高脂诱导胰岛素抵抗大鼠的肝脏基因表达谱、粗提线粒体蛋白质组、mirnas的初步研究-临

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1、论文题目:高脂诱导胰岛素抵抗大鼠的肝脏基因表达谱、粗提线粒体蛋白质组、MiRNAs的初步研究答辩委员会主席：陈霖答辩委员会成员：吕建新陈秀枢论文答辩日期:2011年5月31日温州矢学院硕士学位论文Y1946483目录高脂诱导胰岛素抵抗大鼠的肝脏基因表达谱.粗提线粒体蛋白质组、MiRNAs的初步研究44＞壬卷至4第一部分高脂诱导胰岛素抵抗大乱模型的建立和相关检测11第二部分高脂诱导胰岛素抵抗大鼠肝脏基因表达谱初步分析第一章材料和方法25第二章结果第三部分高脂诱导胰岛素抵抗大鼠肝脏粗提线粒体餐白质组初步分析33第一章材料和方

2、法第二章结呆37第四部分高脂诱导胰岛素抵抗大鼠肝脏MiRNAs差异表达分析43第一章材料和方法・•第二章结果46分析与讨论…50温州IK学院硕士学付论文附录综述63■学位论文独创性声明73高脂诱导胰岛素抵抗大鼠的肝脏基因表达谱.粗提线粒体蛋白质组、MiRNAs的初步研究（省自然基金资助项目No:Y2090753）中文摘要目的1.建立高脂诱导胰岛素抵抗的大鼠模型。2.初步筛选出肝脏可能参与胰岛素抵抗发生的mRNA、蛋白（粗提线粒体）、miRNAs,为后续工作准备。3.进一步了解胰岛素抵抗的形成机制，并为诊断、治疗和改善胰岛

3、素抵抗提供的潜在靶点。方法1•实验动物：13只雄性SD大鼠（普食组6只，髙脂组7只），4・5w,130g左右；高脂配方：基础饲料80%,猪油18%,胆固醇2%。监测体重，根据H0ME4RKGTTs、ITTs判断系统胰岛素抵抗形成后处理大鼠，观察肝脏外观、称其湿重，进行血清基础生化、游离脂肪酸谱检测，肝脏透射电镜、线粒体拷贝数、能量指标、ROS检测。2.肝脏基因表达谱：肝脏总RNA提取后行mRNA表达谱芯片检测（IlluminaRatRef^12Beadchip）,结果行KEGG分析。3•肝脏粗提线粒体蛋白质组：粗提肝脏线

4、粒体蛋白，2・D分析找差异蛋白，挖取做MALDi-TOF质谱分析，然后Mascot软件分析，数据再KOG分类。4•肝脏miRNAs：肝脏总RNA提取后行miRNA的IlluminaSolexa测序、结果使用Mirtools软件分析，对差异miRNAsfflreal-timePCR进行验证，后用miRDB软件进行靶基因预测。•5.对差异mRNA、蛋白质、miRNAs进行综合分析。结果1•第12周时，HOME-IRkGTTs.ITTs结果提示系统胰岛素抵抗形成，此时表现为肥胖，脂肪肝，肝湿重增加，血脂紊乱，血清游离脂肪酸谱异

5、常，电镜显示肝•细胞内大量脂滴堆积.线粒体肿胀、胞核被挤压或固缩、内质网增生，线粒体拷贝数明显降低，ROS明显升高，能量指标无明显变化。i2•对提取合格的肝脏总RNA用含24000个探针的大鼠全基因组芯片检测，经校正和差异分析后获得1756个差异基因.进一步采用FDR后还有502个，显著上调的290个，显著下调的212个。再经KEGG通路分析，发现物质代谢、炎信症免疫通路、氧化/抗氧化系统、内质网.信号转导通路、细胞骨架等的变化。3•对粗提的肝脏线粒体蛋白行2・D分析，分离到的蛋白点数普食组1012±45.53,高脂组1

6、029.67±42.72个，差异点128个；取其中105个做MALDI-TOF质谱分5析，数据经搜库及分析整理，最终确定24个差异蛋白，即和普食组相比，高脂

7、■组中显著上调的9个蛋白，显著下调的15个蛋白；KOG分类发现它们主要参与生物代谢、细胞生命过程及信号转导等。4.对提取合格的肝脏总RNA用Solexa法对其miRNAs进行测序，结果ffMirtools数据分析，获得的已知miRNAs中普食组236个，高脂组239个，未知miRNAs中普食组22个，高脂组141个，差异miRNAs10个。对差异miRNAs进行相对

8、定量PCR，获1・5倍以上差异的miRNAs8个，用miRDB软件进行靶基因预测发现一些炎症、糖利用、细胞分化等相关的基因。结论高脂诱导的胰岛素抵抗大鼠模型可表现为肥胖.肝脏脂质沉积、血脂代谢异常、线粒体形态和数量受损、ROS增多、内质网增生。检测获得的差异mRNA、蛋白质、miRNAs,综合分析发现这种脂毒性可致物质代谢紊乱.炎症、免疫、内质网应激、氧化应激活跃，抗氧化系统.胰岛素通路则受损。而发生变化的各分子或各通路在该病理过程中具体功能需进一步研究验证。关键词高脂；胰岛素抵抗；基因表达谱；线粒体蛋白质组；MiRNA

9、sStudyonLivermRNAExpression,PreliminarilyExtractingMitochondrialProteomicsandDifferentialMiRNAsofRatswithInsulinResistanceInducedbyHFDSupportedbyProvinchlScien