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1、上皮细胞培养1）表皮细胞培养1.取材：取外科植皮或乎术残余皮肽小块，以幷化层薄者•为佳，早产流产儿皮狀更好，切成0.5〜1平方厘米小块。2.EDTA处理：先置入0.02%EDTA中宗温置5分钟。3.冷消化：换入0.25%胰蛋臼陋屮，置4°C过夜。4.分离:取出皮肤,用血管钳或蹑子把表皮与真皮层分开。5.温消化:取出表皮单独处理,用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37°C再消化30〜60分钟。6.用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液。7.培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，鬥接加入Eagle液和20%小牛血清，制成细胞悬液，接种
2、入碟皿屮，CO2温箱培养。2）乳腺组织培养直接培养法：（适于培养含纤维少的软组织）1.在含有少量培养液或Hanks液的容器屮，用锋利刀片将组织反复切割成碎块。2.把组织碎块连同液体注入离心管中，再补加少许培养液，用吸管吹打片刻，置试管架3〜5分钟。吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。重复2〜3次。3.末次处理结束后，向沉降管屮再补加培养液，用吸管稍吹打，使沉附物重悬。不待细胞团块下隆立即通过3〜4层无菌纱布滤入另管屮。4.调整好适宜密度，接种入培养瓶屮培养。胶原晦消化法：（适于处理含纤维多的较碾纽织）其过程与培养其它组织相同。3）胃上皮细胞培养1.取材：取鬥溃疡
3、或鬥癌乎术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。2.淸洗：用含庆大霉素（400微克/亳升）和二性霧素（2微克/毫升的Hanks）液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成大小。3.消化:在I型胶原酶和透明质酸酶中,于37C中消化80分钟。4.离心：收集细胞悬液，800转/分离心后，Hanks液漂洗两次。5.接种：末次离心后加入含有1%〜2%胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中，接种量依不同实验目的而定。4）肝细胞培养初代组织块培养:取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝脏剪成imn?左右的小块，采用帖壁培养法。初代消化法培养：1.把肝组织切成2〜4
4、立方毫米的小块，用不含钙镁的BSS液洗两次。2.移入1：1的0.1%帧蛋白晦和0.1%胶原嗨（都用无钙镁BSS配置）中，4°C冷消化10-12小时后，通过250微米和64微米尼龙网或不锈钢纱网滤过。3•收集细胞、BSS液洗1〜2次、计数、接种培养。消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法：肝脏灌流需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。1.无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS洗除血污。2.取5ml注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出,轻轻把消化液注入肝管系统，并不时轻揉压肝脏，以便消化液进入肝小叶屮；消化液在肝内停阳20〜
5、30分后，在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出。3.待吸净消化液后，注入离心管屮，低速离心分离，用RPMI1640培养基培养（较其它培养基为好），能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。传代培养：待细胞生长连接成片后，用BSS洗一二次，加1：1的0.025%唳蛋白旃和0.02%EDTA混合消化3〜5分钟，待细胞回缩，便停止消化，弃掉消化液，用BSS洗一二次，注入营养液，吹打，制成细胞盘液，再接种培养。5）内皮细胞培养1.取产后的新鲜脐带。如不立即培养可以保存于49中,但不宜超过12小时。无菌剪取长10-15）111米一段。其它如胚胎和幼体
6、动物的大血管，亦可用于培养。2.先用三通注射器吸温PBS液注入脐帶的静脉中,洗除残血，注入「I处宜用线绳结扎,以防液体返流。3.用血管钳夹紧脐带…端，从另端向脐静脉屮徐徐注入最终浓度为0.1%的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，消化3〜10分钟。4.吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中,为获取更多细胞,可再注入温PBS冲洗2〜3次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心。5.吸除上清,加1640培养液，制成细胞悬液,接种入瓶皿中培养，顺利时2〜3天内细胞即可长成单层。6）毛细血管内皮细胞培养肿瘤条件培养基制备：1-
7、取C3H小鼠的S-180实体肉瘤组织。2.胰蛋口腮消化，Dulbecco改艮Eagle氏培养液15ml（含10%小牛血清），接种到T-75Falcon产培养瓶中培养。3.在细胞生长接近完金汇合时，收集培养液制成条件培养垒：再用含10%小牛血清的新培养液丿G也毎隔两天收集一次，可获得多量条件培养基。2.4000转/分离心后,再通过0.22Um微孔滤膜滤过，-20°C冻存备用（临用前融解）。初代培养：1.取材:取新鲜牛肾上腺数个,先用Hanks液洗除血污。2.剥除被膜，分离出皮质，切成1立方亳米小块，加0.5%胶原爾室温中消化1小时，毎隔10分钟用吸管吹打悬液令
8、消化充分。3.通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通
