课题3　分解纤维素的微生物的分离 (2).ppt

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1、课题3分解纤维素的微生物的分离纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。课题背景草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆中也含大量的纤维素。纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成。基础知识（一）纤维素与纤维素酶1、纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶。（1）组分纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维

2、素细菌的纤维素酶位于细胞膜上，真菌和放线菌的纤维素酶是胞外酶，即分泌到生产菌胞外的酶（2）纤维素酶的分布(3)纤维素酶活性的测定实验：在2支20mL的试管中，分别放入1×6cm的滤纸条，再分别加入pH为4.8、物质的量浓度为0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液10mL、11mL。在加入10mL缓冲液的试管中加入1mL纤维素酶（70~80U/mL）。将二支试管固定在50mL的锥形瓶中，在摇床上以140r/min的转速振荡反应1h，观察结果。在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸－醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。〖思考1〗实验分析：

3、P27的小实验是如何构成对照的？2、纤维素的分解细菌如：纤维杆菌、纤维弧菌、纤维球菌等真菌如：木霉、青霉、根霉、黑曲霉等能分解纤维素的微生物有各种细菌、真菌和少数放线菌。种类1、人能不能对纤维素消化吸收？为什么？不能，因为人体不能合成纤维素酶。人以淀粉为主要的能量来源。思考：2、食物中的纤维素有什么作用？食物中的膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化液，有助于食物的消化和排泄。3、反刍动物能利用纤维素吗？为什么？能，在反刍动物的瘤胃中生活着大量可以分解纤维素的微生物，能产生大量的纤维素酶(二)、纤维素分解菌的筛选2、筛选原理：1、筛选方法：刚果红（CR）是一种染料，它

4、可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选3、筛选过程：红色复合物刚果红纤维素红色消失，出现透明圈可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌二、实验设计土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别培养基上挑选菌落什么样的环境取样?①选择培养基的特点?②培养的目的?挑选什么样的菌落?①鉴别培养基的特点?②如何鉴别?本实验流程与课题2中实验流程有哪些异同?前者直接稀释涂布在以尿素为唯一N源的选择培养基上，直接分离得到目的菌落；后者先进行选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，

5、再将菌液稀释涂布到鉴别培养基①分布环境1、土壤取样：富含纤维素的环境中由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。②原因③实例树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。二、实验操作讨论如果找不到合适的环境，可将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应埋进土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。2、选择培养(可以省略）①目的增加纤维素分解菌的浓度，以确保能

6、够从样品中分离所需要的微生物②、纤维素分解菌的选择培养基二、实验操作1.旁栏给出的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？2.这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖思考：3.你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照或将其中的纤维素粉改为葡萄糖〖旁栏思考题〗为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物

7、的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。3、梯度稀释4、涂布培养每个稀释度下需涂布3个平板按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释二、实验操作（1）、刚果红染色法:5、筛选菌株：方法一：先培养微生物，在长出菌落的培养基上，再加入刚果红进行颜色反应方法二：在倒平板时，先把培养基中其它成分灭菌后，加入刚果红二、实验操作方法一中NaCl溶液的作用？思考：漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。染色法优点缺点方法一方法二颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便，不存在菌落混杂问题产生淀粉

8、酶的微生物也产生模糊透明