脂质体介导pcDNA3.1-HGF瞬时转染小鼠MSCs及转染效果检测

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1、万方数据2008-0644(3)北京师范大学学报(自然科学版)JournalofBeijingNormalUniversity(NaturalScience)脂质体介导pcDNA3．1-HGF瞬时转染小鼠MSCs及转染效果检测*黄雅静”孙万军”孙琪云2’王冬梅2’艾辉胜2’(1)第二炮兵总医院，100088，北京I2)军事医学科学院附属医院，100071，北京)摘要肝细胞生长因子(HGF)对各种组织都具有促分裂、促迁移、促细胞形态发生的作用，尤其是肾脏、肺和肠道．间充质干细胞(MSC)是一种具有多向分化潜能的干细胞，同时还具有相对的定位归巢以及免疫调节作用，由于MSC具有较低

2、的免疫原性，可作为良好的基因载体．为联合应用HGF和MS(3的作用，本实验在分离培养小鼠MSC并鉴定后；应用脂质体介导法将pcDNA3．1-HGF瞬时转染MsC}采用半定量RT-PCR和ELISA法分别鉴定HGF的表达情况．结果表明：转染试剂对Msc的活性无影响，转染细胞形态及定向分化特性未发生改变；HGF在转染后48h达到最高表达量，随时间推移逐渐减低，在10d时仍略高于对照．脂质体介导pcDNA3．1-HGF瞬时转染小鼠MSC后，HGF在转染后10d内升高表达．关键词问充质干细胞；肝细胞生长因子；脂质体间充质干细胞(MSC)来源方便，易分离、培养，经多代扩增后仍保持干细胞

3、活性，可以分化为多种组织细胞，如骨、软骨、脂肪和肌肉；MSC能够分泌多种细胞因子来促进造血干细胞的生长和分化，在造血重建、组织修复和基因治疗等方面都具有广阔的临床应用前景[1-s]．本实验首先分离培养了小鼠骨髓来源的MSC，应用流式细胞仪检测细胞表型，并作诱导分化实验以鉴定．然后应用脂质体转染方法将pcDNA3．1一肝细胞生长因子(HGF)瞬时转染MSC，使其高表达HGF，并在转染后在mRNA水平、蛋白水平检测了HGF表达情况．1材料和方法1．1骨髓细胞制备无菌取C57BL／6小鼠股骨，用PBS冲出髓腔内骨髓，淋巴细胞分离液(质量浓度为1．083g·mL．1)分离单个核细胞，

4、PBS洗2次(1200r·min～。10min)．1．2MSC培养将制备的骨髓细胞悬液按照1×106cm-2的密度接种于25cm2的培养瓶中，在完全LGDMEM中(含lOOg·L-1胎牛血清，青链霉素双抗)，妒=5％C0：，37℃培养箱中静置培养．培养48h后去处悬浮细胞，每3天换液，贴壁细胞达到80％以上融合后，经1．5g·L．1的胰蛋白酶消化，1：2传代．I．3流式细胞仪鉴定MSC表面标志消化收集第2代细胞，用含妒=0．1％小牛血清的PBS重悬细胞，调整细胞数为106mL～．在流式管底部加入5pLFITC收稿日期：2008—01-16或PE标记的单抗(CD34，CDl06

5、，CD45，CD44，CD29，CDl05，Sca-1)，加入200pL细胞悬液，避光冰浴30min，上流式细胞仪检测．1．4MSC定向分化当细胞达80％融合时，以5×103cm-2接种于直径6cm的培养皿，加入诱导分化培养液；成脂分化体系包含地塞米松10-6mol·L～，IBMX0．5mmol·L～，维生素C0．1mmol·L～；成骨分化体系包含地塞米松10卅mol-L～，p磷酸甘油10mol·L～，维生素C0．05mol·L～；分别在第4、8、12和16d进行油红0染色和VonKossa染色．1．5转染军事医学科学院段海峰博士惠赠质粒pcDNA3．1一HGF，经转化扩大培

6、养后，应用于转染．质粒pcDNA3．1一HGF为卡那霉素抗性，酶切位点为BamHI和ApaI，应用核酸定量仪定量．取3pg质粒pcDNA3．1一HGF，加300弘L无血清LG-DMEM培养基，混合均匀；取15pLTransquick(脂质体转染试剂)，加300弘L无血清LG-DMEM培养基，混合均匀；合并以上2种溶液，混合均匀，室温孵育5min；细胞数按每孔2×105，接种于含2mL完全LG-DMEM培养基的六孔板中，培养24h至细胞对数生长期；对数生长的细胞经无血清培养基洗1次，加入800弘L无血清培养基；预处理溶液200pL加入实验孔，轻柔振荡混匀；设2组对照：一组加入仅

7、含转染试剂的溶液；另一组仅加入无血清培养基；在无血清条件下，37℃，妒一5％CQ温箱培养4h后换为完全培养基，继续培养．1．6转染细胞活性检测在24孔培养板2个孔中按万方数据260一北京师范大学学报(自然科学版)第44卷2x106接种细胞，一孔内加完全DMEM培养基，未做转染处理；另一孔按转染步骤处理，不加质粒，只加转染试剂，培养48h后收集细胞，经台盼兰染色，分别计数活细胞．1．7检测转染后细胞HGF表达情况转染48h开始，隔天取1孔细胞提取RNA，半定量RT—PCR方法检测HGF基因的表达．同时吸取