．430．10613．5由表3结果表明，四种包被条件对阴性血清的OD450唧影响不大，但阳性血清的OD450帅随着包被的条件的不同有所改变，以4℃包被酶标板过夜的阳性OD450mn值最大，P／N值也最大。因此，确定最佳重组蛋白包被条件为：4。C包被酶标板过夜。4．3血清稀释度的确定将酶标板以最适抗原浓度和最佳包被条件包被，封闭后将已知的阳性血清和阴性血清分别作1：25、1：50、l：100、1：200、1：400和1：800连续几个稀释度稀释。其他步骤与常规ELISA方法相同。酶标仪测定各孔OD450m值，计算P／N值，从而确定血清的最佳工作浓度。表4最佳血清稀释度的确立Table4Determinationoftheoptimaldilutionofserumsample阳性0D450。阴性OD450nInP／N由表4结果表明，随着血清稀释倍数的不断增大，阴阳性血清OD450岫随之减小。当血清稀释度为l：50时，阳性血清的P／N值最大且OD450nm值接近1．0，因此确定最佳血清瑚mⅣC；m●然抛Ⅲm朋m2研m勰c；仉3配加钉¨毗蛾¨甜鼹"¨m 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立47稀释倍数为1：50。4．4封闭液及血清稀释液的确定将酶标板以最适抗原浓度和最佳包被条件包被，洗涤后，加入8组不同的封闭液，100“L／孔。封闭液分别为10％山羊血清、10％马血清、5％小牛血清、1％BSA、用5％BSA、用10％BSA、5％脱脂奶粉、1％脱脂奶粉。37"C封闭2h，其他步骤与常规ELISA方法相同。酶标仪测定各孔OD450啪值，计算出P／N值，从而确定最佳封闭液和血清稀释液。表5封闭液和血清稀释液的确定Table5Determinationoftheoptimalblockingsolutionandserumdilutionsolution阳性血清OD450。阴性血清OD450mnOD450mnvalueofpositiveOD450nmvalueofserumnegativeserumP_／NP／Nratio10％山羊血清10％马血清5％小牛血清1％BSA5％BSA10％BSA5％脱脂奶粉10％脱脂奶粉0．1790．1700．1650．1680．169O．1130．116由表5结果表明，用10％马血清封闭时，其阳性血清的OD450IⅡn值最高，但阴性血清的OD450啪值也最高，而用10％脱脂奶粉封闭，阳性值较高，阴性值最低，P／N值最大。因此，确定用10％脱脂奶粉PBS．T作为封闭液和血清稀释液。4．5封闭时间的确定将酶标板以最适抗原浓度和最佳包被条件包被，洗涤后，加入最佳封闭液，100山孔，分为4组，分别于37"C封闭3h、2h、1h、O．5h。其他步骤与常规ELISA方法相同。测定各孔的OD450nm值，计算出各组阴阳性血清的P／N值，从而确定最佳封闭时间。弘Ⅲ镑弘瞄％∞尚≯舭■一“&m加52386”％药扒¨m¨筋 扬州大学硕士学位论文表6最佳封闭时间的确定Table6Determinationoftheoptimalblockingtime阳性OD450nn。阴性OD450nnlP／N1．2150．10711．361．198O．10511．411．1950．10011．951．2300．09812．55由表6结果表明，用10％脱脂奶粉封闭2h的效果最好，阳性血清的OD450砌值最高，阴性血清的OD450姗值最低，P／N值最大，因此确定封闭时间为2h。4．6血清样本反应时间的确定按各个优化条件，加入PKV阳性血清进行反应，依据作用时间分为4组，分别为37℃作用30min、60min、90min、120min。其他步骤与常规ELISA方法相同。测定各孔的OD450m值，计算出各组阴阳性血清的P／N值，从而确定待检血清样本反应的最佳时间。表7血清样本反应时间的确定Table7Determinationoftheoptimalreactiontimeforserumsample阳性OD450。阴性OD450nmP／N1．0960．08512．891．2310．10112．191．2670．11211．311．381O．12011．5l由表7结果表明，随着血清反应时间的延长，阴阳性血清的OD450啪值也在增大，而P／N值却随着血清反应时间的延长而减小。当待检血清在37。C反应30min，P／N值最大，阳性血清OD450姗接近1．0，因此确定血清样本反应的时间为37"C反应30min。 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立494．7酶标二抗反应时间的确定按各个优化条件，加入PKV阳性血清进行反应，然后加入酶标二抗，依据二抗的作用时间分为6组，分别为37"C作用10min、20min、30min、40min、50min、60min。其他步骤与常规ELISA方法相同。测定各孔的OD450砌值，计算出各组阴阳性血清的P／N值，从而确定待酶标二抗反应的最佳时间。表8酶标二抗反应时间的确定Table8DeterminationoftheoptimalreactiontimeforHRP-labeledgoat-anti·porcineIgG阳性OD450IIm1．1071．1261．2841．1871．1751．182阴性OD450。0．0600．0640．0840．0870．0760．092P／N18．4517．5915．2913．6415．4612．85由表8结果所示，酶标记二抗在37℃反应10min时的P／N值最大，但为了使反应充分，仍确定酶标二抗反应的时间为37。C反应30min。4．8底物反应时间的确定按上步各个优化条件，加入阳性血清进行反应，然后加入酶标二抗，作用后加入底物显色，按底物的作用时间分成6组，分别为37℃作用5min、10min、15min、20min、25min、30min。其他步骤与常规ELISA方法相同。测定各孔的OD450Ilm值，计算出各组阴阳性血清的P／N值，从而确定底物反应的最佳时间。 扬少H大学硕士学位论文表9底物反应时间的确立Table9Determinationoftheoptimalreactiontimeforsubstratedevelopment阳性ODa50。0．767O．7820．8921．1211,2521．364阴性OD450砌0．0960．1040．112O．1210．1370．146P／N7．997．527．969．269．149．34从表9结果可以看出，当底物显色时间越长，阳性血清OD450rnll值越高，且阴性血清OD450m也同时也有微小的升高。虽然30min时P／N值最大(9．34)，但与20min差异不显著，因此将底物的反应时间确定为37"C作用20min。4．9阴阳性临界值的确定取PKV阴性猪血清20份，以优化的反应条件进行间接ELISA。根据公式：阴阳性临界值=阴性样本OD450唧值平均值+3标准差(SD)，计算阴阳性临界值。 田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立51表10阴阳性临界值的确定T曲le10Determinationofthecut．0ljFvalueforELISA经计算20份血清样本的OD450姗值平均值=O．207，标准差=0．3225。根据统计学原则，当样本的OD450m值大于阴性样本OD450姗值平均值+3标准差(SD)时，可以在99．9％水平上判定为阳性。因此，计算得出ELISA方法的阴阳性临界值=0．3225。为了便于结果判定，确定待检血清样本OD450nm>0．35，判定为阳性；而当待检血清样本OD450nm