微生物的生长繁殖与生长因子

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第五章微生物的生长繁殖与生存因子 一、微生物生长繁殖的概念细菌两次细胞分裂之间的时间称为世代时间。在一定培养条件下，世代时间是一定的。如果营养成分不同，世代时间不同。不同种的微生物，世代时间不同。原核微生物的繁殖速度比真核快，专性厌氧菌的世代时间多数比好氧菌的长。生长生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加繁殖指生物个体数目的增加第一节微生物的生长繁殖 一、研究微生物生长的方法微生物生长分个体生长和群体生长。培养方法有分批培养和连续培养。（一）分批培养分批培养是在一个封闭的、有一定体积的液体培养基的容器中接种少量细菌在特定条件下进行培养。在分批培养中微生物只完成一次生长循环。细菌的生长曲线：将少量细菌接种到一定体积的新鲜液体培养基中进行分批培养，定时取样，以细菌数目的对数为纵坐标，培养时间为横坐标，可绘制出细菌的生长曲线。 停滞期生长曲线可分：对数期静止期衰亡期 1、停滞期（迟滞期或适应期）（lagphase）:将细菌接种到某一培养基后，细菌并不立即繁殖而是经过一段适应期才能生长繁殖。调整适应表现在合成多种酶、完善体内的酶系统及其他细胞成分。特点：（1）细胞质均匀（2）代谢活力强（3）蛋白质和RNA含量增加（4）体积显著增加，许多杆菌可长成长丝状（5）形成诱导酶的能力强（6）对环境变化敏感 影响因素：（1）接种量。接种量大，停滞期可缩短（2）菌龄。菌种年轻，对数生长期接种，停滞期可能很短甚至不明显（3）营养。如果种子培养基与新接种的培养基成分相同，则对菌生长有利。从丰富培养基转入贫营养基，停滞时间拉长，反之减少；（4）菌种特性。大肠杆菌停滞期长，分枝杆菌长 2、对数期（指数期）logphase细菌生长速度达到最大，数量以几何级数增加。特点：（1）细菌迅速分裂，菌数按几何级数增加；（2）世代时间最短，而且恒定；（3）生长速度最高而且恒定；（4）代谢活力强无死亡；（5）菌体整齐，体积恢复到原来大小；（6）对环境敏感，生理性状及菌体成分较一致 世代时间的计算：x2=x1·2n以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2生长速率常数平均世代时间 影响因素：（1）温度。在适温范围内，每增加10℃，生长速度提高1倍； （2）营养；（3）氧气。好氧菌若能供给充足的氧，可能使对数期延长。 3、静止期stationaryphase由于营养消耗，供应不足及代谢产物的积累，这时一部分菌死亡，细菌进入静止期。静止期到来的原因主要是：①营养物尤其是生长限制因子的耗尽；②营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等；③酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；④pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。 特点：（1）菌数达到最高峰；（2）活菌数达到动态平衡；（3）生长速率为零；（4）开始积累贮存物质影响因素：（1）前期主要是营养，补充营养可延长静止期；（2）后期主要是代谢产物的积累；（3）离子、pH等物化条件失去平衡 4、衰亡期declinephase由于营养缺乏和代谢产物积累造成自身中毒，细胞生长受阻，时间和菌数对数呈反比，生长曲线直线下降。特点：（1）生长速率为负值，活菌数减少；（2）细菌发生自溶现象autolysis（3）代谢产物大量积累；（4）形态多变，出现畸形或衰退形。 （一）连续培养原理：如果在培养器中不断补充新鲜营养物质并及时不断地以同样速度排出培养物，理论上讲，对数生长期可以无限延长。1、恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的培养方法。根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞。 恒浊连续培养可以不断提供具有一定生理状态的细胞，可以得到以最高生长速率进行生长的培养物，在微生物工业上运用此法可得到大量菌体及相应的代谢产物如乳酸、乙醇。 2、恒化连续培养维持进水中的营养成分恒定，从而保持细菌的恒定生长速率称恒化连续培养，也称恒组成连续培养。恒化连续培养基中，某种必须的营养物质必须在低浓度作为限制性因子，其他成分过量。这样，细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度。常用的限制性营养物质有作为N源的氨、氨基酸；作为C源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；生长因子、无机盐等。 稀释度（率）：新鲜培养基流入的速度为f，培养器中培养液体积为V，稀释度为D=f/V，表示单位时间内，新加入的培养基体积与培养器内培养基总体积之比。随着D增大，细菌浓度先升后降，但在相当大范围内这种变化不明显。当稀释度增大到最大比生长速率时，微生物的增长速率赶不上流出速率，结果必然是到某一时刻，微生物浓度降到维持生长所必需的最低浓度（临界浓度）之下，这时培养器内微生物浓度趋于零。这时的D为临界稀释度。 三、细菌生长曲线在废水处理中的应用在废水生物处理时，可利用不同生长阶段的微生物处理废水：常规活性污泥法：减速期，静止期生物吸附法：生长下降阶段（静止期）高负荷活性污泥法：对数期、减速期延时曝气法：衰亡期 四、微生物生长量的测定方法可根据菌体细胞量、菌体体积、重量直接测定，也可以根据某种细胞物质的含量或某个代谢活动速度间接测定。微生物生长测量方法个体计数法重量法生理指标法 1、测微生物总数（1）计数器直接计数缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 （2）染色涂片计数将已知体积的待测材料均匀涂布在载玻片的已知面积内，染色后显微镜下计数。一般1cm2均匀涂片0.01ml样品。选择几个至十几个视野计数细胞数量。借助镜台测微尺测直径可计算出视野的直径：每ml总数=视野平均菌数×1cm2/视野面积×100×稀释倍数 （3）比例计数法将菌液与等体积血液混合后涂片，计算细菌数与红细胞比例。根据比例来计数（4）比浊法测定菌数的快速方法。菌液中细胞浓度与浑浊度成正比，因此测定悬液的光密度就可以反映细胞浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数悬液相比来计数。 2、测定活菌数（1）载玻片薄琼脂层计数法（2）平板菌落计数法（CFU）：取定量稀释液，用涂布或倾注平板的方法在固体培养基上培养，计算菌落 （3）液体稀释培养基计数：将待测样品作连续10倍稀释，一直稀释到稀释液的少量接种到新鲜培养基中没有或极少生长。记录每个稀释度出现生长的试管数，再用或然率理论，查MPN（mostprobablenumber，最大可能数量）表，根据样品的稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。（4）薄膜计数法：如果测定量大而含菌浓度很低的样品（如空气、水）中的活菌数，可将样品用微孔薄膜（硝化纤维素薄膜）过滤，再与膜一起放到培养基或浸透培养液支持物表面培养。 3、计算生长量：测细菌重量（1）测细胞干重：一般干重为湿重的20-25%。收集单位体积培养液中菌体，干燥器内加热或减压干燥，直接用仪器测定。（2）测细胞含N量确定细胞浓度：凯氏定氮法测N，总蛋白含量=含N量%×6.25（3）通过DNA测定计算浓度：荧光法，每个菌平均含DNA8.4×10-5ng（4）生理指标：测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量或二氧化碳产量。 第二节   微生物的生存因子 一、温度温度对生活机体的影响表现在两方面：一方面是随着温度上升，细胞中生物反应和生长速率加快，另一方面蛋白质、核酸等可能在高温下被破坏。每种微生物都有最低生长温度、最高生长温度、最适生长温度、致死温度。各种微生物最适温度不一致，可将微生物分为嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌、嗜超热菌。大多数细菌是嗜中温菌。嗜热菌和嗜超热菌是特殊微生物，细分为：专性嗜热菌、兼性嗜热菌、超嗜热菌。 微生物类型生长温度／℃最低最适最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035；嗜温微生物15-2020-4545以上嗜热微生物4555-6580超嗜热或嗜高温微生物6580-90100以上 1、嗜冷菌专性嗜冷菌：最适5-15℃，最低-12℃，两极地区。兼性嗜冷菌：最适10-20℃，最低，-5-0℃，海水及冷藏食品李斯特菌嗜冷微生物能在低温下生长的机制在于：（1）酶在低温下仍能有效地发挥作用（2）细胞膜中不饱和脂肪酸含量较高，低温下仍能保持流动状态。低温致死的原因是细胞内水分变成冰晶，造成细胞脱水，还造成细胞尤其是细胞膜的损伤。 2、嗜热菌：适于在45-50℃中生长，主要分布在温泉、堆肥和土壤中。机制：（1）酶和蛋白质比中温型更能抗热（2）产生多胺、热亚胺和高温精胺，可稳定细胞中与蛋白质合成有关的结构和保护大分子免受高温的损害（3）核酸也有保证热稳定性的结构（4）细胞膜中含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，使膜具有热稳定性（5）生长速率快，合成大分子迅速，可及时弥补由于热所造成的大分子的破坏 二、pH环境中的pH对微生物生命活动影响很大：1、引起细胞膜电荷的变化，影响微生物对营养物质的吸收2、影响代谢过程中酶的活性3、改变生长环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性 不同微生物生长所需的pH不同。大多数微生物最适pH6.5-7.5，适应范围在pH4-10之间。能在pH1-5范围内生长的微生物称为专性嗜酸微生物，如氧化硫硫杆菌、酸热硫化叶菌；能在酸性条件下也能在中性条件下生长的为兼性嗜酸微生物；能在高pH下生长的为嗜碱性微生物，如巴氏芽孢杆菌能在pH11.2-11.6条件下生长（最适pH9.6）。微生物最低pH最适pH最高pH细菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-8 在培养微生物的过程中，随着微生物的生长繁殖和代谢进行，pH会变化：碳源：葡萄糖、乳糖→有机酸——pH下降氮源：蛋白质、蛋白胨、氨基酸→氨、胺类——pH上升（NH4）2SO4→SO42-——pH下降Na2NO3→NO32-被吸收——pH上升尿素→氨——pH上升 三、氧化还原电位（Eh）指的是氧化体系供给电子（作为还原剂）或接受电子（作为氧化剂）的趋势的度量，单位为mv。氧化环境有正电位，还原环境有负电位各种微生物需要的氧化还原电位不同：好氧微生物—+300~+400mv，大于100mv才能生长；兼性厌氧微生物—+100mv以上好氧呼吸，小于+100mv无氧呼吸；专性厌氧微生物—–200~-250mv，产甲烷菌-300~-400mv。 影响因素：1、氧分压：分压高，氧化还原电位高2、pH：pH低，氧化还原电位低3、微生物的生长：对有机物的氧化可使氧化还原电位下降，在代谢过程所产生的H2、H2S也使氧化还原电位下降。加入还原剂可使氧化还原电位下降。要提高氧化还原电位，提高氧的通气。氧化还原电位影响微生物许多酶的活性，也影响细胞的呼吸作用。在某些条件下，如果保持低的氧化还原电位，则专性厌氧菌可不被氧杀死。所以有人认为氧不是专性厌氧菌的致死原因，而是由于氧所形成的高氧化还原电位。 四、溶解氧根据微生物与分子氧的关系，分为：好氧微生物：专性好氧微生物——PO20.2×101KPa微量好氧微生物——PO20.03-0.2×101KPa兼性厌氧（兼性好氧）厌氧微生物：专性厌氧微生物——PO2小于0.005×101KPa耐氧厌氧微生物—— （一）好氧微生物与氧的关系大多数细菌、大多数放线菌、霉菌、原生动物、微型后生动物都属于好氧性微生物。氧对好氧微生物的作用：1、作为微生物好氧呼吸中电子传递链的最终受体2、参与甾醇类和不饱和脂肪酸的生物合成在利用氧的过程中，氧可产生各种有毒的代谢产物如过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子等，好氧微生物体内具有SOD、CAT、过氧化物酶可清除之。 好氧微生物需要的是溶解氧。氧的溶解度与水温、大气压有关。温度低，溶解度大；压力大，溶解度大。在纯水中0℃时氧溶解度14mg/L；10℃——11.3mg/L；20℃——9.2mg/L；30℃——7.7mg/L。含有机物的污水溶解度很低好氧微生物需要供给充足的氧气。实验室内振荡培养，工业生产上采用通入无菌空气和搅拌等方法供氧。污水处理中利用各种充氧设备充氧，供给量根据微生物的数量、理化性质、基质性质及浓度综合考虑。一般来说，溶解氧质量浓度维持在3-4mg/L，若供氧不足，废水处理效果不好。 （二）兼性厌氧菌与氧的关系兼性厌氧菌既有脱氧酶又有氧化酶，因此既能在无氧条件下又能在有氧条件下生存。在有氧条件下，氧化酶活性强，可进行氧化磷酸化；无氧时，细胞色素和电子传递体系的其他组分减少或丧失，但充氧后又可全部恢复。兼性微生物包括酵母菌、肠道细菌、硝酸盐还原菌、人和动物致病菌、某些原生动物、微型后生动物、个别真菌。 酵母在有氧条件下进行好氧呼吸，将有机物氧化成二氧化碳和水；无氧条件下，发酵葡萄糖产生乙醇和二氧化碳。在发酵过程中通入氧，发酵速度下降，葡萄糖利用速度下降，氧对葡萄糖的利用有抑制作用——巴斯德效应。原因在于有氧的情况下，氧化磷酸化使NADH的H+不再转给丙酮酸生成乳酸而是传给氧产生ATP，丙酮酸进入TCA循环使柠檬酸浓度增加，高含量的ATP及柠檬酸抑制磷酸果糖激酶的活性，从而减慢糖酵解的速度。兼性厌氧菌在污水处理中有积极作用。在供氧不足的条件下，它们可对有机物进行不彻底的氧化，将大分子的蛋白质、脂肪、糖类分解成小分子的有机酸和醇。 （三）厌氧微生物：专性厌氧微生物——梭菌属、拟杆菌、产甲烷菌等耐氧的厌氧微生物——氧的存在对它们无影响，不利用氧也不中毒。如乳酸菌。专性厌氧微生物的生存环境中绝对不能有氧，有氧存在时代谢产生的NADH2和O2反应产生H2O2、NAD，还可产生超氧阴离子，而且专性厌氧微生物不具备SOD、H2O2酶。耐氧的厌氧微生物具有SOD，但缺乏H2O2酶，H2O2积累过多仍会被氧化。 厌氧微生物的培养：可用N2、H2、He驱赶氧；加入氧化还原颜料——甲基兰或刃天青指示培养基的氧化还原电位；要预先还原，将氧化还原电位降到一定值，可加入还原剂、维生素C、巯基乙醇、半胱氨酸盐酸盐等。厌氧罐 AnaerobicGloveBox 五、太阳辐射波长小于1000nm的红外辐射，可被光合细菌利用作为能源；波长380-760nm的可见光是蓝细菌、藻类进行光合作用的能源。光氧化作用：强烈的可见光可引起微生物的死亡。当光线被细胞内色素吸收后，在有氧的条件下，可产生许多氧自由基，引起一些酶或其他敏感部分失去活性。光动力作用：在细菌悬液中加入荧光染料,细菌对可见光具有高度敏感性，照射几分钟后即可引起死亡，其原因是染色剂诱使细胞吸收可见光内某些波长的光线而导致细胞死亡。 六、水的活度与渗透压（一）水活度水活度是在一定的物质中含有可利用水分的一种表达方式。水的可利用性既取决于水的含量也取决于水被吸附的紧密程度和有机体把水移进体内的效力大小。水对微生物的影响可以用水的活度值aw这个参数来表示，aw表示水的吸附和溶液因子对水可利用性的影响的一个指标，定义为：一定温度下（25度），某溶液或物质在与一定空间空气相平衡时的含水量与空气饱和水量的比值。 水的活度分基质的水活度（吸附影响）和渗透压的水活度（受溶质相互作用的影响）。大多数微生物在aw为0.95-0.99时生长最好，低至0.60-0.70时除少数真菌和酵母菌外，大多数微生物不能生长。 （二）渗透压渗透压的大小决定于浓度。在一定容量的溶液中所含溶质的分子或离子的数量与渗透压成正比。在同一浓度的溶液中，含小分子溶质的溶液渗透压大。离子溶液的渗透压比分子溶液大。G+渗透压大于G-（G+中凝聚着某些氨基酸）。微生物在不同渗透压溶液中有不同反应：等渗——0.5-0.85%NaCl溶液，生长良好：低渗——破裂：高渗——质壁分离。 嗜高渗微生物：花蜜酵母属和某些霉菌可在蜜饯上生长。盐杆菌可使盐渍食品腐败，如咸鱼上长的红色细菌。酱油变质时表面生产菌蹼——产膜性酵母菌。极端嗜盐菌（古细菌）可在15-30%的盐溶液中生长，可应用于含盐量高的废水生物处理上。细菌能调节体内的离子浓度，以适应不同的渗透压力，主要是K+。当细菌处于高渗溶液中能大量积累K+（可高于外环境64-140倍），反之排K+。 七、表面张力液体表面的分子被它周围和内部的分子所吸引，而使液面趋向收缩，这种力量称为表面张力，表示为作用在单位长度上的收缩力。培养基表面张力为4.5-6.5×10-4N/m，适合微生物生长。再降低时将影响菌体形态、生长和繁殖。不同细菌对表面张力的忍受力不同，G-大于G+。20℃，4.0×10-4N/m适合G-的生长。在培养液中加入甘氨胆酸钠和牛磺酸钠（胆酸盐），使表面张力降至3.72-3.75×10-4N/m，此时肺炎球菌和链球菌等G+将发生细胞溶解现象。可用胆汁溶解实验鉴别。肠道内的细菌因长期生存在富含胆汁的肠道中，可适应降低的表面张力，故胆酸盐广泛应用于大肠菌群的分离。 第三节其他不利环境因子对微生物的影响 一、紫外辐射和电离辐射（一）紫外辐射紫外线的波长一般是200-390nm，240-300nm的范围内对微生物有致死效应。250-280nm杀伤力最强。紫外辐射杀菌灯的波长是253.7nm，杀菌力强而且稳定。作用原理：1、引起DNA分子产生胸腺嘧啶二聚体，使DNA不能复制。2、紫外线可使空气中的分子氧变成臭氧，臭氧易分解产生单线态氧。Ｏ２紫外线０３０２＋｛O｝ 光复活：经紫外线照射的微生物，在可见光下，可以激活DNA修复酶，修复辐射造成的损伤。这种酶主要作用于由紫外线引起的T-T二聚体，可以与之结合形成复合物，被可见光活化，将受损区域两端的磷酸二酯键水解，切除受损DNA，再由另一些酶催化插入新的核苷酸，补上切去的片段。暗修复：切除修复和复制后重组修复。 不同微生物或不同生长阶段对紫外线的抵抗力不同。G-无芽孢杆菌（大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌）最敏感，G+照射量要增加5-10倍，病毒的抵抗力更大，芽孢比营养细胞抵抗力高5-10倍。干燥细胞抵抗力大于湿细胞，有色素细菌大于无色细菌。芽孢在出芽阶段抵抗力最弱，酵母菌在对数生长期抵抗力最强。应用：紫外线的穿透力很弱，只能用作表面消毒或空气消毒。空气消毒——利用紫外辐射杀菌灯；表面消毒——对某些不能用加热和化学药品消毒的器具；诱变育种——低于致死剂量下照射。 （二）电离辐射X-射线、γ-射线等高能电磁波，可以将被照射物质原子核周围的电子打出，射出的电子可以依附于其他质子上，使之变为阴离子，也可以再冲击其他原子，打出外围所含的电子引起继发性电离，这种辐射作用称电离辐射。X-射线波长范围0.1-0.01nm，γ-射线0.01-0.001nm。低剂量照射有促进生长作用或引起变异，高剂量可致死。X-射线在10-20cm照射2-30min可以杀死平板上大肠杆菌、炭疽杆菌、芽孢杆菌、白喉棒状杆菌和葡萄球菌等，但对液体培养基杀伤离不大。 微生物对电离辐射的敏感程度不同。假单胞菌较敏感，小球菌和链球菌抗性较强。芽孢有较强抗性。不同生长阶段敏感性不同。在培养基中加入某些化合物如含-SH的化合物，可增加抵抗力。蛋白质、醇、葡萄糖、羧酸、乙醇等也有保护作用。X-射线穿透力强，但因经济原因一般不用于灭菌，常被用于诱变剂。作用机制：1、直接作用。辐射的能量直接作用于细胞内部的某个特殊敏感区域，导致细胞突变或死亡。2、间接作用：辐射可引起培养基中的水或者氧电离，产生自由基 机制：1、细胞内含物受到强烈震荡，胶体发生絮状沉淀，凝胶液化或乳化，丧失生物活性2、空穴作用：超声波的高频振动与细胞振动不协调而造成细胞周围环境的局部真空，引起细胞周围压力的极大变化，使细胞破裂3、溶解的气体变成小气泡，气泡冲击引起细胞破裂4、热作用应用：细菌裂解，研究其构造及其化学组成；提取病毒；治疗疾病。超声波的杀菌效果与其频率、处理时间、细菌大小、形状及数量有关。二、超声波 三、重金属重金属是酶的组成成分，适当浓度对微生物生长有促进作用，高浓度下则可致死。重金属带正电荷，易与带负电荷的菌体蛋白结合，有较强的杀菌能力。机制：1、与酶或蛋白质上的-SH发生反应使酶失活，蛋白质变性2、进入细胞后以金属原子的形式沉积在细胞内产生抗代谢作用3、重金属离子在细胞内与主要代谢物发生螯和作用4、取代细胞结构上的主要元素 铜：硫酸铜是主要的铜化合物杀菌剂，对真菌及藻类效果较好，也可以杀死金黄色葡萄球菌和抑制破伤风杆菌芽孢。铅：1-5g/L几分钟内可使细菌死亡银：长期作为一种温和防腐剂使用。0.1-1%硝酸银用于皮肤消毒。汞：HgCl2、Hg2Cl、HgCl和有机汞。HgCl21：500-1：2000对大多数细菌有致死作用，实验室也曾用0.1%HgCl2消毒非金属器皿。红汞也是最常用的消毒剂之一。但汞盐有剧毒，应用较受限制。 四、极端温度超高温（大于细菌最高生长温度）杀菌的机制：1、引起蛋白质和核酸不可逆的变性2、细胞膜中脂肪被溶解使膜上形成小孔，细胞内含物泄漏引起死亡超高温灭菌效果的影响因素：1、菌种：无芽孢菌比芽孢菌易死亡。2、所需时间与温度高低有关3、与菌龄有关。幼龄比老龄敏感4、pH。pH低易被杀死5、菌体含水量。干细胞比湿细胞耐热。致死温度与菌体蛋白质含水量有关。 灭菌与消毒：消毒(disinfection)是用物理、化学因素杀死致病菌（有芽孢和无芽孢的细菌），或者是杀死所有微生物的营养细胞或一部分芽孢。灭菌(sterilization)是通过超高温或其他物理、化学因素将所有微生物的营养细胞和所有的芽孢或孢子全部杀死。防腐(antisepsis)：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施 高温灭菌方法：干热灭菌焚烧；干热灭菌，160℃1-2h，适用于玻璃、金属器皿湿热灭菌高压蒸汽灭菌；间歇灭菌法，100℃15-30min，37℃保温一天，再以同样方法加热，反复三次。缺点：费时，适用于不耐热药品、营养物、特殊培养基或缺乏高温设备时，也可用于一般物品灭菌。 消毒方法：煮沸消毒法：100℃15min，加入1%Na2CO3、2-5%石炭酸效果更好，适用于注射器、解剖器具消毒巴斯德消毒法：采用60-70℃处理15-30min，可以去除食品（酒、牛奶等）的病原微生物。低温维持法：只要在63℃下维持30min高温瞬时法：只要在72℃下维持15s超高温法：只要在135-150℃下维持2-6s 五、极端pH过高过低pH对微生物生长都不利，表现在：1、pH过低，引起微生物表面由负电荷变为带正电，影响微生物对营养物的吸收2、影响培养基中有机化合物的离子化作用，间接影响微生物3、pH适宜时才能使酶发挥最大活性4、过高过低pH都降低微生物对高温的抵抗能力强酸强碱具有杀菌力。无机酸腐蚀性大，实际上不作消毒剂，某些有机酸如苯甲酸可作消毒剂。强碱可用作杀菌剂，但毒性大。对G-与病毒的作用比G+强。 六、干燥干燥（指水活度低至0.60-0.70）会使微生物的代谢活动停止，有机体基本处于休眠状态，严重时会引起细胞脱水和蛋白质变性进而引起死亡。不同微生物抗干燥能力不同。大多数腐生或寄生细菌的营养细胞可在大气下干化死亡。一般小型细胞、细胞壁厚的细胞、圆形细胞和孢子、芽孢、胞囊较耐干燥。 干燥作用与温度有关，温度越高越容易死亡。干燥缓慢进行，死亡率高。与菌龄、空气有无及基质性质也有关。在蒸馏水中微生物干燥后易死亡，含糖、淀粉、蛋白质基质中的微生物，干燥后存活时间长。干燥条件下，细胞代谢处于停滞状态，供给潮气又可复活。可用于保存食品、物品和菌种（沙土管、冷冻干燥）。 七、有机物（一）醇是脱水剂和脂溶剂，可使蛋白质脱水、变性，杀死菌体，还能溶解物品表面的油脂，所以有机械除菌的作用。乙醇是常用的消毒剂，70%（重量）或77%（体积）效果最好，纯乙醇不起杀菌作用。乙醇对芽孢不敏感。甲醇杀菌力差而且有毒，不宜作杀菌剂。醇的杀菌力随分子量的增加而增加，丁醇>丙醇>乙醇>甲醇，90%-95%异丙醇比70%乙醇杀菌力大但有刺鼻气味。 （二）甲醛通常使用37-40%甲醛溶液（福尔马林），可杀死细菌、真菌及其芽孢和病毒。0.1-0.2%的甲醛溶液可杀死细菌营养体，5%可杀死芽孢。甲醛具有还原作用，能与蛋白质的-NH结合而使蛋白质变性。可作熏蒸消毒剂，对空气和物体表面消毒。也常用作动物组织的固定剂。 （三）表面活性剂1、酚酚是表面活性剂，可引起蛋白质变性，还可抑制脱氢酶和氧化酶的活性。又名石炭酸，常用浓度5%，短时间内可杀死细菌营养体，杀死细菌芽孢需要几小时或更长的时间。酚的衍生物，如甲酚、间苯二酚和六氯苯酚杀菌力更强。石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。 2、新洁尔灭阳离子表面活性剂。能吸附带负电荷的细菌，破坏细菌的细胞膜最终导致菌体自溶死亡，也可使菌体蛋白变性沉淀。对许多非芽孢型致病菌有效，对芽孢无作用，对肥皂、碘、高锰酸钾等阴离子表面活性剂有拮抗作用。3、合成洗涤剂合成洗涤剂中主要起去污作用的物质是表面活性剂，根据表面活性剂在水中解离出的有表面活性的离子所带电荷的不同，可分为阴离子型、阳离子型、两性型及非离子型。目前主要应用的是非离子型和阴离子型。阴离子型的LAS（直链烷基苯磺酸钠），可被生物降解，有杀菌作用。 4、染料带正电荷的碱性染料如孔雀绿、亮绿、结晶紫、吖啶黄都有抑菌作用。碱性染料的阳离子与菌体的羧基或磷酸基作用，形成弱电离的化合物，妨碍菌体正常代谢，扰乱菌体的氧化还原作用，并阻碍芽孢的形成。G+比G-敏感，结晶紫抑制G-要比G+浓10倍。由于染色剂的抑菌作用有选择性，利用此可将菌分离。常在培养基中加入10-6g/L的染料配制成选择培养基，只有G-可以生长，可用于大肠杆菌的鉴别实验。 八、抗生素antibiotics大多数抗生素是由某些微生物合成或半合成的化合物，在低浓度（ug/ml）即可杀死或抑制其他微生物生长的化合物。分为广谱抗生素——氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等；狭谱抗生素——青霉素、多枯菌素（G-）。作用方式各不相同，主要是阻止微生物新陈代谢的某些环节，钝化某些酶的活性。 1、抑制细胞壁的合成。青霉素抑制G+肽聚糖的形成。肽聚糖中胞壁酸上连接有一条短肽链，相邻短肽链之间以五甘氨酸桥连接，五甘氨酸一端与D-丙氨酸连接。青霉素β-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构很相似，从而能占据D-丙氨酸的位置与转肽酶结合，将酶灭活，肽链无法连接，抑制细胞壁合成，使菌体吸收水分膨胀破裂。多氯霉素——杀真菌剂，阻碍细胞壁中几丁质的形成，对细胞壁主要是纤维素组成的藻类没什么作用。 抑制细胞壁肽聚糖合成的抗生素主要作用于G+，对G-效果不明显。另外，对生长旺盛的细胞作用明显，对静止细胞不明显。 2、破坏细胞质膜某些抗生素尤其是多肽类抗生素如多粘菌素、短杆菌素等等，主要引起细胞膜损伤。多粘菌素与G-质膜中的磷酸基结合，损伤细胞质膜，导致细胞物质的泄漏。作用于真菌细胞膜的大部分是多烯类抗生素，如制菌霉素、两性霉素等，主要与膜中的麦角固醇结合从而破坏膜结构，细菌质膜不含固醇，不起作用。 3、干扰蛋白质合成通过抑制蛋白质生物合成来抑制微生物生长，并非杀死微生物。不同的抗生素抑制蛋白质合成机制不同：与核糖体亚基结合30S亚基——卡那霉素、链霉素、春日霉素50S亚基——氯霉素、红霉素、林可霉素等；在蛋白质合成的不同阶段起作用能与酶组分中的金属离子结合，抑制酶活性。 4、阻碍核酸的合成。通过抑制DNA或RNA的合成来抑制微生物正常的生长繁殖。作用机制有所不同：丝裂霉素——与核酸上的碱基结合形成交联，阻碍DNA解链，从而影响DNA复制；博莱霉素（争光霉素）——切断DNA的核苷酸链，使DNA分子量下降，干扰DNA复制；利福霉素——作用于核酸酶，与RNA合成酶结合，抑制RNA合成酶反应的起始阶段；放线菌素D（更生霉素）——多肽类，作用是干扰RNA聚合酶的转录过程，使RNA链停止延长 此外，有的抗生素可提高DNA酶活性，使DNA部分裂解（丝裂霉素）；有的可嵌入DNA分子中破坏其立体构型，影响DNA的复制和转录。除了这些机制外，有的抗生素作用于电子传递系统，使呼吸作用停止；有的是能量转移的抑制剂，使ATP不能合成；有的是解偶联剂，呼吸可进行但不合成能量。 第四节微生物与微生物之间的关系 一、竞争关系competition竞争关系是指不同微生物种群生活在同一环境中，对食物等营养、溶解氧、空间和其他共同要求的物质相互争夺，其中最能适应特殊生境的将占优势。但由于在竞争中，两者都要消耗有限的同一养料，结果使两种微生物的生长都受限制。种间共处是两种微生物相互无影响地生活在一起，如乳杆菌和链球菌分别进行纯培养和混合培养，最后两种菌的种群几乎是相同的。 二、原始合作关系protocooperation也称互生关系。指两种可以独立生活的微生物共存于同一环境中，相互提供营养及其他生活条件，双方得益或是一方得利，当两者分开时可单独生存。三、共生关系symbiosis指两种不能单独生活的微生物共同生活于同一环境中，各自执行优势的生理功能，在营养上互为有利，组成共生体，两者之间的关系就为共生关系。这种关系高度发展时形成特殊共生体，生理上有一定分工，组织形态上有新的结构，互惠共生是两者从结合中都得利，偏利共生是一方得利另一方也无害。 典型的例子是地衣。地衣组成：真菌（子囊菌，担子菌）、单细胞藻类（绿藻，蓝藻）地衣的结构：形成有固定形态的叶状结构，真菌无规则地缠绕藻类细胞，或二者组成一定的层次排列。地衣的代谢：地衣中的真菌和藻类已形成特殊形态的整体了，在生理上相互依存，真菌营异养生活，藻类制造养料，真菌提供水分、无机盐供藻类光合作用。 四、偏害是两种微生物生活在一起时，一种微生物产生某种特殊的代谢产物或改变环境条件，抑制别种微生物的生长繁殖，或者毒害甚至杀死对方的现象，也称拮抗。非特异性偏害：乳酸菌生长可抑制其他细菌生长特异性偏害：产生抗生素五、捕食一种微生物直接吞食另一种微生物。细菌、藻类、真菌→小型原生动物→大型原生动物→微型后生动物→微型甲壳动物，捕食关系在控制种群密度、生态食物链中有重要意义。 捕食性真菌：捕食线虫 六、寄生关系是一种生物生活在另一种生物的表面或体内，从后者的细胞组织或体液中取得营养的现象，前者为寄生物，后为寄主。寄生物对寄主一般是有害的，常使寄主发生病害或死亡。蛭弧菌 第五节菌种的退化、复壮与保藏 一、菌种的退化和复壮退化的表现：1、菌落和细胞形态的改变，苏云金芽孢杆菌伴孢晶体小而少2、生长速度缓慢，孢子数量减少3、代谢产物生产能力下降，对寄主寄生能力下降复壮的方法：1、纯种分离：稀释平板法，平板划线分离或涂布法2、通过寄主进行复壮：寄生性微生物的退化菌株可通过接种至相应昆虫或动植物寄主体内以提高菌株毒性。3、联合复壮：高剂量紫外辐射+低剂量DTG 二、菌种的保藏原理：根据微生物的生理生化特性，创造一个最有利于休眠的环境条件如干燥、缺氧、低温、缺乏营养及添加保护剂等，使微生物代谢缓慢，生长繁殖受抑制。1、定期移植法简便易行，不需特殊设备。斜面培养，液体培养及穿刺培养均可。缺点是保藏时间短，反复转接性状易变异。 2、干燥法将菌种接种到适当的载体上，如砂粒、土壤、硅胶、滤纸片、明胶片、麸皮、麦粒上，保藏菌种常用的是沙土管保藏法。仅适用于保藏产生芽孢或孢子的微生物，可保藏几年。明胶片——细菌，硅胶——丝状真菌，麸皮——产孢子丝状真菌。3、隔绝空气法移植法的辅助方法。液体石蜡保藏法：适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌，可保藏1-2年。4、蒸馏水悬浮法最简单的保藏方法。试管加入5ml玻璃器皿蒸馏的蒸馏水，灭菌。接种环取菌，混匀后10oC贮藏。 5、综合法——冷冻真空干燥保藏法集中了菌种保藏的有利条件，如低温、缺氧、干燥和添加保护剂，是目前最有效的菌种保存方法之一。优点：适用范围广，除少数不生孢子只产生菌丝体的丝状真菌外其他都可用；保存期长，可达几年至十几年；存活率高。 主要有3个步骤：（1）将待保藏的菌种悬浮于保护剂中，目的是减少因冷冻或水分升华对微生物细胞造成的损害。（2）预冻：将装有0.2ml菌悬液的安瓿瓶放在低温冰箱-35--45度中冷冻成冰（3）真空干燥：使冰升华除去水分，6-8小时后样品呈白色疏松状态。将安瓿瓶管熔封。低温或常温保存