实验十一-食品中黄曲霉毒素B1的检测.ppt

《实验十一-食品中黄曲霉毒素B1的检测.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验二十、食品中黄曲霉毒素B1的检测标准依据:GB/T5009.22-2003食品中黄曲霉毒素B1的测定一、实验目的与要求：1、学习酶联免疫(ELISA)方法测定粮食及食品中黄曲霉毒素B1的实验原理，掌握实验的操作要点及测定方法2、了解酶联免疫(ELISA)的工作原理，正确熟练使用酶标仪。二、实验原理：本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量。三、仪器与试剂（一）试剂盒组

2、成1、AFB1抗原包被16孔×6条形带框酶标板；2、抗体；3、酶标二抗；4、空白对照液；5、底物（1mg×4）；6、底物液A；7、底物液B；8、终止液；9、PBS一T洗液；10、一次性手套。（二）仪器1、酶标仪；2、离心机。四、实验步骤（一）样品中AFB1的提取1．大米和小麦（脂肪含量＜3.0％）：样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250m1具塞锥形瓶中。准确加人60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中，立即取12mL滤液（相当4.0g样品）于75

3、mL蒸发皿中。65℃水浴通风挥干。用2.0mL甲醇一PBS(20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。2.玉米（脂肪含量3.0～5.0％）：样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取10.0m

4、L（相当于4.0g样品）于75mL蒸发皿中,以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。3．花生（脂肪含量15.0－45.0％）：样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加人100.0mL甲醇水(55＋45）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧杯内，从中取20.0mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分

5、层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）．放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。4．植物油：用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL甲醇水(55＋45）溶液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇

6、水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。5．其它食品：可按照G85009有关章节提供的方法操作，最终提取物（相当于4.0g样品）应收集于2.0m1甲醇一PBS(20＋80)中。（二）样品测定1、将下列试剂稀释后备用PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀释（1:40）；底物液A:9mI蒸溜水稀释（1:9）；抗体:7.0mL洗液稀释（1:140）；酶标二抗:10mL洗液稀释（1:200）；阴性对照液:200μl抗体十200μl空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。2、抗体抗原

7、反应将抗体与等量样品提取液（溶液为甲醇一PBS）在玻璃试管内混合振荡后室温静置15分钟。启封酶标板，用洗液2×3分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入此抗体抗原反应液及空白对照液（3孔）和阴性对照液（3孔）,130μl／孔,37℃湿盒中孵育（或加盖以保持相对湿度），2小时后，倒掉反应液并拍干,用洗液3×3分钟洗板，拍干。3、酶标记反应加入酶标二抗，100μl／孔，37℃盒中孵育1小时后，用洗液5×3分钟洗板，拍干。4、显色反应lmg底物十2.5m1底物液A＋42μl底物液B，待底物充分溶解后加入酶标板，100μl

8、／孔，37℃15分钟后加终止液40μl／孔。5、测定酶标仪490nm测定各孔0.D值。五、数据处理及计算结果1、求出各孔的0.D校正值：0.D校正值＝O.D实测值一空白对照孔0.D值（均值）。2、求出待测样的0.D％值：0.D％＝[O.D校正值/阴性对照孔0.D校正值（均值）］×100％。3、求出待测样AFB1含量（ng／g）：在