ARMS法检测.ppt

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1、ARMS法ARMS法技术ARMS法与测序法比较ARMS原理ARMS应用目前，突变扩增阻滞系统（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS）已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。ARMS技术优点ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法（表1），可检测出样品中含量低至0.1-1.0%的突变基因；该方法在设计上可以最大限度地缩短目标产物的长度，可以解决石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难点；该方法结合实

2、时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物的后处理，能最大程度地避免扩增产物的污染。表1ARMS法与测序法比较测序法ARMS法敏感度10-20%1%FFPE标本成功率低高商用试剂盒无有流程与速度复杂慢简单快数据分析要求高低试剂成本低略高仪器成本高低假阳性机会（交叉污染）多少其中ARMS检测可以分为实时荧光定量PCR和巢式ARMS法电泳检测。实时荧光定量PCRARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测，以达到对基

3、因突变检测的高特异性和高灵敏度。该技术所用探针为Scorpion探针，Scorpion探针是一种新型的探针，由一条发夹结构的探针和一条引物构成，探针的5'端和3'端分别标有报告荧光和淬灭荧光，3'端通过PCRblocker（一个非扩增的单体,防止探针退火后的延伸）与引物的5'端相连。在自由状态，报告荧光和淬灭荧光很接近，不产生荧光。变性阶段茎环结构打开，退火时引物与模板结合并延伸，环区与新合成的目的基因的互补区域结合，此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上，是分子内的结合。由于发夹结构打开，报告荧光和淬灭荧光分离，因此可

4、检测到报告荧光发出的荧光信号。由于Scorpion探针中序列特异性引物和探针在同一分子上，因此信号的产生特别快。巢式ARMS法电泳检测利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变，该法省去了探针杂交操作。基本原理在PCR扩增时，引物的延伸是从其3"未端开始的，而这种延伸的进行要求引物3"端的碱基与模板需完全配对，只有这样引物才能延伸，扩增才得以进行下去而得到预期的扩增产物，若引物3"端与模板不能

5、配对，则引物的延伸即阻断，不能得到相对应的扩增产物，基于以上事实，可利用3"端含突变碱基的引物来检测靶DNA中有无相应的突变位点，此即3"特异PCR，扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.该反应系统包含两个PCR扩增反应，有两对引物但它们的3"端有差异，一为正常引物，另一为3"端编食突变的引物，正常引物只与正常模板互解，PCR时扩增相应的产物，而食突变的引物只与突变的模板附扩增出相应的产物.扩增完成后可直接同琼脂糖电泳技术检测分析结果。碱基配合、或错配，决定PCR能不能进行PCR产物一边长，而另一边短，通过电泳，就可以方便地确定哪一边扩出来

6、了，就是碱基配合的；反之，没有扩出来的，那一边引物的最后一个碱基是错配的2组对称的实验，把最终的SNP型确定下来。利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子，而且能检出杂合子个体，在这种情况下，同一个体的DNA模板利用突变引物和正常引物均能引发扩增反应.尚可利用多对突变引物和正常引物进行多重3"-特异PCR，可攻DNA分子上的多位点变化的鉴定准确快速，简便。应用目前利用ARMS法研发用于临床的试剂盒有：人KRAS基因突变检测试剂盒(Taqman-ARMS法)本试剂盒用于检测大肠癌患者癌组织中KRAS基因的热点突变情况，可定性检测

7、KRAS基因外显子2中第12密码子(G12D(35G＞A)、G12A(35G＞C)、G12V(35G＞T))和13密码子(G13D(38G＞A))的四个热点突变位点。ARMS-PCR法四项耳聋基因检测试剂盒近日，中生北控生物科技股份有限公司分子诊断试剂研发部开发的ARMS-PCR法四项耳聋基因检测试剂盒经中检所检测，顺利通过国家药监部门的审核，获得国家食品药品监督管理局颁发的医疗器械注册证，注册号为：国食药监械（准）字2012第3400599号。四项耳聋基因检测试剂盒用于定性检测人血细胞中基因组DNA中与遗传性耳聋相关的3个基因中的4个

8、突变位点，即GJB2基因235delC；SLC26A4基因IVS7-2A>G；线粒体12SrRNA基因1555A>G和1494C>T。这4个位点是中国人最常见的耳聋突变位点。通过对上述位点的检测，比常规听力