凝胶层析和离子交换层析结合法纯化高盐发酵液中谷氨酰胺转胺酶.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2012年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1225～1230DOI：10．3724／SP．J．1096．2012．11275凝胶层析和离子交换层析结合法纯化高盐发酵液中谷氨酰胺转胺酶张莉丽，z张兰威杜明韩雪易华西张英春张艳禾马微-(哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨150090)(东北农业大学食品学院，哈尔滨150030)(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／动物细菌病研究室，哈尔滨150001)摘要采用凝胶层析和离子交换层析相结合的方法分离纯化高盐培养

2、基中的谷氨酰胺转胺酶，优化的凝胶层析的条件，上样量6mL，流速为0．25mL／rnin；离子交换层析的上样量50mL，流速为3mL／min。酶被纯化了4．22倍，比活力达17．33U／mg蛋白，回收率为77．5％。液相色谱一串联质谱鉴定、蛋白质数据库比对结果表明，纯酶与AAN01353是同种蛋白质。关键词谷氨酰胺转胺酶；分离纯化；液相色谱一串联质谱；凝胶层析；离子交换层析1引言谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，EC2．3．2．13，R-glutaminyl—peptide：amnie7-glutamyl-transferase，简称TGase)，又名转谷氨酰胺酶

3、，是一种催化酰基转移反应的酶，它催化肽链上的甲酰胺基(酰基供体)与各种主要氨基酸(酰基受体)进行反应。TGase可以使食品蛋白质发生交联，从而改善蛋白质的溶解性、水合性、流变性、乳化性及热稳定性，通过引入赖氨酸提高蛋白质的营养价值】。1989年，Ando等报道了链霉菌发酵生产、分离纯化TGase的方法，开创了微生物发酵生产此酶的新方法。微生物TGase已经从细菌和酵母中分离出来伽，但是这些微生物合成的酶量小，发酵液中的比酶活低，不易于分离纯化。另外，已有些关于重组菌株表达和纯化TGase的报道[11~14]，虽然它们的产量较高，但是由于基因工程菌株存在安全性问题，限制了它在食品

4、工业中的应用。本研究采用凝胶层析结合离子交换的方法分离纯化了高盐培养基中的TGase，并利用液相色谱一串联质谱对纯酶作了鉴定。2实验部分2．1仪器与试剂TU-1800分光光度计(北京普析通用有限责任公司)；3-30K冷冻离心机(Sigma公司)；超滤设备：MilliporeLabscaleTFFSystem(MilliporeCorporation，Bedford，Massachusetts，USA)；蛋白纯化系统AKTAPurifier(AmershamBioscienes)；Agilent6410液相色谱串联三重四极杆质谱仪。葡聚糖凝胶(SephadexG-75)；磺丙基琼

5、脂糖凝胶(SPsepharoseHighPerformance)；甲酸(色谱纯，Fisher公司)；乙腈(色谱纯，Fluka公司)；水为Millipore超纯水；N—CBZ—Gln-Gly，L一谷氨酸一单羟肟酸(Sigma公司)；链霉菌TGase单克隆抗体(Covalab公司)。2．2菌种和TGase发酵液的制备2．2．1菌种茂原链霉丝菌DSM40587(Streptomycesmobaraensis)购于日本NBRC公司。2．2．2培养基斜面培养基：高氏一号培养基。种子培养基：聚蛋白胨20g／L，可溶性淀粉20g／L，KzHPO2g／L，KH：PO2g／L，酵母粉2g／L，无

6、水MgSO2g／L，pH7．0。发酵培养基：聚蛋白胨30g／L，可溶性淀粉10g／L，果糖10g／L，K2HPO42g／L，酵母粉2g／L，无水MgSO41g／L，MgC1220．3g／L，pH7．0。2．2．3TGase发酵液的制备用无菌生理盐水将培养于斜面培养基7d的菌丝体洗下，接种于种子培养基中，30℃，振荡培养(200r／min)48h，按10％的接种量接种于发酵培养基中，30℃，振荡培养201卜11一O1收稿；201203—01接受本文系国家自然科学基金(No．30972041／C110602)，黑龙江省自然科学基金(No．ZJN0605-02)，黑龙江省科技厅项目(

7、No．GAO7B401—1)和哈尔滨市基金(No．2010RFXXN039)资助E—mail：zhanglw@hit．edu．cn分析化学第40卷(200r／min)96h。2．3TGase活力和蛋白质浓度的测定采用比色法测定酶活力，以N—CBZ-GIn—Gly为底物，以L一谷氨酸一单羟肟酸做标准曲线。一个酶活力单位定义为：37℃时，每分钟催化N—CBZ—Gln-Gly生成1gmol单羟肟酸的酶量】。采用Bradford法测定蛋白质浓度。2．4TGase分离纯化2．4．1分离纯化流程发酵液经