草莓镶脉病毒致病相关基因功能分析

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1、ADissertationfortheDegreeofMasterFunctionanalysisofpathogenicity-relatedgeneofStrawberryveinbandingvirusByDengZhugenSupervisedbyAssociateProf.JiangTongAnhuiAgriculturalUniversityHefei230036，P.R.ChinaJune,2013中文摘要病毒侵染寄主后，往往会引起寄主出现相应的症状表型，这种表型的出现往往与病毒编码的致病蛋白有关。研究证明草莓镶脉病毒（Strawberryveinba

2、ndingvirus,SVBV）编码的P6蛋白是一个弱RNA沉默抑制子，在此基础上，进一步开展了SVBV编码的P6蛋白以及其他蛋白的致病性研究。本课题不仅鉴定了SVBV单个编码蛋白的致病性，还研究了SVBV编码蛋白间的互作情况。另外，初步探究了P6蛋白是否影响植物体抗病相关基因06G的表达，为在分子水平上阐明SVBV的致病机理奠定了基础。1.SVBV致病相关基因的克隆及载体构建以SVBV美国分离物全长克隆（pSVBV-E3）为模板，用特异性引物对分别扩增P1、P2、P4、P6基因和P6移码突变基因，插入病毒载体pGR106，获得侵染性克隆重组载体pGR-P1-US、

3、pGR-P2-US、pGR-P4-US、pGR-P6-US和pGR-△P6-US。另将P6基因构建到双元表达载体pCAM2300上，得到重组表达载体pCAM-P6-US。各重组载体分别转化农杆菌GV3101。2.瞬时浸润验证SVBV致病相关蛋白含pGR-P1-US、pGR-P2-US、pGR-P4-US、pGR-P6-US、pGR-△P6-US和空载体pGR106的农杆菌分别浸润本氏烟叶片。症状观察发现，pGR-P1-US浸润的系统叶片引起的轻花叶症状与空载体pGR106症状相似；pGR-P2-US浸润15d后，系统叶表现出轻花叶症状，但浸润20d后也表现出重度花叶

4、症状；pGR-P4-US浸润的系统叶片同样产生重度花叶症状，与浸润pGR-P6-US相似。pGR-P6-US浸润的系统叶片表现重度花叶症状，pGR-△P6-US和pGR106浸润的系统叶片只表现出轻花叶症状，ELISA检测表明，pGR-P6-US浸润的系统叶片中能够检测到P6蛋白的表达。研究表明，SVBV编码的P2、P4和P6蛋白可能均与症状表型密切相关。3.SVBV编码蛋白的互作对症状表型的影响含重组质粒pGR-P1-US、pGR-P2-US、pGR-P4-US的农杆菌分别和含重组质粒pGR-P6-US的农杆菌共浸润本氏烟叶片。症状观察发现，pGR-P1-US和p

5、GR-P6-US共浸润的系统叶片出现了与单独浸润pGR-P6-US相似的重度花叶症状；pGR-P2-US和pGR-P6-US共浸润的系统叶片出现了与单独浸润pGR-P6-US相似的重度花叶症状并延迟了显症时间；pGR-P4-US和pGR-P6-US共浸润的系统叶片出现了重度花叶症状，顶部叶片皱缩、下卷，甚至出现坏死和整个植株生长停滞。共浸润研究表明，P1蛋白不能促进P6蛋白的过表达，进一步说明P1蛋白与症状表型无关；P2蛋白与P6蛋白在寄主体内的互作延迟了显症时间，说明P2蛋I白可能对P6蛋白有一定的负调控作用；P4蛋白和P6蛋白的互作显著加重了症状，表现出极强的致

6、病性，说明P4蛋白和P6蛋白之间可能具有一定的协生作用。4.SVBVP6基因在本氏烟中稳定表达的症状表型将构建的重组质粒pCAM-P6-US转化农杆菌EHA105，叶盘法转化本氏烟。抗性筛选及提取转基因烟草总DNA，特异性引物PCR扩增后发现，目的基因已成功整合进本氏烟基因组中。症状观察发现，P6转基因本氏烟没有表现出特殊的症状表型。5.P6与植物抗病性相关基因06G的互作构建重组质粒pCAM-P6-US、pCAM-2b和pCAM-HC-Pro，转化农杆菌分别浸润本氏烟，6d后采集浸润叶片提取总RNA，Real-TimePCR检测植物抗性相关基因06G的RNA积累水

7、平。结果发现，含有pCAM-P6-US的农杆菌浸润本氏烟可以诱导寄主06G基因RNA的高水平积累。关键词：草莓镶脉病毒；致病相关蛋白；瞬时浸润；稳定表达；症状表型；植物抗病基因06GIIAbstractCorrespondingsymptomphenotypesusuallyappearsafterhostsbeinginfectedwithviruses,andthephenotypeprobablyhassomerelationshipwithpathogenicproteinsencodedbyvirus.ItwasdemonstratedthatP6pr