一种适合沙棘叶片总RNA的提取方法.pdf

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1、一种适合沙棘叶片总RNA的提取方法第1期一种适合沙棘叶片总RNA的提取方法李小婷，唐翠平，马明，袁思安，高辉(西南林业大学，云南昆明650224)摘要：针对沙棘组织中多糖、多酚、粗蛋白等次生代谢产物含量高的特点，采用RNAplantPlus总RNA提取试剂改良法，成功地提取了沙棘叶片总RNA。所提取的沙棘叶片总RNA凝胶电泳显示28s和l8s条带清晰完整，A260／A280和A260／A230比值分别为1．79和2．07，且平均得率为298．1g／g(鲜叶)。试验结果表明，RNAplantPlus总RNA提取试剂改良法具有方便快捷、提取RNA纯度高、有效排除多种次生代谢产物影响的特点，用该

2、方法提取的沙棘叶片总RNA可以用于后续的分子生物学研究中。关键词：沙棘叶片；总RNA提取；总RNA提取试剂改良法中图分类号：$793．6．08文献标识码：A文章编号：1672—4836(2014)01—0014—04沙棘(HippophaerhamnoidesL．)，又名醋1材料与方法柳、酸刺，是胡颓子科沙棘属(Hippophae)的落叶性灌木或小乔木。国内主要分布于华北、西北、1．1试验材料西南，具有极强的适应性，耐寒、耐旱、耐盐碱、供试的沙棘叶片采自陕西省定边县西南林业大耐沙埋，在沙化和荒漠化土壤的治理与修复中发挥学实习基地，为移栽后两年的实生苗嫩叶。了及其重要的生态作用，因此被广泛用

3、于水土保1．2试验试剂持、防风固沙及治理砒砂岩等方面。近年来，对试验所用主要试剂有RNAplantPlus总RNA沙棘的研究主要停留在生理生化水平，要进一步了提取试剂(TIANGEN公司)，DEPC(Sigma公司)，解其耐寒、耐旱机理应从分子方面人手，而获得高DNA酶I(Takara公司)，其他试剂均为国产分析质量的RNA是研究基因功能的重要基础之一，在纯。用于RNA提取的所有试剂及一次性塑料耗材分子生物学中占有重要的地位。均用O。l％DEPC水(V／v)处理并高压灭菌，玻璃制目前，国内关于植物组织总RNA提取方法的品及研钵等180℃烘烤8h备用。报道很多，但是有关沙棘总RNA提取报道很

4、少。1．3试验方法在现有的报道中，绝大多数常规的植物组织总RNAplantPlus总RNA提取试剂改良法在加RNA提取方法均存在有比较费时的缺点。沙棘叶入氯仿之前加入DNA酶I，以去除RNA中残留的片中又富含多糖、多酚、粗蛋白、粗脂肪、类黄酮基因组DNA，其他步骤均按说明书进行。具体步及维生素等多种次生代谢物质，加之内源RNase骤如下：提取前按1：4的体积比将8一巯基乙醇与的影响，这给提取沙棘叶片高质量的RNA增加了RNAPlusreagent混合；取不多于0．1g冷冻沙棘叶难度。本研究在RNAplantPlus总RNA提取试剂片粉末，加0．5mL提取试剂(4℃)，振荡至彻底混提取的方法

5、上进行了改良，以期在较短时间内获得匀；室温平放离心管5min；4~C12000rpm离心高质量的沙棘叶片RNA，进而为以后沙棘相关的lmin，上清液转入新的无RNase离心管；加入分子生物研究打下良好基础。0．1mL5MNaC1，温和混匀；加入DNA酶I，轻轻吹打混匀lmin；加入0．3mL氯仿，上下颠倒混收稿日期：2014—01—06作者简介：李小婷(1986一)女，汉族，硕士研究生，主要从事森林培育学研究。E—mail：helen8813570@163．eom2014年3月第12卷第1期《国际沙棘研究与开发》匀；4~C12000rpm离心10rain，取上层水相转入新染色后，凝胶成像系

6、统成像观察RNA完整性，并的无RNase离心管；重复步骤6、7一次；加与所拍照记录结果。得水相相等体积的异丙醇，混匀，室温放置1．5RNA纯度分析10min；4~C12000rpm离心10min。弃上清液，注取总RNA2gl，用无RNAase的DEPC水稀释意不要倒出沉淀。加1mL75％乙醇(沉淀可能很5O倍，加入石英比色杯中，在核酸蛋白仪上测定难看出，应小心操作)；4oc5000rpm离心3rain。A。／A。和A。／A。。。值，分析其纯度。倒出液体，注意不要倒出沉淀。剩余的少量液体2结果与分析短暂离心，然后用枪头吸出，室温晾干2-3min；加50gl无RNase水，反复吹打、混匀，充分

7、溶解2．1凝胶电泳分析RNA；室温条件下12000rpm离心1rain，取上清琼脂糖凝胶电泳检测结果(图1)表明，未用液转入干净的无RNase离心管中，-70℃保存。DNA酶I处理得到的沙棘总RNA电泳图谱(见图1．4RNA完整性分析1-a)可以看到亮度很高的28s和18s两条带，且称取0．5g的琼脂糖于三角瓶中，加入28s条带与18s条带亮度比约为2：1，但在28s上方50mL0．5~TAE电泳缓冲液，配制成1％的琼脂