小鼠脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化研究

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1、小鼠脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化研究Studiesoninsulin-producingcellsinducedfrommouseadiposetissue-derivedmesenchymalstemcells作者姓名：赵天闯专业名称：动物学指导教师：李子义教授学位类别：理学硕士论文答辩日期：2015年6月5日授予学位日期：2015年6月5日本研究得到国家重点基础研究发展计划（973计划）（2009CB941001，2011CBA01003）和教育部创新团队发展计划项目（IRT1248）的资助ThisworkwassupportedbygrantsfromtheNati

2、onalBasicResearchProgram（973Program，No.2009CB941001and2011CBA01003）andProgramforChangjiangScholarsandInnovativeResearchTeaminUniversity(IRT1248)前言糖尿病是一种常见的严重代谢性疾病。I型糖尿病是由于分泌胰岛素的胰β细胞自身免疫性破坏，胰岛素分泌量严重缺乏而引起的；II型糖尿病是由于胰[1]β细胞对糖的敏感性降低，导致胰岛素分泌量缺乏而引起的。因此，在过去30[2]年中，胰岛细胞移植被认为是很有潜力的糖尿病治疗方法。然而，这种治疗方法由于胰腺供体

3、缺乏、胰岛免疫排斥等因素而受到极大限制。近年来研究发现，可以通过诱导或基因工程的方法使非胰β细胞系具有胰岛素分泌功能，从而代替[3]胰β细胞用于糖尿病的细胞治疗。干细胞具有维持自我更新的能力，并可在特定条件下分化为多种组织器官，因此干细胞疗法被广泛应用于糖尿病治疗中。研究表明，多种干细胞都可以分化[4]为胰岛素分泌细胞，如：胚胎干细胞（EmbryonicStemCells,ESCs）、诱导多[5][6]能干细胞（InducedPluripotentStemCells,iPSCs）、成体干细胞等。ESCs虽然具有分化潜能，但却受免疫排斥、致瘤性及伦理问题的制约；iPSCs虽然可以通过特定

4、因子诱导分化为胰岛素分泌细胞，但致瘤性仍然存在；成体干细胞则有效避免了以上问题，并可从多种成体组织中取材，如：皮肤、唾液腺、肝、脾、骨髓、脂肪组织等。其中，脂肪间充质干细胞（AdiposeTissue-derivedMesenchymalStemCells,ADSCs）取材广泛且不存在伦理问题，可在体内、外分化为内胚层和[7,8]中胚层结构，因此ADSCs是干细胞临床应用的极好细胞来源。转录因子与启动子或增强子的特殊区域结合，激活特异性基因表达，从而对细胞分化、增殖、凋亡等生物过程起调控作用。Pdx1可以调控多种胰β细胞基因，[9]在胰腺发育、胰β细胞分化及正常功能维持方面发挥关键作用

5、。NeuroD蛋白是B类碱性螺旋环螺旋（bHLH）基因家族的转录因子之一，是非洲爪蟾的神经源性因子，负责胰岛素基因的转录激活，对胰岛素分泌细胞、胰高血糖素分泌细胞[10]等胰岛细胞的终末分化起重要作用。MafA在小鼠胚龄13.5天左右开始表达，并在胰β细胞成熟过程中持续表达，直到小鼠成年，对胰β细胞的成熟、功能维[11]持和存活起重要作用。本实验选取了胰β细胞分化、成熟及功能维持的重要调控基因Pdx1、MafA、INeuroD1，分别构建了三种基因的慢病毒过表达载体，并将其以不同组合方式转入小鼠脂肪间充质干细胞（mouseadiposetissue-derivedmesenchymal

6、stemcells,mADSCs）进行定向分化诱导。实验结果表明：三种因子联合诱导分化，所得到的胰岛素分泌细胞（InsulinProducingCells,IPCs）效率最高，并可在体外高糖刺激条件下，有效发挥糖分解作用。本实验旨在寻找一种安全高效的胰岛素分泌细胞，以替代受损的胰β细胞，为糖尿病临床治疗提供新的细胞材料和治疗手段。II中文摘要小鼠脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化研究胰β细胞移植是目前治疗糖尿病的最有效方法，然而这种疗法需要大量的供体细胞，因此在取材上存在一定难度。另一种有效的治疗方法是利用与胰β细胞同源的胰腺干细胞，将其增殖分化为胰β细胞。间充质干细胞同样具有

7、分化为多[12,13][14]种细胞类型的分化潜能，且对宿主细胞具有免疫逃避特性，因此本实验选择了小鼠脂肪间充质干细胞做为诱导分化的细胞材料。本实验分别构建了Pdx1（胰十二指肠同源盒基因1）、MafA（V-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A）、NeuroD1（神经分化因子1）三种基因的慢病毒过表达载体，并分别将其转染入293T细胞，进行慢病毒包装。之后将所得慢病毒颗粒进行浓缩，并分别以单因子侵染、双因子侵染、三因子联合侵染的方式对mADSC