靶向化布鲁氏菌树突状细胞疫苗的试制研究.pdf

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1、分类号：密级：$855．659．6靶向化布鲁氏茵树疫苗的试制研究ResearchandDevelopmentofTargetedDendriticC。ells。务ccineforBru,ellosisVnerucellosisa学位申请人：付景丽指导教师：王家鑫教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一一年五月二十九日签字日期：2占11年o6月09-Et学位论文作者毕业后去向：工作单位：．通讯地址：签字日期：加f7年D6月也日电话：摘要㈩IIIIIIIIIIIIIUIY1897299布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患

2、传染病。布鲁氏菌主要经由粘膜和伤口感染，能够引起家畜的自发性流产和人的“波浪热”。大量资料显示，布鲁氏菌的易感细胞是巨噬细胞，该细胞感染布鲁氏菌后，在其胞内大量繁殖，使其抗原提呈能力丧失，从而使宿主的免疫功能破坏而引发持续性感染。因此，如何帮助患病动物建立有效的免疫应答机制是当前研究的热点。树突状细胞(dendriticcell，DC)是迄今为止发现的体内功能最强的专职抗原提呈细胞。适应性免疫应答的启动需要DC的抗原提呈。DC不仅能刺激已活化或记忆性的T细胞，而且能显著刺激初始T细胞的增殖，它触发的是点放射状放大反应，1个DC可以激活100"-3000个T细胞

3、。因此DC是体内免疫反应的始动者，在免疫治疗中有着巨大的魅力。本实验围绕DC进行疫苗研究，并在动物试验中检验实验疫苗的免疫效果。研究表明，布鲁氏菌的外膜蛋fj(Outermembraneproteins，OMPs)有很强的免疫原性。本实验采用去污剂连续抽提法提取了布鲁氏菌的全外膜蛋白，经SDS．PAGE电泳后，选择了抗原表位和糖基化位点较多的37．5kD与47．2kD的蛋白作为疫苗抗原候选蛋白，经过分离、电洗脱纯化得到这两种布鲁氏菌OMPs。采用a．D．甘露吡喃异硫氰酸苯酯对这两种蛋白质抗原进行甘露糖修饰，以靶向体内抗原提呈功能最强的专职抗原提呈细胞一树突状细

4、胞，再经间苯二酚．硫酸法鉴定两种蛋白质抗原糖基修饰效果。采取方差分析比较布鲁氏菌外膜蛋白糖基修饰后的免疫效果，以血清中抗体水平与淋巴细胞增殖能力作为检测指标，随机选取20只小鼠，并随机分成A、B、C和D四组，分别肌注布鲁氏菌S2商品疫苗、纯化的布鲁氏菌两种混合外膜蛋白、甘露糖修饰化的布鲁氏菌外膜蛋白和PBS。试验结果表明：二免后4d、7d、lOd，A组、B组和C组间血清抗体水平差异不显著(尸>O．05)，但A组、B组、C组与D组相比差异极显著(尸<0．01)，具有统计学意义，表明布鲁氏菌S2商品疫苗、布鲁氏菌两种混合外膜蛋白、修饰化的布鲁氏菌外膜蛋白免疫小鼠后

5、，血清抗体水平均显著高于阴性对照组，明显诱导了机体的体液免疫应答。由淋巴细胞增殖试验表明：C组内的实验组OD值／对照组OD值明显高于A组、B组、D组。说明小鼠免疫甘露糖修饰化的布鲁氏菌外膜蛋白在二免lOd后，T淋巴细胞增殖能力明显高于免疫布鲁氏菌S2商品疫苗、纯化的布鲁氏菌两种混合外膜蛋白与PBS对照组。表明甘露糖修饰化的布鲁氏菌外膜蛋白在诱导机体的细胞免疫应答发挥了作用。以上实验结果证实蛋白质经糖基化修饰后有显著免疫效果。疫苗佐剂的选择直接影响着疫苗的免疫效果，为了使疫苗的效果达到最佳，选择了法国赛比克公司的四种佐剂MontanideISA71VG、ESSA

6、IISA206CEL、MontanideIMS251CVG和MontanideGel01PR，利用糖基化布鲁氏菌OMPs制作了四种不同佐剂的疫苗。由正交试验筛选布鲁氏菌外膜蛋白的配合佐剂，最佳免疫程序。结果显原使用MontanideIMS251CVG纳米颗粒佐剂，免疫剂量为甘露糖基化修饰氏菌外膜蛋白Xigg，采取肌内注射，免疫三次这种组合，无论是在抗体产生是血清IFN吖产生水平为最佳组合。全随机试验、腹腔巨噬细胞吞噬试验进一步检验靶向化布鲁氏菌树突状细胞疫效果，结果表明靶向化疫苗诱导了机体较强的免疫应答。安全性试验结果表明：布鲁氏菌外膜蛋白树突状细胞疫苗对6～

7、8周龄BALB／c健康小鼠、妊娠小鼠均研究的实验结果为基于疫苗研究策略，有效预防布鲁氏病奠定了基础。：布鲁氏菌；树突状细胞；甘露糖受体；靶向化ResearchandDevelopmentofTargetedDendriticCells场ccineforBrucellosisGraduatestudent：FuJing-liMajor：．PreventiveVeterinaryMedicineAdvisor：ProfessorWangJia-xinAblstractBrucellaisfacultativeintracellularbacteriathatcan

8、causeabortioninpreg