水通道蛋白1、3在糖尿病心肌病大鼠心肌组织的表达及意义

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1、水通道蛋白1、3在糖尿病心肌病大鼠心肌组织的表达及意义作者：王海英高宇高长斌王清【摘要】目的探讨水通道蛋白1、3(AQP1、3)在糖尿病心肌病状态下的表达及生理作用。方法取糖尿病心肌病模型大鼠心肌组织及正常大鼠心肌组织，应用免疫组织化学方法检测AQP1、AQP3在心肌组织中的表达及分布。结果AQP1、AQP3广泛分布于正常及糖尿病心肌组织中，糖尿病心肌较正常心肌的免疫组化阳性指数有所降低(P<0.05)。结论AQP1、3在糖尿病心肌病心肌组织中的表达较正常组织降低，可能在糖尿病心肌病的发生和发展中发挥重要的生理作用。【关键词】水通道蛋白;糖尿病心肌病;心肌水通道蛋白

2、(AQPs)是与转运水有关的一系列具有同源性的内在膜蛋白家族，广泛存在于动植物和微生物中，在机体不同组织和部位执行着不同的生物学功能。AQP家族成员在泌尿、呼吸、神经、消化等系统的组织定位和生理功能研究已取得了一定进展〔1，2〕，但AQPs在心肌组织的研究甚少，尤其在糖尿病心肌病状态下的表达和生理功能缺乏系统研究。本研究在建立糖尿病心肌病大鼠模型基础上，通过检测AQP1、3在心肌组织的表达，进一步了解AQP1、3与糖尿病心肌病的关系。7　　1材料与方法　　1.1动物与主要试剂雌性4周龄Wistar大鼠60只，体重(200±10)g，购自吉林大学实验动物中心。链脲佐菌素(S

3、TZ)购自美国Sigma公司;心肌酶试剂盒、即用型SABC试剂盒购自北京中山生物科技股份有限公司;AQP1、3兔抗大鼠多克隆抗体购自美国SantaCruz公司。　　1.2方法　　1.2.1大鼠糖尿病心肌病模型复制60只大鼠随机分为糖尿病大鼠(DMR，35只)和正常大鼠(CTR，25只)。参照文献方法〔3〕，DMR给予高糖高脂饲料(10%猪油、20%蔗糖、70%常规饲料)喂养,4w末给予STZ25mg/kg(用枸橼酸钠缓冲液溶解，pH4.5)腹腔注射，每周重复1次，再连续4w，CTR仅给予枸橼酸钠缓冲液(pH4.5)腹腔注射，末次血糖≥16.7mmol/L为糖尿病模型动物。

4、DMR继续高糖高脂饲料再喂养6w。　　1.2.2生化指标测定血糖使用强生血糖仪经尾静脉采血测定。心肌酶〔天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)〕由全自动生化分析仪测定，按试剂盒说明书进行操作。7　　1.2.3心肌组织病理学检查按照常规病理学方法进行固定、包埋、切片，将切片作HE染色。　　1.2.4心脏组织免疫组织化学染色标本以4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片。石蜡切片用梯度酒精脱蜡至水后，0.01mmol/LPBS洗2次，滴加3%过氧化氢，室温孵育10min，PBS洗3次，切片置修复液中微波炉加热10s，PBS洗2次。滴加封闭液，置于湿盒

5、中封闭60min，分别加入1∶100稀释的AQP1、3多克隆抗体(Ⅰ抗)，4℃过夜。用PBS洗3次后滴加SABC试剂免疫组化染色，DAB显色，苏木素轻度复染，封片。阴性对照组用未被免疫的兔血清1∶200稀释，替代Ⅰ抗，余步骤同上。所有切片在光学显微镜下观察，取染色良好(阳性细胞染色清晰、背景染色很低)的组织切片进行照相，并在低倍镜下找到阳性细胞较为密集的区域，图像分析系统测量AQP1、3阳性产物面积及阳性产物强度灰度值，然后将上述数值依据赵景民等〔4〕的方法转化成免疫组化阳性指数，即:免疫组化阳性指数=阳性面积/测量组织面积×阳性强度灰度值，取其平均值(x±s)作为阳性细

6、胞表达率。　　1.2.5判定标准AQP1、3阳性细胞以细胞核和细胞质染成棕黄色为阳性结果。　　1.3统计学处理使用SPSS10.0软件，计量资料以x±7s表示，采用t检验，进行组间比较。　　2结果　　2.1心肌酶的变化第14周末检测血清CK、LDH、AST的水平，DMR组血清CK、LDH、AST的水平均显著高于CTR组(P<0.01)。见表1。表1两组大鼠血清心肌酶的变化(　　2.2心肌组织的病理组织学变化CTR组心肌纤维、心肌细胞排列整齐，细胞核大小均一，胞浆染色均匀。DMR组心肌细胞排列紊乱，细胞核大小不规则，纤维断裂，部分胞浆浓缩深染。见图1。　　2.3AQP

7、1、3在心肌分布的变化AQP1在CTR组的心肌组织主要分布于血管内皮细胞、心肌细胞的胞膜上，以血管内皮细胞最为明显;在DMRAQP1的特异性染色明显减少。AQP3在正常大鼠心肌中分布于心肌细胞的胞膜上，在糖尿病心肌中较正常心肌的特异性染色明显减少。见图2。　　2.4免疫组化阳性指数比较DMR组心肌组织血管及上皮细胞AQP1表达的阳性指数较正常心肌组织明显减少，两组比较有显著性差异(P<0.05);DMR组心肌组织血管及上皮细胞AQP3表达的阳性指数较正常心肌组织有所减少，两组比较有统计学差异(P<0.05)。见表2