维生素D3、TRACP-5b及PINP在骨髓瘤骨病诊断及疗效评估中的意义

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单位代码１０４７５学号１０４７５３１７０９４９分类号Ｒ５５為大謦硕士学位论文（学术学位）ＴＲＡＣＰ－５ｂＰＮＰ维生素Ｄ３、及Ｉ在骨髓瘤骨病诊断及疗效评估中的意义学科、专业：临床医学内科学研究方向：血液病学申请学位类别：医学硕士申请人：马荣军．朱尊１民教授：＃指１导教师＾＿袁晓莉副主任医师二〇一七年五月 关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出硕士学位申请ｓ本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的．对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包一括其他人为获得任何教戈ｉ正书而使丨过的柯料。与我同工作的同、科研机构的半位或事对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作沩行为巧。，文责自学位申请人：〔学位论文作者）签名［一１＇州年ｔ月／１｜关于学位论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者．人完全了解并同意，本河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图和馆等提供学位论文（纸项又本和电子文本）以供公众检索、查闯ｃ本人授权河南大学出于宣杨、展览学校学秦发展和进行学禾交流等ａ的，可以采取影印。（涉、縮印、扫描和拷災等菝制手段保存、汇编学位论之（纸质文本和电子文本）及保密内容的｜学位论文在解密后适用本授权书）学位获得者（学位论文作者）签名：項孝Ｃ年Ｓ月／拉１学位论文指导教师签名：車年７月／；：）］ RESEARCHONTHEDIAGNOSEDANDEVALUATEDVALUEOFINFLAMMATORYFACTORSRELATEDMYELOMABONEDISEASEADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByMaRongjunSupervisor:Prof.ZhuZunminProf.YuanXiaoliMar,2017 摘要研究背景：多发性骨髓瘤(MultipleMyelomasMM)是浆细胞疾病中最常见的恶性肿瘤，年发病约率为2-3/10万，占全部恶性肿瘤的1%，占造血系统肿瘤的10%~15%。由MM导致的骨骼疼痛、高钙血症、骨质疏松、病理性骨折等一系列的溶骨性改变称为骨髓瘤骨病(myelomabonedisease，MBD）。骨髓瘤骨病是MM最常见的并发症，约70%~80%的骨髓瘤患者就诊时伴有MBD，与没有骨骼损害的患者相比，MBD患者的生活质量及预后更差，反映肿瘤负荷及疾病严重程度的指标也明显增高。MBD患者的溶骨性病变并非由MM细胞直接侵蚀骨质引起，而是由于MM细胞分泌大量的细胞因子，这些细胞因子可以激活破骨细胞或抑制成骨细胞，导致骨骼损伤。研究发现，生理剂量的维生素D3可以促进成骨细胞的增殖，而高浓度的维生素D3则是一种很强的骨吸收刺激因子，而维生素D3在MBD形成中的作用及治疗前后的变化鲜有报道。目前，MBD的诊断主要是根据患者的影像学表现及临床症状，但组织病理结果显示一些细微的骨骼损伤并不能被影像学检查发现；患者的临床表现往往也不能准确反映MBD的严重程度。血清学指标具有简单、快速、敏感的特点，那能否应用血清生化指标确诊MBD呢？活化的破骨细胞可以分泌抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistantacidphosphataseTRACP)，而骨形成的过程中可以释放I型前胶原氨基端延长肽(CollagentypeⅠaminoterminalextensionofthepeptide，PINP)，MM患者血清中的TRACP和PINP浓度是否可以反映骨生成与骨吸收的平衡状态以及是否对MBD具有诊断意义，也是我们研究的重点。目的：①探讨MM患者血清中的维生素D3、PINP及TRACP-5b与骨骼损害的关系，及其在MBD中的作用及意义；②研究维生素D3、PINP及TRACP-5b在MM治疗前后的变化及其在MBD疗效评估中的价值；并探讨TRACP-5b/PINP比值对MBD诊断的意义；材料与方法：①研究对象：自2015年4月至2016年10月在河南大学人民医院确诊为多发性骨II 髓瘤，并自愿加入此项研究的患者。共入组37名患者，男23人，女14人，中位年龄为56（43-71）岁。无骨骼疼痛者5例（13.5%），轻度疼痛者7例（18.9%），中度疼痛者17例（45.9%），重度疼痛者8例（21.6%）；影像学MBD分级0级者13例（35.1%），1级者0例，2级者6例（16.2%），3级者8例（21.6%），4级者10例（27.0%）。②方法：根据患者的临床症状及影像学表现，分为多发性骨髓瘤伴骨病组（MBD组）和不伴骨病组（无MBD组）；所有入组患者分别于治疗前、第二个疗程结束后的第10天、第四个疗程结束后的第10天抽取空腹静脉血，应用ELISA法分别检测血清中的维生素D3、TRACP-5b、PINP、β-CTX、sRANKL、OPG、MIP1-α和IL-6的浓度；同时根据患者的骨痛缓解情况、影像学表现、骨髓细胞形态学及血清学指标进行疗效评估。③疗效评估标准：MBD治疗有效的定义为IMWG疗效评价达部分缓解（PR）或以上，并且MBD影像学缓解及骨痛缓解减轻≥1级差。结果：1.MBD组患者26例，无MBD组11例，MBD组与无MBD组在性别、年龄、ISS分期及肾功能损害的比例上无统计学差异。2.维生素D3在初诊MBD组患者血清中的浓度为15.46±6.47ng/ml，在无MBD组患者血清中的浓度为7.22±4.68ng/ml，两组差异具有统计学意义（T=3.811，P=0.001）；治疗两个疗程后，MBD组患者血清中的维生素D3降至13.24±5.30ng/ml，仍高于无MBD组的8.36±5.05ng/ml，存在统计学差异（T=2.549，P=0.014）；治疗四个疗程后，MBD组患者血清中的维生素D3进一步减低，至9.19±3.93ng/ml，接近无MBD组的7.68±3.89ng/ml，两组之间无统计学差异（T=1.071，P=0.291）；但是四个疗程后MBD治疗有效组患者血清中维生素D3的含量为8.41±3.42ng/ml，而治疗无效组为12.49±4.61ng/ml，两组存在明显差异（T=-2.256，P=0.033）。3.PINP在初诊MBD组患者血清中的浓度为54.68±42.0pg/ml，在无MBD组浓度为152.58±61.71pg/ml，存在明显差异（T=-5.611，P＜0.001）；治疗两个疗程及四个疗程后，MBD组患者血清中的PINP分别为80.90±47.43g/ml和92.75±49.10pg/ml，无MBD组分别为45.47±64.67pg/ml和141.65±65.52pg/ml，两组具有统计学差异（T两疗程=-3.391，P两疗程=0.002；T四疗程=-2.502，P四疗程=0.017）；四个疗程后MBD治疗有效组患者血清中PINP含量达到了97.21±51.19pg/ml，仍低于无MBD组患者（141.65±65.52pg/ml），差异有统计学意义（T=-2.119，P=0.042）。III 4.TRACP-5b在初诊MBD组患者血清中的水平为49.02±14.37mlU/ml，无MBD组患者血清中的水平为27.11±11.75mlU/ml，具有统计学差异（T=4.458，P＜0.001）；影像学表现骨质损害为3~4级患者血清中TRACP-5b的水平（53.50±13.08mlU/ml）高于1~2级患者（40.18±11.94mlU/ml），差异具有统计学意义（T=-2.203，P=0.038）；治疗两个疗程及四个疗程后，MBD组患者血清中的TRACP-5b分别为35.17±12.13mlU/ml和31.51±10.68mlU/ml，无MBD组分别为28.49±10.12mlU/ml和25.49±7.17mlU/ml，两组差异具有统计学意义（T两疗程=1.603，P两疗程=0.118；T四疗程=1.708，P四疗程=0.097）。5.初诊时TRACP-5b/PINP≥0.50的患者，MBD的发病率接近100%，其中有95.8%的患者伴有骨骼疼痛，95.8%的患者通过影像学检查证实存在骨质损害，45.8%的患者伴有高钙血症；TRACP-5b/PINP≥0.50的患者反映破骨细胞活性的IL-6、RANKL/OPG比值、β-CTX等指标均高于TRACP-5b/PINP＜0.50的患者，且具有统计学差异（P值分别为0.003、＜0.001和0.009）；同时TRACP-5b/PINP≥0.50的患者反映疾病严重程度的HGB含量、β2-微球蛋白、骨髓中浆细胞的比例及幼稚浆细胞的比例也较TRACP-5b/PINP＜0.50组患者差，且有统计学差异（P值分别为0.003、0.034、0.006和0.002）。结论：1.初诊伴骨骼损害的骨髓瘤患者，血清中维生素D3浓度较高；维生素D3越高的患者，破骨细胞的活性越强，骨骼损伤也越严重，说明维生素D3可能增强了MBD患者破骨细胞的活性，引起骨骼损伤；2.治疗有效的MBD患者血清中维生素D3的含量减低，无效者血清中的维生素D3无明显变化，血清维生素D3的含量可以作为MBD疗效评估的指标之一；3.四个疗程后，治疗有效MBD患者血清中的PINP浓度上升，但仍低于无骨骼损害者，提示成骨细胞的活性恢复缓慢，修复骨骼损伤需要一定的时间；4.血清TRACP-5b的浓度与骨骼损害的程度正相关，可以作为评估MBD患者严重程度的血清学指标；5.TRACP-5b／PINP的比值可以作为诊断骨髓瘤骨病的指标之一。关键词：骨髓瘤骨病，血清学指标，维生素D3，TRACP-5b，PINPIV ABSTRACTObjective:(1)ToanalysetherelationshipbetweentheinflammatoryfactorsincludingVitaminD3,PIPN,andTRACP-5b)andbonedamages,andexploretheroleandmechanismofthesefactorsinmultiplemyelomabonedisease;(2)ToinvestigatethevalueofthesefactorsintheassessmentofthetherapeuticeffectbycomparingthechangesofVitaminD3,PINP,andTRACP-5bbeforeandaftertreatment,meanwhile,investigatethediagnosedvalueofTRACP-5b/PINPinthemyelomabonedisease.SubjectsandMethods:(1)Subjects:PatientswhowerediagnosedwithmultiplemyelomainHenanUniversityPeople’sHospitalfromApril2015toOctober2016andvoluntarilyjoinedthisresearch.Atotalof37patientsincluding23malesand14femaleswereenrolled,withthemedianageof56(43-71)years.Ofthem,5patientswithoutbonepain(13.5%),7casesofmildpain(18.9%),17casesofmoderatepain(45.9%),8caseswithseverepain(21.6%);accordingtoimagingMBDclassification,13casesofgrade0(35.1%),0casesofgrade1,6casesofgrade2(16.2%),8casesofgrade3(21.6%),10casesofgrade4(27%).(2)Methods:Accordingtothepatients’clinicalsymptomsandimaginingcharaceristics,wedividedthemintoMBDgroupandNon-MBDgroup;Allthepatientsweredrawnfastingvenousbloodsamplesbeforethetreatmentandonthe10thdayafterthetwocoursesoftreatmentaswellasthe10thdayafterthefourcoursesoftreatment.Afterthat,wetestedtheserumconcentrationofvitamineD3、TRACP-5b、PINP、β-CTX、sRANKL、OPG、MIP1-αandIL-6byenzyme-linkedimmunosorbentassay（ELISA）;meanwhile,theassessmentoftherapeuticeffectwasperformedbytheconditionofbonepainrelief、imaginalcharacteristics、bonemarrowmorphocytologyandserologicalindicators.(3)Thecurativeeffectevaluationstandard:theV effectivetreatmentofMBD,definedasIMWGefficacyevaluationreachespartialremission(PR)orabove,andMBDimagingremissionaccompaniedwithpainrelieftoreducemorethan1differential.Results:1.MBDgroup26caseswhileNon-MBDgroup11cases.MBDgroupandNon-MBDgroupshowednosignificantdifferenceingender,age,ISSstageanetheproportionofrenaldamages.2.TheconcentrationofVitaminD3inseruminnewlydiagnosedMBDgroupwas15.46±6.47ng/ml,whilethatinNon-MBDgroupwas7.22±4.68ng/ml(T=3.811,P=0.001);aftertwocoursesoftreatment,theserumVitaminD3inMBDgroupdecreasedto13.24±5.30ng/ml,whichstillhigherthanthoseinNon-MBDgroupat8.36±5.05ng/ml(T=2.549,P=0.014);afterfourcoursesoftreatment,serumVitaminD3inMBDgroupwerefurtherreducedto9.19±3.93ng/ml,closetotheNon-MBDgroupat7.68±3.89ng/ml,buttherewerenosignificantdifferences(T=1.071,P=0.291);inaddition,theserumVitaminD3inthevalidgroupwas8.41±3.42ng/mlwhilstthatintheinvalidwas12.49±3.42ng/mlafterfourcourses(T=2.256,P=0.033).3.TheconcentrationofPINPinnewlydiagnosedMBDgroupwas54.68±42.0pg/ml,whilethatinNon-MBDgroupwas152.58±61.71pg/ml(T=5.611,P<0.001);aftertwocoursesandfourcoursesoftreatment,theserumPINPinMBDgroupwas80.90±47.43pg/mland92.75±49.10pg/ml,respectively,whilethoseinNon-MBDgroupat45.47±64.67pg/mland141.65±65.52pg/ml(T2=-3.391,P2=0.002;T4=-2.502,P4=0.017);inaddition,theserumPINPinthevalidgroupwas97.21±51.19pg/mlwhichloweredthanthatinnon-MBDgroupat141.65±65.52pg/mlafterfourcourses(T=2.119,P=0.042).4.TheconcentrationofTRACP-5binnewlydiagnosedMBDgroupwas49.02±14.37mIU/ml,whilethatinNon-MBDgroupwas27.11±11.75mIU/ml(T=4.458,P<0.001);theconcentrationofTRACP-5binthepatientswithGrade3-4bonedamagesshowedinimagingfindingsthanthatinthepatientswithGrade1-2bonedamages(53.50±13.08mIU/mlvs.40.18±11.94mIU/ml);aftertwocoursesandfourcoursesofVI treatment,theserumTRACP-5binMBDgroupdecreasedto35.17±12.13mIU/mland31.51±10.68mIU/ml,whilethoseinNon-MBDgroupwere28.49±10.12ng/mland25.49±7.17mIU/ml,respectively(T2=1.603,P2=0.118;T4=1.708,P4=0.097).5.TheincidenceofnewlydiagnosedpatientswithTRACP-5b/PINP>=0.50inMBDgroupwascloseto100%,Ofwhich,95.8%patientspresentedwithbonepainand(or)bonedamagesdetectedbyradiographicevidence,45.8%patientswithhypercalcemia;theindexesthatreflecttheactivityofosteoclast,suchasIL-6,RANKL/OPG,beta-CTXinpatientswithTRACP-5b/PINP>=0.50arehigherthanthoseinpatientswithTRACP-5b/PINP<0.50(P=0.003,<0.001,=0.009,respectively);meanwhile,theindexesthatreflecttheseverityofdiseaseincludingHGB,beta2-MG,thepercentageofbonemarrowplasmacellsandimmatureplasmacellsinpatientswithTRACP-5b/PINP>=0.50arehigherthanthoseinpatientswithTRACP-5b/PINP<0.50(P=0.003,=0.006,=0.002,respectively)Conclusion:1.TheconcentrationofserumVitaminD3ofnewlydiagnosedmultiplemyelomapatientswithbonedamageishigher;thebonedamageissevererwhentheactivityofosteoblastisstrongerwithhigherconcentrationofserumVitaminD3,whichindicatingthatVitaminD3canenhancetheactivityofosteoblasts,causingskeletalinjury.2.TheconcentrationofserumVitaminD3ofMBDgroupdidnotoccurobviouschangementwhilevalidgroupdecreased,inthatitcanbeusedasanindexinassessmentofresponse.3.TheconcentrationofserumPINPincreasedinthevalidgroup,butstilllowerthanthatwithoutbonedamages,suggestingthattheactivityofosteoblastrecoveredslowly,andittakesmoretimetorepairbonedamage;VII 4.TheconcentrationofserumTRACP-5bispositivecorrelationwiththedegreeofbonedamages,anditcanbeusedtoassesstheseverityofmultiplemyeloma.5.TheratioofTRACP-5b/PINPcouldbeusedasoneofeffectiveindexinthediagnosisofmyelomabonedisease.Keywords:myelomabonedisease,serologicalindicators,vitaminD3,TRACP-5b,PINPVIII 目录摘要...................................................................................................................................................IAbstract.................................................................V目录....................................................................IX缩写词表.................................................................X前言.....................................................................11.资料及方法............................................................31.1研究对象..........................................................31.2治疗方案及疗效评估.................................................61.3实验材料..........................................................81.4实验步骤..........................................................91.5统计学处理.......................................................112.结果...................................................................................................................................132.1基本情况.........................................................132.2治疗前MBD组与无MBD组数据的比较....................................152.3维生素D3在MBD患者中治疗前后的变化.................................162.4PINP治疗前后的变化................................................192.5TRACP-5b治疗前后的变化............................................212.6TRACP-5b/PINP在MBD中的诊断价值.....................................233.讨论.................................................................273.1多发性骨髓瘤骨病的发病机制.........................................273.2维生素D3在骨髓瘤骨病中的作用及意...................................293.3骨代谢指标在骨髓瘤骨病诊断中的意义及价值.............................303.4TRACP-5b/PINP对MBD的诊断价值......................................314.结论.................................................................33参考文献................................................................34附录....................................................................37文献综述................................................................39在校期间发表的论文目录..................................................54致谢....................................................................55IX 缩略词表英文缩写英文全称中文翻译MMMultipleMyelomas多发性骨髓瘤MBDMyelomabonedisease骨髓瘤骨病PINPCollagentypeⅠaminoterminalⅠ型胶原氨基端延长肽extensionofthepeptideTRACPtartrateresistantacidphosphatase抗酒石酸酸性磷酸酶β-CTXBetaCrosslapsβ-骨胶原交联OPGOsteoprotegerin骨保护素NF-κBNuclearfactorkappaB核因子κBRANKLNuclearfactorκBreceptoractivation核因子κB受体活化因子配基factorligandsRANKNuclearfactorkappaBfactorreceptor核因子κB受体化因子MIP-1αMacrophageinflammatoryprotein-1α巨噬细胞炎性蛋白1αIL-6Interleukin-6白介素-6OAFsOsteoclast-activatingfactors破骨细胞激活因子OBOsteoblast成骨细胞OCOsteoclast破骨细胞BMSCBonestromalcells骨基质细胞MMP-9Matrixmetalloproteinase-9基质金属蛋白酶-9MGUSMonoclonalGammopathyOf意义未明的单克隆免疫球蛋白UndeterminedSignificance增多症M-CSFMacrophagecolony-stimulatingfactor巨噬细胞集落刺激因子TNFTumornecrosisfactor肿瘤坏死因子TRAF6TNFreceptorassociatedfactor6肿瘤坏死因子受体相关因子6RANTESRegulatedonactivationnormalT-cell调节激活正常T细胞表达的分expressedandsecreted泌因子PTHrPParathyroidHormoneRelatedProtein甲状旁腺激素相关蛋白X 前言多发性骨髓瘤(MultipleMyelomasMM)是浆细胞疾病中最常见的恶性肿瘤，其主要特征是恶性浆细胞在骨髓中无节制地增殖、广泛地浸润并分泌大量的单克隆免疫球蛋白，同时抑制了正常浆细胞的增殖和多克隆免疫球蛋白的分泌。常见的临床症状包括：感染、发热、贫血、骨骼疼痛、骨质损害、肾功能不全、高钙血症、高粘滞性综合征等。[1]MM并不是一种非常少见的疾病，美国的发表率约为4.5/10万人口，我国尚没有确切的流行病学资料，但部分报道显示每年的发病约率为2-3/10万，占全部恶性肿瘤的1%，[1-3]占造血系统肿瘤的10%~15%。患者以中老年人为主，50~65岁多见，40岁以下少见，[2]我国的中位发病年龄为57岁，且发病率随年龄增长而增长，男女比例约为2.35：1。骨髓瘤骨病(MyelomaBoneDisease，MBD)是指由多发性骨髓瘤导致的骨骼疼痛、高钙血症、骨质疏松、病理性骨折等一系列的溶骨性改变，是MM常见的临床表现。其中骨痛最为常见，发生于70%以上的首诊病例，且随着疾病的进展而加重；约2/3的患者[4-7]就诊时就已经出现了溶骨性改变，甚至有40%的患者发生了病理性骨折；骨质损害常发生的部位有脊柱、胸肋骨、腰椎、骶髂关节等，而颅骨及四肢长骨相对少见。与没有骨骼破坏的患者相比，MBD患者的生活质量及预后更差，反映肿瘤负荷及疾病严重程度[8]的指标也明显增高。早期明确MM患者是否伴骨质破坏，对于MBD的治疗及预后判断都具有重要意义。目前，MBD的诊断主要是根据患者的影像学表现及临床症状，但组织病理结果显示一些细微的骨骼损伤并不能被影像学检查发现；由于患者个体感受的差异，其临床表现往往不能准确反映MBD的严重程度。血清学指标具有简单、快速、敏感的特点，能否寻找一种血清生化指标帮助临床医师诊断MBD，一直是探讨的热点。研究发现，MBD患者的溶骨性病变并非由MM细胞直接侵蚀骨质引起，而是由于MM细胞分泌大量的细胞因子，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）等，这些细胞因子被称为破骨细胞激活因子（Osteoclast-activatingfactors，OAFs），OAFs可激活骨保护素-细胞核因子kappaB受体活化因子配体-细胞核因子kappaB受体活化因子通路（OPG/RANKL/RANK系统），OPG/RANKL/RANK系统是破骨细胞增殖、分[9]化、成熟的主要信号通路；MM细胞还可以分泌DKK-1(Dickkopf-1)蛋白，抑制Wnt信1 [37]号通路，导致成骨细胞的活性减低。破骨细胞的活性增强，成骨细胞的活性减弱，打破了骨生成和骨吸收的平衡状态，引起骨质损伤。活化的破骨细胞可以分泌抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistantacidphosphataseTRACP)、组织蛋白酶K（cathepsinK)和基质金属蛋白酶-9(Matrix[1]metalloproteinase-9，MMP-9)。TRACP存在两种亚型：抗酒石酸酸性磷酸酶5a同工酶(TRACP-5a)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b同工酶(TRACP-5b)，其中TRACP-5b主要由OB[10]细胞分泌，其血清中的水平可直接反映OB细胞活性和骨吸收状态。CathepsinK和MMP-9可以降解骨基质中的有机质，而I型胶原蛋白是骨有机质的主要成分，其被降解时释放β-骨胶原交联(BetaCrosslaps，β-CTX，也称作I型胶原C端肽交联)。血清β-CTX的含量与Ⅰ型胶原蛋白降解的速率存在明显的相关性，即骨吸收增加时I型胶原降解加速，血清β-CTX的含量也随之增加，固β-CTX也是目前国内外公认的能代表骨吸[11]收速率的生化指标。I型前胶原氨基端延长肽(CollagentypeⅠaminoterminalextensionofthepeptide，PINP)是目前评估成骨细胞活性的重要指标，活化的成骨细胞胞内可以合成I型胶原蛋白前胶原，I型胶原蛋白前胶原由特异性蛋白酶切割为I型前胶原氨基端延长肽(PINP)、I型胶原蛋白和I型前胶原羧基端延长肽(PICP)。PINP与I型胶原蛋白比例为1：1，固[12-13]PINP可反映OB细胞活性及骨形成速率。1α,25-(OH)2D3可促进肠道对钙、磷离子的吸收，减少肾脏的排出，从而增加血液[14]中钙、磷离子的浓度，对OB细胞及OC细胞均有调节作用。生理剂量的1α,25-(OH)2D3[15]可活化相关转录因子，促进成骨细胞的增殖和骨基质形成；而高浓度1α,25-(OH)2D3[14-15]则是一种很强的骨吸收刺激因子，浓度越高，诱导OC细胞分化成熟的能力就越强。多数报道显示，维生素D3参与了女性绝经后骨质疏松症的形成，考虑与其促进OC细胞的活化有关，但其在多发性骨髓瘤骨质损伤中的作用，目前鲜有报道。为探索具有MBD诊断价值的生化指标，研究1α,25-(OH)2D3在骨髓瘤骨病中的作用及意义，我们设计了“维生素D3、TRACP-5b及PINP在骨髓瘤骨病诊断及疗效评估中的意义”的课题研究，入组分析河南大学人民医院自2015年4月至2016年10月确诊的37例MM患者，测定其治疗前后血清中IL-6、OPG、sRANK、MIP-1α、β-CTX、TRACP-5b、PINP、BNDF、维生素D3等多种细胞因子的变化，并结合患者的临床表现、影像学表现及实验室检查，分析这些因子在骨髓瘤骨骼损害中的作用及诊断MBD的价值。2 1.资料与方法1.1研究对象自2015年4月1日至2016年10月30日在河南大学人民医院确诊为多发性骨髓瘤，并自愿加入此项课题的患者。本研究共入组37名患者，男23人，女14人，中位年龄为56（43-70）岁。根据患者的临床症状及影像学表现，分为骨髓瘤伴骨病组（MBD组）和不伴骨病组（无MBD组）；所有入组患者分别于治疗前、第二个疗程结束后的第10天、第四个疗程结束后的第10天抽取空腹静脉血，同时根据患者的骨痛缓解情况、影像学表现、骨髓细胞形态学及血清学指标进行疗效评估。同期，从河南大学人民医院体检中心抽取同龄健康人12名，作为健康对照组，其中男6人，女6人，中位年龄为56（51-68）岁。所有的健康对照组已排除近期发生过骨折及存在自身免疫性疾病、肿瘤、HBV、HIV等病史，并且在采血前两周内无严重的病毒或细菌感染。所有入组人员在采血前四周内均未应用过糖皮质激素、双磷酸盐及免疫抑制剂，四周内无接种疫苗病史。1.1.1入组标准同时满足以下条件①符合MM的诊断标准；②首次确诊为MM；③年龄≤70岁；④自愿并同意加入此课题研究。1.1.2排除标准出现以下任意一种情况者，应于排除：①不能接受标准化治疗的患者；②确诊之前接受过糖皮质激素或双磷酸盐治疗的患者；③伴严重的心肺功能不全或Ⅳ级高血压病的患者；④伴有第二肿瘤的患者。3 1.1.3多发性骨髓瘤诊断及ISS分期标准多发性骨髓里可以分为有症状骨髓瘤、无症状（冒烟型）骨髓瘤、不分泌型骨髓瘤和骨髓瘤白血病（PCL），诊断标准见表1-1.[2]表1-1多发性骨髓瘤及其变异性诊断标准类型诊断标准有症状骨髓瘤⑴骨髓克隆性浆细胞比例≥10%和（或）组织活检证实有浆细胞瘤⑵血清和（或）尿出现单克隆M蛋白*⑶骨髓瘤相应靶器官损害（至少一项）：校正血清钙＞2.65mmol/L，CREA＞177umol/L，贫血（男HGB＜100g/L，女HGB＜90g/L）；骨骼损害（溶骨性破坏、严重的骨质疏松或病理性骨折）无症状骨髓瘤⑴血清单克隆M蛋白≥30g/L，和（或）⑵⑵骨髓中单克隆浆细胞比例≥10%⑶无骨髓瘤相关的靶器官或组织损害不分泌型骨髓瘤⑴骨髓克隆性浆细胞比例≥10%和（或）组织活检证实有浆细胞瘤⑵血清和尿免疫固定电泳M蛋白阴性⑶存在骨髓瘤相关的靶器官损害PCL⑴符合MM的诊断条件9⑵外周血克隆性浆细胞≥20%，或绝对计数≥2×10/L*校正血清钙（mmol/L）=血清钙测定值（mmol/L）+[4-HGB（g/L）×0.02][2]表1-2国际分期ISS标准分期标准I期β2微球蛋白＜3.5mg/L，白蛋白≥35g/LII期介于I期和II期之间III期β2微球蛋白≥5.5mg/L4 1.1.4骨髓瘤骨病（MBD）诊断标准[18]满足一下条件的任意一项，即可诊断为MBD：①影像学发现一处及以上骨髓瘤所致的骨骼损害或严重的骨质疏松；②患者伴有中度及以上的骨骼疼痛（WHO疼痛分级2级及以上）；③校正后的血清钙＞2.65mmol/L。1.1.5影像学检查MBD分级标准及WHO疼痛分级标准⑴影像学检查MBD分级标准[19]表1-3影像学检查MBD分级标准MBD分级影像学表现0级无骨质疏松及溶骨性损害1级严重的弥漫性骨质疏松2级一个解剖学部位的一个或多个溶骨性损害3级多个解剖学部位的多个溶骨性损害4级病例性骨折⑵WHO疼痛分级标准表1-4WHO疼痛分级标准骨痛分级临床表现0级无骨痛1级轻度疼痛，可以耐受，无需用药2级中度疼痛，时而因疼痛影响睡眠，需用镇痛药3级重度疼痛，严重影响睡眠，需用麻醉药止痛1.1.5剔除病例标准入组后出现以下任意一种情况者，给予剔除：①入组后未能按时、按量接受治疗者；②依从性差，不能按时完成观察指标者；③临床治疗中发生了严重偏差，如治疗中途私自加入不明药物者。5 1.1.6脱落病例标准出现以下任意一种情况者，属于脱落病例：①未明原因的失访；②治疗中途转院；③治疗中合并严重的感染，需要中止治疗或变更治疗方案；④因各种原因拒绝继续治疗。1.1.7临床资料收集收集所有患者治疗前的血常规、肝肾功能、电解质、β2微球蛋白、免疫固定电泳、影像学检查、骨髓细胞形态学、流式免疫分型、预后基因等检查结果；收集所有患者治疗两个疗程及治疗四个疗程后的血常规、肝肾功能、电解质、β2微球蛋白、免疫固定电泳、影像学检查、骨髓细胞形态学、微小残留（MRD）等；1.2治疗方案及疗效评价1.2.1治疗方案表1-5治疗方案药物剂量用法2硼替佐米1.3mg/md1,d4,d8,d11,皮下注射，21天为一个疗程；2环磷酰胺600mg/md1,d11,静脉注射，21天为一个疗程；地塞米松20mg/dd1-2,d4-5,d8-9,d11-12,静脉注射，21天为一个疗程；唑来膦酸4mg/次静脉注射，每月1次注：根据具体情况，可酌情给予保肝、护胃、抗感染等对症支持治疗。1.2.2疗效评价表1-6MBD影像学缓解标准缓解情况评价标准显效影像学表现减轻≥2级差有效影像学表现减轻≥1级差无效影像学表现不变或加重6 表1-7MBD骨痛缓解标准缓解情况评价标准显效疼痛程度减轻≥2级差有效疼痛程度减轻≥1级差无效疼痛程度不变或加重[1]表1-8国际骨髓瘤工作组（IMWG）国际同意疗效标准疗效分级评价标准Scr(严格完全缓解）符合CR的前提下，再加上正常血清游离轻链比和免疫组化或免疫荧光证实骨髓内没有克隆性浆细胞CR（完全缓解）①血、尿免疫固定电泳阴性②骨髓浆细胞≤5%且任何组织无浆细胞瘤的表现VGPR（非常好的部分缓解）免疫固定电泳阳性，但血清M蛋白量下降≥90%以上及尿M蛋白水平≤0.1g/24hPR（部分缓解）①血清M蛋白量下降≥90%及尿M蛋白水平≤0.2g/24h②如果血尿M蛋白不可测定，要求血清单克隆游离轻链与非单克隆游离轻链之间的差值缩小≥50%③如果血尿M蛋白和血清游离轻链都不可测定，而骨髓浆细胞比例≥30%，侧要求骨髓内浆细胞数目减少≥50%④如果存在浆细胞瘤，要求浆细胞瘤大小缩小≥50%SD（疾病稳定）不符合CR、VGPR、PR和SD标准者PD（疾病进展）符合下面任何一项或几项：①血清M蛋白增加≥25%或绝对值增加≥0.5g/dl②尿M蛋白增加≥25%或绝对值增加≥200mg/24h③骨髓浆细胞百分比/绝对值增加≥10%④明确出现新的骨病或软组织浆细胞瘤或现有的骨病和软组织细胞瘤明显增加⑤出现由浆细胞增殖造成的高钙血症MBD治疗有效的定义为IMWG疗效评价达部分缓解（PR）或以上，并且MBD影像学缓7 解及骨痛缓解减轻≥1级差。1.3实验材料实验过程中所用到的主要试剂及仪器设备见表1-9：表1-9主要试剂、仪器及购买公司主要试剂、仪器生产厂家或购买公司血清促凝管-红头湖南浏阳医疗仪器厂10ml无菌离心管山东博科生物产业有限公司50ml无菌离心管山东博科生物产业有限公司1000ul冻存管上海川翔生物科技有限公司离心机加拿大HERO公司EA-625消毒锅台湾EASTERN公司-80℃冰箱美国FORMA公司-20℃冰箱日本三洋公司4℃冰箱青岛海尔公司微量移液器（0.1—10.0ul）上海大龙公司微量移液器（1—200ul）上海大龙公司微量移液器（1—1000ul）上海大龙公司酶标分析仪北京普朗新技术有限公司人IL-6ELISA试剂盒欣博盛生物科技有限公司（北京）人sRANKELISA试剂盒欣博盛生物科技有限公司（北京）人MIP1-αELISA试剂盒欣博盛生物科技有限公司（北京）人BNDFELISA试剂盒杭州联科生物技术股份有限公司人OPGELISA试剂盒杭州联科生物技术股份有限公司人β-CTXELISA试剂盒伊莱瑞特生物科技有限公司人PINPELISA试剂盒伊莱瑞特生物科技有限公司人TRACP-5bELISA试剂盒武汉华美生物工程有限公司CUSABIO®8 1.4实验步骤1.4.1标本采集所有入组患者分别于治疗前、治疗两个疗程后的第10天、治疗四个疗程后的第10天清晨6:00-8:00点间抽取空腹静脉血（技术路线图见图2-1）。健康对照组每两个月抽取一次空腹静脉血标本，共3次。常规消毒采血部位，持一次性采血针抽取4ml静脉血于促凝管（红头管）内。轻轻颠倒2次后置于试管架上，备用。图1-1技术路线图1.4.2标本处理标本采集以后，首先放试管架上静止30-60分钟，然后在低速离心机上800g离心20分钟，吸取上层血清，分装到8只冻存管内，每只100ul，置-20℃冰箱待检，30天9 内完成检测，剩余的血清标本置于-80℃冰箱内备用。1.4.3检测方法及步骤维生素D3、TRACP-5b、PINP、β-CTX、BNDF、sRANKL、OPG、MIP1-α和IL-6均采用了ELISA试剂盒检测，现以TRACP-5bELISA试剂盒的检测步骤为例：①实验开始前，提前20分钟从冰箱内取出样本及试剂盒，平衡至室温（25℃）。②配置标准品：将标准配于离心机中10000Χg离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，上下颠倒数次，静置10分钟，待其充分溶解后（此时标准品的浓度为20mlU/ml），轻轻混匀，然后在1.5ml离心管中进行倍比稀释。③倍比稀释标准品：用记号笔把标准品标为S7，另取7只1.5ml离心管，依次标为S0-S6，分别往每个离心管中（S0-S6）加入500ul标准品&样品稀释液。从S7中取出500ul标准品（浓度为20mlU/ml），加入S6中，反复吹打数次，使其充分混匀；再从S6中取出500ul稀释液（浓度为10mlU/ml），加入S5中，反复吹打数次，使其充分混匀；依此类推加至S1，从S1中取出500ul稀释液（浓度为0.312mlU/ml）弃掉，S0不再进行任何处理，作为空白对照组。最后，S7-S0的浓度依次为20mlU/ml、10mlU/ml、5mlU/ml、2.5mlU/ml、1.25mlU/ml、0.625mlU/ml、0.312mlU/ml、0mlU/ml。图1-2倍比稀释流程图④加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，标准品及待测样本均设三个复孔。为避免产生气泡，加样时将样品加于酶标板底部，轻轻晃动混匀。后给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。⑤配置生物素化抗体工作液：使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成生物素化抗体工作液。10 ⑥洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，拍干，每孔加250ul洗涤液，静止90秒后弃去，拍干，如此重复5次。⑦加入生物素化抗体工作液：每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。⑧配置酶结合物工作液：使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成酶结合物工作液。⑨洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，拍干，每孔加250ul洗涤液，静置90秒后弃去，拍干，如此重复5次。⑩加入酶结合物工作液：每孔加酶结合物工作液100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。⑪洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，拍干，每孔加250ul洗涤液，静置90秒后弃去，拍干，如此重复5次。⑫加TMN：每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟。⑬打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。⑭每孔加终止液50μL，终止反应。⑮用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值），取三个复孔的平均值作为最终检测的OD值。⑯用每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。1.5统计学处理所有资料建立数据库，应用SPSS17.0软件进行统计学分析。符合正态分布的两组间比较采用t检验，非正态分布采用秩和检验；两组间率的比较采用卡方检验或Fisher确切概率检验；临床有效率采用Ridit分析，全部统计方法均采用双侧检验，P<0.05为有统计学差异。11 12 2.结果2.1基本情况2.1.1入组患者的基本情况自2015年4月至2016年10月在河南大学人民医院共确诊多发性骨髓瘤43例，入组37例（1例确诊后回当地治疗；4例患者选择VAD方案治疗；1例因体质较差，选择姑息治疗），男23人，女14人，中位年龄为56（43-70）岁。其中IgG型18例（48.6%），IgA型8例（21.6%），IgD型3例（5.4%），清链型8例（21.6%），不分泌型1例（2.7%），见图2-1。ISS分期I期的患者13例，占35.1%；II期的患者9例，占24.3%；III期患者15例，占40.5%，见图2-2。图2-1骨髓瘤分型构成比图2-2骨髓瘤ISS分期构成比2.1.2MBD分级37例入组患者中影像学表现无骨骼损伤（MBD分级0级）者13例（35.1%），影像学MBD分级1级者0例，2级者6例（16.2%），3级者8例（21.6%），4级者10例（27.0%），见图2-3。无骨骼疼痛者5例（13.5%），轻度疼痛者7例（18.9%），中度疼痛者17例（45.9%），重度疼痛者8例（21.6%），见图2-4。共确诊伴有MBD患者2613 例，无MBD患者11例。图2-3影像学MBD分级构成比图2-4骨骼疼痛分级构成比2.1.3影像学表现骨骼损害的常见部位骨骼损害常发生的部位包括头颅（3例）、胸肋骨（13例）、脊柱（17例）、骨盆（8例）、四肢长骨（2例）等，见图2-5。图2-5骨骼损害常发生的部位及病例数14 2.2治疗前MBD组与无MBD组数据的比较2.2.1MBD组与无MBD组基线的比较自2015年4月1日至2016年10月30日共入组37例，男23例，女14例，中位年龄为56（43-70）岁，伴MBD组26例，无MBD组11例。MBD组患者与无MBD组者在性别、年龄、ISS分期及肾功能损害的比例上无统计学差异，基线数据的比较见表2-1。表2-1MBD组与无MBD组临床数据的比较分析分组伴MBD组无MBD组检验值P值N（例）2611性别（男/女）16/107/40.0140.904年龄（岁）57（43~71）53（45~68）0.6380.495ISS分期I期8（30.8）5（45.5）0.7310.392II期7（26.9）2（18.2）0.3210.571III期11（42.3）4（36.4）0.1130.736肌酐≥177umol/L8（30.8）2（18.2）0.8480.3572.2.2MBD组与无MBD组临床数据的比较MBD组患者的HGB为82.8±18.8g/L，无MBD组的HGB为101.8±26.0g/L，两组的差异有统计学意义；MBD组患者血清中乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶的水平分别为266.81±173.90u/L和82.04±24.64u/L，无MBD组分别为278.64±169.89u/L和76.73±25.74u/L，两组无统计学差异；MBD组患者的白蛋白/球蛋白为0.85±0.72，虽然低于无MBD组的1.15±0.96，但无统计学意义（见2-2）。15 表2-2MBD组与无MBD组临床数据的比较分组MBD组无MBD组TP值*HGB（g/L）82.8±18.8101.8±26.0-2.4980.017LDH（u/L）266.81±173.90278.64±169.89-0.1900.850APL（u/L）82.04±24.6476.73±25.740.5920.558白蛋白/球蛋白0.87±0.711.15±0.96-0.9900.329注：*FHGB=3.574，THGB=-2.498,PHGB=0.017，即伴骨骼损害MM患者的血红蛋白浓度低于无骨骼损害者。2.2.3MBD组与无MBD组预后基因的比较MBD组患者P53缺失、RB1缺失、D13S319缺失的发生率分别为15.4%、69.2%、76.9%，无MBD组分别为9.1%、72.7%、63.6%，两组数据无统计学差异；1q21扩增和IGH重排的发生率在MBD组分别为53.8%和50.0%，无MBD组分别为72.7%和54.5%，两组差异无统计学意义，见表2-3。表2-3MBD组与无MBD组临床数据的比较2分组MBD组无MBD组XP值P53缺失[例（%）]4(15.4)1(9.1)0.2620.609RB1缺失[例（%）]18(69.2)8(72.7)0.0450.832D13S319缺失[例（%）]20(76.9)7(63.6)0.6920.4061q21扩增[例（%）]14(53.8)8(72.7)1.1430.285IGH重排[例（%）]13(50.0)6(54.5)0.0640.0802.3维生素D3在MBD患者中治疗前后的变化2.3.1治疗前MBD组与无MBD组血清中维生素D3的比较在MBD患者中，血清维生素D3的含量高达15.46±6.47ng/ml，无MBD组的含量为7.22±4.68ng/ml，两组比较具有统计学差异，见表2-4。16 表2-4MBD组与无MBD患者的实验室数据分析分组病例（例）维生素D3（ng/ml）tP值MBD组2615.46±6.473.8110.001无MBD组117.22±4.68注：F=1.389，t=3.811，P=0.001，即伴有骨骼损害的MM患者血清中维生素D3含量高于无骨骼损害者。2.3.2两个疗程后MBD组患者与无MBD组患者血清中维生素D3的比较治疗两个疗程以后，MBD组患者血清维生素D3的浓度为13.24±5.30ng/ml，无MBD组的浓度为8.36±5.05ng/ml，两组比较具有统计学差异，见表2-5。表2-5治疗两个疗程后MBD组患者与无MBD组患者血清中维生素D3的比较分组病例（例）维生素D3（ng/ml）tP值MBD组2613.24±5.302.5490.014无MBD组118.36±5.05注：F=0.008，t=2.549，P=0.014，即治疗两个疗程后伴有骨骼损害的患者血清中的维生素D3含量高于无骨骼损害的患者。2.3.3四个疗程后MBD组患者与无MBD患者组血清中维生素D3的比较治疗四个疗程以后，MBD组患者血清维生素D3的浓度为9.19±3.93ng/ml，无MBD组的浓度为7.68±3.89ng/ml，两组比较无统计学差异，见表2-6和图2-6。表2-6治疗四个疗程后MBD组患者与无MBD组患者血清中维生素D3的比较分组病例（例）维生素D3（ng/ml）tP值MBD组269.19±3.931.0710.291无MBD组117.68±3.89注：F=0.082，t=1.071，P=0.291，即治疗四个疗程后伴有骨骼损害的患者血清中的维生素D3含量与无骨骼损害者相同。17 图2-6治疗前后血清维生素D3的变化（ng/ml）2.3.4MBD组患者治疗前与治疗四个疗程后血清维生素D3含量的比较MBD组患者治疗前血清中维生素D3的含量为15.46±6.47ng/ml，治疗四个疗程以后血清中的浓度为9.19±3.93ng/ml，两组具有统计学差异，表2-7。表2-7MBD组患者治疗前与治疗四个疗程后血清中维生素D3含量的比较分组病例（例）维生素D3（ng/ml）tP值治疗前2615.46±6.47ng/ml4.226＜0.001四个疗程后269.19±3.93ng/ml注：T=4.226，P＜0.001，MBD组患者，即治疗四个疗程后患者血清中的维生素D3含量减低。2.3.5MBD患者治疗有效组与无效组血清中维生素D3含量的比较四个疗程以后，MBD治疗有效组患者血清中的维生素D3含量降至8.41±3.42ng/ml，无效组含量为12.49±4.61ng/ml，两组差异具有统计学差异，见表2-8。18 表2-8MBD治疗有效组与无效组血清中维生素D3含量的比较分组病例（例）维生素D3（ng/ml）tP值有效组218.41±3.42-2.2560.033无效组512.49±4.61注：F=0.570，t=-2.256，P=0.033，即MBD治疗有效的患者血清维生素D3的含量减低。2.3.6随访期内MBD组与无MBD组维生素D3曲线下面积的比较随访期内MBD组患者血清维生素D3的曲线下面积为536.86±179.91，无MBD组的曲线下面积为332.02±187.54，两者差异具有统计学意义，见表2-9。表2-9随访期内MBD组患者与无MBD组患者血清中维生素D3曲线下面积的比较分组病例（例）维生素D3曲线下面积tP值MBD组26536.86±179.913.1270.004无MBD组11332.02±187.54注：①F=0.075，t=3.127，P=0.004，即伴有骨骼损害的患者其血清维生素D3的曲线下面积大于没有骨骼损害者。②维生素D3曲线下面积=（治疗前浓度+治疗两个疗程后浓度）*21天/2+（治疗两个疗程后浓度+治疗四个疗程后浓度）*21天/2。2.4PINP治疗前后的变化2.4.1治疗前MBD组与无MBD组血清PINP含量的比较在MBD患者中，血清PINP的浓度为15.46±6.47ng/ml，无MBD组的浓度为7.22±4.68ng/ml，两组比较具有统计学差异，见表2-10。表2-10MBD组与无MBD患者的实验室数据分析分组病例（例）PINP（pg/ml）tP值MBD组2654.68±42.09-5.611＜0.001无MBD组11152.58±61.71注：F=3.321，T=-5.611，P＜0.001，即MBD患者血清中PINP含量低于无骨骼损害者。19 2.4.2PINP在治疗2个疗程后及治疗4个疗程后的变化①治疗两个疗程后，MBD组患者血清中PINP的浓度为80.90±47.43g/ml，低于无MBD组的145.47±64.67pg/ml，具有统计学差异（F=1.164，T=-3.391，P=0.002）；②治疗四个疗程后，MBD组患者血清中PINP的浓度为92.75±49.10pg/ml，仍低于无MBD组的141.65±65.52pg/ml，有统计学差异（F=0.980，T=-2.502，P=0.017）；③四个疗程后，MBD组患者血清中的PINP为92.75±49.10pg/ml，较治疗前的52.58±61.71pg/ml有所升高，且有统计学差异（F=0.262，T=-3.002，P=0.004），见图2-7。图2-7治疗前后血PINP的变化（pg/ml）2.4.3MBD治疗有效组患者与无MBD组患者PINP的比较四个疗程以后，MBD治疗有效组患者血清中的PINP含量升至97.21±51.19pg/ml，无MBD组患者含量为141.65±65.52pg/ml，有统计学差异，见表2-11。表2-11MBD治疗有效组患者与无MBD组患者PINP的比较分组病例（例）PINP（pg/ml）tP值有效组2697.21±51.19-2.1190.042无MBD组11141.65±65.52注：F=0.668，t=-2.119，P=0.042，四个疗程后治疗有效的MBD患者血清中PINP的含量仍低于无MBD患者。20 2.5TRACP-5b治疗前后的变化2.5.1治疗前MBD组与无MBD组血清TRACP-5b的比较治疗前MBD组患者血清中TRACP-5b的浓度为49.02±14.37mlU/ml，无MBD组为27.11±11.75mlU/ml，两组差异具有统计学意义，见2-12。表2-12MBD组与无MBD患者的实验室数据分析分组病例（例）TRACP-5b（mlU/ml）tP值MBD组2649.02±14.374.458＜0.001无MBD组1127.11±11.75注：F=0.018，T=4.458，P＜0.001，即伴有骨骼损害的MM患者TRACP-5b的水平高于无骨骼损害者。2.5.2影像学MBD分级与TRACP-5b的关系影像学MBD分级1~2级患者血清中TRACP-5b的水平为38.96±12.42mlU/ml，3~4级患者血清中TRACP-5b的水平为53.50±13.08mlU/ml，具有统计学差异，见表2-13和图2-8。表2-13影像学MBD分级与TRACP-5b的关系分组病例（例）TRACP-5b（mlU/ml）tP值影像学MBD分级1~2级640.18±11.94-2.2030.038影像学MBD分级3~4级1853.50±13.08注：F=0.006，T=-2.203，P=0.038，即骨骼损害越严重的患者，TRACP-5b水平越高。21 图2-8影像学MBD分级与TRACP-5b的关系2.5.3TRACP-5b在治疗2个疗程后及治疗4个疗程后的变化①治疗两个疗程后，MBD组患者血清中TRACP-5b的水平为35.17±12.13mlU/ml，无MBD组为28.49±10.12mlU/ml，无统计学差异（F=0.169，T=1.603，P=0.118）；②治疗四个疗程后，MBD组患者血清中TRACP-5b的浓度为31.51±10.68mlU/ml，仍高于无MBD组的25.49±7.17mlU/ml，但无统计学差异（F=3.874，T=1.708，P=0.097）；③治疗四个疗程后，MBD组患者血清中的TRACP-5b为31.51±10.68mlU/ml，较治疗前49.02±14.37mlU/ml的浓度已经明显减低，且有统计学差异（F=0.143，T=4.988，＜0.001），见图2-9。图2-9治疗前后TRACP-5b水平的变化（mlU/ml）22 2.6TRACP-5b/PINP在MBD中的诊断价值2.6.1预实验中TRACP-5b/PINP在MBD组、无MBD组及健康对照组中的比较预实验结果显示，伴MBD患者血清中TRACP-5b/PINP的比值为0.85（0.54~1.61），无MBD患者血清中TRACP-5b/PINP的比值为0.20（0.11~0.42），健康对照组血清中2TRACP-5b/PINP的比值为0.17（0.06~0.22），有统计学差异（X=16.580，P＜0.001），见表2-14和图2-10。表2-14TRACP-5b/PINP在MBD组、无MBD组及健康对照组的比较TRACP-5b/PINP2分组N(例)XPM（范围）MBD组120.85（0.54~1.61）无MBD组50.20（0.11~0.42）16.580＜0.001健康对照组120.17（0.06~0.22）注：经方差齐性检验，F=5.982，P=0.027＜0.05，固方差不齐，采用非参数Kruskal-wallisH（K）检验。图2-10MBD组与无MBD组TRACP-5b/PINP比值的比较23 2.6.2TRACP-5b/PINP高比值组与低比值组骨骼损害患者比例的对比根据预实验数据的分析结果，我们将TRACP-5b/PINP≥0.50的患者定义为高比值组患者，TRACP-5b/PINP＜0.50的患者定义为低比值组患者（见图3-3），入组的37例患者中，高比值者有24例，低比值者有13例。①TRACP-5b/PINP高比值组中确诊MBD的比例100%，低比值组中MBD的比例为215.4%，两组差异具有统计学意义（X=28.899，P＜0.001）；②影像学发现骨质损害的患者在高比值组占95.8%，在低比值组占7.7%，两组有统2计学差异（X=28.754，P＜0.001）；③伴有骨骼疼痛的患者在高比值组占95.8%，在低比值组占15.4%，两组有统计学2差异（X=24.904，P＜0.001）；④伴有高钙血症的的患者在高比值组占45.8%，在低比值组占0，两组有统计学差2异（X=8.479，P=0.004），见表2-15。表2-15TRACP-5b/PINP高比值组与低比值组MBD病例数的比较[例（%）]2指标高比值组低比值组X值P值N（例）2413确诊MBD24（100）2（15.4）28.899＜0.001影像学发现骨质损害23（95.8）1（7.7）28.754＜0.001伴中度及以上骨骼疼痛23（95.8）2（15.4）24.904＜0.001高钙血症11（45.8）08.4790.0042.6.3TRACP-5b/PINP高比值组与低比值组破骨活性相关因子的比较①TRACP-5b/PINP高比值组血清IL-6的浓度为33.10±25.82pg/ml，低比值组为9.73±3.49pg/ml，两组间的差异有统计学意义（T=3.226，P=0.003），即TRACP-5b/PINP比值高的患者，血清中IL-6的浓度也增高；②高比值组中sRANKL/OPG的比值为0.32±0.11，低比值组为0.16±0.05，具有统计学差异（T=4.881，P＜0.001），即TRACP-5b/PINP比值高的患者，sRANKL/OPG的比值也增高；24 ③β-CTX在高比值组的血清浓度为275.66±169.41pg/ml，在低比值组为123.05±139.71pg/ml，差异具有统计学意义（T=2.772，P=0.009），即高比值组中β-CTX的浓度也增高；④维生素D3在高比值组的浓度为16.02±6.21ng/ml，在低比值组为7.46±4.88ng/ml，具有统计学差异（T=4.300，P＜0.001），即高比值组中维生素D3的浓度也增高。⑤MIP1-α在高比值组患者血清中的浓度分别为160.41±68.74ng/ml，高于低比值组的138.63±60.06ng/ml，但没有统计学差异（T=0.960，P=00.344），见表2-16。表2-16TRACP-5b/PINP高比值组与低比值破骨细胞活性因子相关性的比较指标高比值组低比值组TPN（例）2413IL-6（pg/ml）33.10±25.829.73±3.493.2260.003sRANKL/OPG0.32±0.110.16±0.054.881＜0.001β-CTX（pg/ml）275.66±169.41123.05±139.712.7720.009维生素D3（ng/ml）16.02±6.217.46±4.884.300＜0.001MIP1-α（ng/ml）160.41±68.74138.63±60.060.9600.3442.6.4TRACP-5b/PINP高比值组与低比值组患者临床预后指标的比较①TRACP-5b/PINP高比值组中血红蛋白的浓度为77.06±13.46g/L，低比值组为105.69±25.98g/L，具有统计学差异（F=2.294，T=-3.146，P=0.003），即TRACP-5b/PINP比值高的患者血红蛋白浓度更低；②高比值组中β2-微球蛋白浓度为6.32±3.13mg/L，低比值组为4.14±2.27g/L，具有统计学差异（F=1.049，T=2.206，P=0.034），即TRACP-5b/PINP比值高的患者β2-微球蛋白浓度更高；③在TRACP-5b/PINP高比值组患者的浆细胞比例（每个患者观察250个细胞）为46.85±26.34%，低比值组为27.31±14.12%，具有统计学差异（T=2.938，P=0.006），即TRACP-5b/PINP比值高的患者，骨髓中的浆细胞瘤数量也更多；25 ④幼稚浆细胞在高比值组患者的比例（每个患者观察250个细胞）为31.22±27.04%，在低比值组为9.51±12.06%，差异具有统计学意义（T=3.363，P=0.002），即TRACP-5b/PINP比值高的患者，骨髓中幼稚浆细胞的比例也高于低比值患者；⑤高比值组患者肾功能损伤的比例为41.7%，高于低比值组的15.4%，但两组之间2的差异没有统计学意义（X=2.658，P=0.103），见表2-17。表2-17TRACP-5b/PINP高比值组与低比值组临床预后指标的比较指标高比值组低比值组检验值PN（例）2413HGB(g/L)81.96±19.44105.69±25.98-3.1460.003β2-MG(mg/L)6.32±3.134.14±2.272.2060.034浆细胞比例46.85±26.3427.31±14.122.9380.006幼稚浆细胞比例31.22±27.049.51±12.063.3630.002肌酐≥177umol/L10（41.7）2（15.4）2.6580.103[例（%）]26 3.讨论3.1多发性骨髓瘤骨病的发病机制多发性骨髓瘤引起的骨骼损伤并非由MM细胞直接侵蚀骨质引起，而是由于MM细胞[20-21]在骨髓腔内大量增殖并分泌细胞因子，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-α）等；MM细胞还可以刺激成骨细胞（Osteoblast,OB）和骨基质细胞（Bonestromalcells，BMSC）分泌肿瘤坏死因子（TNF）、巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor,M-CSF)、RANKL等，这些细胞因子被称为破骨细胞激活因子（OAFs）。OAFs可以导致破骨细胞（Osteodast，OC）的活性增强，成骨细胞的活性减弱，打破骨吸收与骨形成的平衡，引起骨骼损伤。研究发现OPG[22-23]／RANKL／RANK信号系统在OC细胞的激活、分化和成熟过程中，起着关键性的作用。OPG／RANKL／RANK系统有三个非常重要的细胞因子，骨保护素(OPG)、NK-κB受体活化因子配体(RANKL)和NK-κB受体活化因子(RANK)，均在MBD的发病中起着重要作[9]用，且它们都是肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor，TNF）家族成员。RANKL（NuclearfactorκBreceptoractivationfactorligands）主要由成OB细胞和BMSC细胞合成分泌，是RANK的配体,同时也是OPG的配体，有膜结合型和分泌型，分泌型是其发挥生物活性的主要形式。RANKL主要通过与OC前体细胞上的RANK结合,诱导c-Fos[9]等转录因子的表达,促进OC前体向OC分化。敲除RANKL基因的小鼠患有严重的骨硬化[24]症，且体内缺乏具有活性的OC细胞。RANK（NuclearfactorkappaBfactorreceptor）是RANKL的受体,在前体OC细胞表面高度表达。OB细胞分泌的RANKL与OC细胞上的RANK结合，后者将信号专递给TNF受体相关因子6(TNFreceptorassociatedfactor6,TRAF6)，TRAF6可以激活NF-κB复合物，释放p50亚基进入胞核，后者结合作用于DNA的顺式调控区域，激活破骨细胞的分化成[25-27]熟，促进骨质吸收。与RANKL基因敲出的小鼠类似，RANK基因敲除的小鼠因缺乏有[28]活性OC细胞而丧失骨重吸收能力，出现骨质硬化，说明RANKL/RANK介导的信号途径是OC细胞活化所必要的。OPG（Osteoprotegerin）也是一种TNF受体分子，共有7个结构域,形成了3个功能[9]区:TNF受体结构区（抑制OB细胞的活化）、致死结构区和肝素结合结构区。OPG主要27 表达于成骨细胞的表面,是RANKL的诱骗剂,竞争性结合RANKL，阻断RANKL/RANK信号通路，抑制破骨细胞的活化。简而言之，多发性骨髓瘤细胞直接或间接地分泌OAFs，OAFs作用于成骨细胞及骨基质细胞，诱导RANKL分子的表达及分泌，分泌的RANKL分子结合OC前体细胞膜上的RANK，激活NF-κB信号通路,使OC细胞分化成熟。而OPG则竞争性地与RANKL结合，抑制OC前体细胞活化。RANKL分子可直接诱导破骨细胞前体细胞分化成熟，其它因子或激素则是通过改变RANKL/RANK的比值来影响破骨细胞的活性（如图4-1）。图3-1骨髓瘤骨病患者破骨细胞活化示意图在我们的研究中，伴有骨骼损害患者血清中的IL-6及RANKL/OPG分别为31.50±25.40pg/ml和0.31±0.10，明显高于无骨骼损害患者的9.25±3.56pg/ml和0.15±0.04；且IL-6含量及RANKL/OPG比值越高，骨质破坏也就越严重；但即使没有无骨骼损害的骨髓瘤患者，血清中的RANKL/OPG比值也高于健康对照组（0.07±0.02）。治疗后，伴骨骼损害患者血清中的L-6水平及RANKL/OPG比值明显减低，同时能够代表破骨细胞活性的β-CTX含量也显著减少；两个疗程后伴有骨骼损害患者血清中的L-6水平及RANKL/OPG比值已与无骨骼损害者无明显差异。提示，随着治疗后肿瘤负荷的减低，刺激破骨细胞活化的OAFs含量也随之减低。28 3.2维生素D3在MBD中的作用及意义维生素D3(vitaminD3)为环戊烷多氢菲类化合物，属类固醇衍生物，在肝内25-羟化酶及肾内1a羟化酶的催化作用下转变为1α,25-(OH)2D3。1α,25-(OH)2D3即活性维生素D3，可促进对钙、磷离子在小肠的吸收并减少肾脏排出，从而增加血液中血钙、磷[14]离子的浓度，1α,25-(OH)2D3对成骨细胞及破骨细胞均有调节作用。生理剂量的1[15]α,25-(OH)2D3可活化相关转录因子，促进成骨细胞的增殖和骨基质形成；而高浓度1α,25-(OH)2D3则是一种很强的骨吸收刺激因子，浓度越高，诱导OC细胞分化成熟的能[16-17]力就越强。但1α,25-(OH)2D3含量的测定方法难度较大，血浆中半衰期约为4h，且易受血液中钙、磷离子浓度的影响。而维生素D3是合成1α,25-(OH)2D3的前体，血清含量高，生物活性稳定，且两者浓度呈正相关，目前国内外多应用血清中维生素D3含[29]量来反映1α,25-(OH)2D3水平。我们的研究发现，伴有骨骼损害患者血清中的维生素D3的含量高达15.46±6.47ng/ml，明显高于无骨骼损害者的7.22±4.68ng/ml，且随着治疗疗程的增加，维生[28]素D3的含量逐渐减低，与李铁军等人的报道一致。治疗四个疗程以后，骨骼损害患者血清中维生素D3的含量已经接近于无骨骼损害患者。维生素D3的曲线下面积，可以更好地体现患者暴露在高浓度维生素D3下对骨质的影响。我们发现无骨骼损害患者维生素D3的曲线下面积332.02±187.54，而伴有骨骼损害的患者高达536.86±179.91，且曲线下面积约大，骨骼损害越严重。维生素D3增加多发性骨髓瘤患者骨骼损害的机[16]制目前还不清楚，但王峰等人的报道称，1α,25-(OH)2D3可作用于成骨细胞上相应受体,促进M-CSF、IL-1、IL-6、RANKL等细胞因子的合成及分泌，提高RANKL/OPG比值，[30]间接调节OC的形成与分化。而李铁军等人的报道称，在骨髓细胞培养中，单核前体细胞募集、融合形成破骨细胞样细胞的能力与1,25-二羟基维生素D3的浓度呈正相关，[31]并称D3可能直接作用于单核前体细胞上的相关受体，促进形成破骨细胞。陈文明等人的研究称，维生素D3能够下调抗凋亡蛋白Bcl-2，同时上调p53基因的表达，导致内[32-33]皮细胞凋亡，具有抗血管新生的作用，这也可能与MBD患者骨骼损伤难以恢复有关。29 3.3骨代谢指标在骨髓瘤骨病诊断中的意义及价值患者的临床症状及影像学表现是目前诊断MBD的主要手段，常规的影像检查包括X射线、CT、MRI，有条件的患者也可以行PET-CT检查。但组织病理结果显示，一些细微的骨骼损伤并不能被影像学检查发现。血清学指标血具有简单、快捷、廉价及敏感性高的特点，是诊断骨髓瘤骨病的理想方法。3.3.1PINP在骨髓瘤骨病诊断中的意义及价值骨基质由无机质和有机质组成，无机质主要是羟基磷灰石，有机质主要是各种胶原蛋白，其中Ⅰ型胶原蛋白占有机质的90%以上，是骨基质的主要组成部分。I型胶原蛋白先以I型胶原蛋白前胶原的形式在OB细胞内合成，再由特异性蛋白酶切割为I型前胶原氨基端延长肽(PINP)、I型前胶原羧基端延长肽(PICP)和I型胶原蛋白。PINP与合成的I型胶原蛋白比例为1：1，是评估胶原合成速率的重要指标，固血清中的PINP可[12-13]以反映OB细胞的活性及骨形成速度。我们的研究发现，伴有骨骼损伤患者血清中的PINP浓度为54.68±42.09pg/ml，明显低于无骨骼损害者152.58±61.71pg/ml的水平；经过双磷酸盐和含有硼替佐米的BCD方案治疗后，虽然MBD组患者血清中的PINP有所升高，但低于无骨骼损害患组；即使达到完全缓解的MBD患者，血清中的PINP浓度仍低于无MBD患者，与国内褚彬、彭凤[6、34-37]平等人的报道基本一致。说明即使是治疗后处于完全缓解期的MBD患者，成骨细胞的活性依然是减低的，这可能是MBD患者骨骼损伤后难以恢复的原因，考虑可能与应用大剂量的糖皮质激素有关系，也可能是因为MBD患者存在OB细胞的衰竭。不过，也有报道称发现进展期患者血清中的PINP水平高于缓解期患者，提示MM患者疾病进展时[38]OB细胞的活性有所增加，目前我们还没有观察到这一结果，可能与我们进展期的病例数较少有关。3.3.2TRACP-5b在骨髓瘤骨病诊断中的意义及价值抗酒石酸酸性磷酸酶5b同工酶(tartrate—resistantacidphosphataseisoform-5b，TRACP-5b)主要由破骨细胞分泌，是判断OB细胞活性的第二代生化标志。在骨吸收过程中，OC细胞活化，同时分泌大量的TRACP-5b，TRACP-5b水平可直接反映30 [19、39-40]OC细胞活性和骨吸收状态。我们的研究发现，TRACP-5b在伴有骨骼损害的患者血清中高达49.02±14.37mlU/ml，明显高于无骨骼损害者（27.11±11.75mlU/ml），且TRACP-5b的水平，与骨骼损害的程度呈比例，即血清中TRACP-5b的浓度越高，患者的骨骼损害就越严重；经双磷酸盐和含有硼替佐米的BCD方案抗肿瘤化疗后，MBD患者血清中的TRACP-5b水平明显下降；两个疗程后MBD组患者血清中的TRACP-5b水平已经与无骨骼损害患者没有[35][41]统计学差异，与鲍立等人的研究基本一致。Terpos等人也报道称，在初诊MBD患者中，TRACP-5b的含量明显增高，经过治疗后TRACP-5b的含量逐渐恢复正常，且血清中TRACP-5b的水平与骨质破坏程度相关。3.3.3TRACP-5b/PINP对MBD的诊断价值抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP-5b)是反映OC细胞活性最直接的指标之一，而Ⅰ型胶原氨基端延长肽（PINP）是目前公认能够反映成骨细胞活性的生化指标，所以TRACP-5b／PINP的比值可以用来判断骨吸收和骨形成的平衡状态。在我们的研究中发现，伴有骨骼损害患者的TRACP-5b／PINP比值为1.167±0.443，明显高于无骨骼损害患者的0.206±0.135。根据两组患者的TRACP-5b/PINP比值及95%置信区间，将TRACP-5b/PINP≥0.50作为多发性骨髓瘤骨骼损伤的标准。我们发现，TRACP-5b/PINP诊断MBD的特异性接近100%，而敏感度为92.31%；与影像学诊断的相符度为89.19%；与患者骨骼疼痛的相符度为91.89%。同时发现TRACP-5b/PINP≥0.50患者血清中的IL-6、RANKL/OPG比值、维生素D3等反应破骨细胞活性的指标均高于TRACP-5b/PINP＜0.50的患者；TRACP-5b/PINP≥0.50患者的血红蛋白低于TRACP-5b/PINP＜0.50，而血清钙浓度、β2-MG及浆细胞的数量均高于TRACP-5b/PINP＜0.50。综上所述，TRACP-5b/PINP对MBD的诊断具有重要意义，同时还可以作为评估MM疗效及预后的指标之一。31 32 4.结论4.1初诊伴骨骼损害的骨髓瘤患者，血清中维生素D3浓度较高，维生素D3越高的患者，破骨细胞的活性越强，骨骼损伤也越严重，说明维生素D3可能增强了MBD患者破骨细胞的活性，引起骨骼损伤；4.2治疗有效的MBD患者血清中维生素D3的含量减低，无效者血清中的维生素D3无明显变化，血清维生素D3的含量可以作为MBD疗效评估的指标之一；4.3四个疗程后，治疗有效MBD患者血清中的PINP浓度上升，但仍低于无骨骼损害者，提示成骨细胞的活性恢复缓慢，修复骨骼损伤需要一定的时间；4.4血清TRACP-5b的浓度与骨骼损害的程度正相关，可以作为评估MBD患者严重程度的血清学指标；4.5TRACP-5b／PINP的比值可以作为诊断骨髓瘤骨病的指标之一。33 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综述：多发性骨髓瘤骨骼损害的机制及研究进展多发性骨髓瘤(MultipleMyelomasMM)是浆细胞的一种恶性克隆性疾病，以患者骨髓中浆细胞恶性增生并分泌大量的单克隆免疫球蛋白为特征。MM约占全部恶性肿瘤的[1]1%，占造血系统肿瘤的10~15%。患者就诊时往往伴有骨骼疼痛、骨质酥松、高钙血症、病理性骨折等骨质破坏症状，称为骨髓瘤骨病(myelomabonedisease，MBD）。MBD的发[2][3-6]病率在70%~80%左右，也有学者报道称MBD的发病率已经超过了90%，与没有骨骼破坏者相比，MBD患者的生活质量及预后更差，反映肿瘤负荷及疾病严重程度的指标也明显增高。1.骨髓瘤骨病的发病机制多发性骨髓瘤引起的骨骼损伤并非由MM细胞直接侵蚀骨质引起，而是由于MM细胞在骨髓腔内大量增殖并分泌细胞因子，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-α）、DKK-1(Dickkopf-1)蛋白等；MM细胞还可以刺激成骨细胞（Osteoblast,OB）和骨基质细胞（Bonestromalcells，BMSC）分泌肿瘤坏死因子（TNF）、巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor,M-CSF)、RANKL等，这些细胞因子被称为破骨细胞激活因子（OAFs）。OAFs导致破骨细胞（Osteodast，OC）的活性增强，成骨细胞的活性减弱，打破骨吸收与骨形成的平衡，引起骨骼损伤。1.1破骨细胞的活性增加1.1.1破骨细胞的分化成熟破骨细胞(OC)来源于骨髓单核/巨噬细胞系，由单核前体细胞通过细胞融合形成，[7-8]是体内唯一具有骨吸收活性的多核细胞。OC在分化成熟的各阶段都受到大量基因的调节，其中PU.1基因是目前发现最早调节OC形成的基因，该基因编码分化单核/巨噬37 [9]细胞系的转录因子，使单核/巨噬细胞分化为OC前体细胞。巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor,M-CSF)在OC前体细胞分化形成的早期阶[10]段发挥了重要作用，它是单核/巨噬细胞分化及OC前体细胞生存与增值的必需因子。成骨细胞和骨基质细胞分泌的M-CSF与OC前体细胞膜上的M-CSF受体结合，促进OC前体细胞的增殖及融合。在单核/巨噬细胞发育为OC前体细胞以后，接下来的分化过程[9、11]中主要受到RANK／RANKL／OPG系统的调控。1.1.2RANK／RANKL／OPG系统RANK／RANKL／OPG系统即骨保护素-细胞核因子kappaB受体活化因子配体-细胞核因子kappaB受体活化因子系统，该系统有三个非常重要的因子，骨保护素(OPG)、细胞NK-κB受体活化因子配基(RANKL)和细胞NK-κB受体活化因子(RANK)，它们都是肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor，TNF）家族成员。RANKL（NuclearfactorκBreceptoractivationfactorligands）主要由成OB细胞和BMSC细胞合成分泌，是RANK的配体,同时也是OPG的配体，有膜结合型和分泌型两种存在方式，分泌型是其发挥生物活性的主要形式。RANKL主要通过与OC前体细胞上的RANK结合,诱导c-Fos等转录因子的表达,促进OC前体向OC分化。敲除RANKL基因的小鼠患有[12]严重的骨硬化症，且体内缺乏具有活性的OC细胞。RANK（NuclearfactorkappaBfactorreceptor）是一种Ⅰ型跨膜蛋白(N-端在胞外),主要表达在单核/巨噬细胞系表面,前体OC表面高度表达，RANK的主要功能是与分泌型的RANKL结合,促进OC分化成熟。OB细胞分泌的RANKL与RANK的N-端结合后将信号专递给肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNFreceptor-associatedfactor6,TRAF6)，TRAF6可以激活NF-κB复合物，释放p50亚基进入胞核，结合作用于DNA的顺式调控区域，启动基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMP)、组织蛋白酶K(CathepsinK)[13-15]和酸性磷酸酶等基因的表达从而促进破骨细胞的分化成熟。与RANKL基因敲出的小鼠类似，RANK基因敲除的小鼠因缺乏有活性OC细胞而丧失骨重吸收能力，出现骨质硬[16]化，说明RANKL/RANK介导的信号途径是OC细胞活化所必要的。OPG（Osteoprotegerin）也是一种肿瘤坏死因子（TNF）受体分子，共有7个结构域,形成了3个功能区:TNF受体结构区（抑制OB细胞的活化）、致死结构区和肝素结合结构区。OPG主要表达于成骨细胞的表面,是RANKL的诱骗剂,竞争性结合RANKL，阻断38 RANKL/RANK信号通路，抑制破骨细胞的活化。破骨细胞的活性主要取决于RANKL/OPG比值的大小，RANKL/OPG比值升高，促进OC细胞成熟和骨吸收；RANKL/OPG比值减低，则抑制破骨细胞活性和骨吸收。简而言之，多发性骨髓瘤细胞直接或间接地分泌OAFs，OAFs作用于成骨细胞及骨基质细胞，诱导RANKL分子的表达及分泌，分泌的RANKL分子结合OC前体细胞膜上的RANK，激活NF-κB信号通路,使OC细胞分化成熟。而OPG则竞争性地与RANKL结合，抑制OC前体细胞活化。RANKL分子可直接诱导破骨细胞前体细胞分化成熟，其他因子或激素则是通过改变RANKL/OPG的比值来影响破骨细胞的活性。1.1.3巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）MM细胞与BMSC细胞相互作用，分泌大量的巨噬细胞炎性蛋白(Macrophageinflammatoryprotein-1α，MIP-1α)，MIP-1α是一种低分子量的趋化因子，属于RANTES(regulatedonactivationnormalT-cellexpressedandsecreted，调节正常T细胞表达和分泌)家族，能与OC细胞上CCRl、CCR5受体结合，使破骨细胞活化；[17][3]MIP-1α还可以与MM细胞表面的CCR5受体结合，促进MM细胞的增殖。李斯丹等人的研究发现，MBD患者血清中的MIP-1α水平较无骨骼损害者明显曾高，而无骨骼损害患者血清中的MIP-1α浓度较正常对照组增高；且缓解期患者血清中的MIP-1α较初诊及进展期患者明显减低。在MM小鼠模型中，向正常小鼠注射重组MIP-1α后可产生持续[18]性的溶骨作用，应用MIP-1α中和抗体则可以局限骨损害的范围，甚至抑制骨髓中肿[19]瘤细胞的生长。尽管目前还没有完全了解MIP-1α的作用机制，但有报道认为，MIP-1[18]α同样可以通过RANK／RANKL／OPG系统来活化破骨细胞。1.1.4白介素-6（IL-6）在MBD中的作用IL-6属于gpl30细胞因子家族,可由多种细胞分泌。骨组织中的IL-6主要来源于MM细胞、OB细胞和BMSC细胞的分泌。IL-6可以刺激成骨细胞分泌RANKL，从而激活RANK／RANKL／OPG系统，导致骨骼破坏；IL-6也能增强其他细胞因子或激素对破骨细胞的作用,如增强PTHrP维持体内钙平衡；L-6还可与PGE2协同作用通过RANK／RANKL／OPG[20]系统来调节OC的分化。成熟的破骨细胞也可以分泌IL-6，而IL-6又可以与IL-3协同促进骨髓瘤细胞的增殖，从而形成恶性循环。39 1.2成骨细胞的活性被抑制MBD患者成骨细胞的活性报道不一，多数研究认为伴有骨骼损害的MM患者体内成骨细胞的活性减低。在MBD患者的骨组织活检中发现，成骨细胞的数量和活性都明显减低，且血清中反映骨生成的指标I型胶原氨基端延长肽（PINP）浓度减低，而碱性磷酸酶（APL）[5、21]及降钙素（PLT）多无升高。1.2.1Wnt信号通路和DKK1蛋白[22]在OB细胞分化成熟的过程中，Wnt（Winglesstype）信号途径起到了决定性作用。Wnt信号途径由Wnt1/3a激活，通过诱导GSK3/Axin复合物而磷酸化beta-catenin，[23]beta-catenin作用于TCE/TCF转录因子，诱导下游基因表达，促进OB细胞的分化成熟。MM细胞能分泌可溶性的DKK-1(Dickkopf-1)和FRP2（fzzle-relatedprotein-2）[24]蛋白，抑制经典Wnt信号途径的传导。DKK-l为Wnt信号通路的抑制剂，由浆细胞产生并分泌，在骨髓瘤骨病患者中高表达。DKK-1可通过与OB细胞表面的LRP5和LRP6作用，抑制beta-catenin产生，[25][26]beta-catenin是Wnt信号通中诱导OB细胞分化成熟的关键因子。冯晓燕等人的研究发现，MBD患者血清中的DKKl水平明显高于无骨病者，且骨骼损害越严重的患者，[27]DKK-1越高。Kaiser检测了33例意义未明的单克隆免疫球蛋白增多症（MonoclonalGammopathyOfUndeterminedSignificance，MGUS)和184例有症状MM患者血清中的DKK-1浓度，结果显示有症状MM患者血清中的DKK1含量高于MGUS患者，且DKK1的含量与骨质损害的程度呈正相关。动物实验也证实，利用DKK1抗体治疗骨髓瘤小鼠可明显抑制[28]MBD进展。1.2.2syndecan-1(CDl38)蛋白MM细胞不仅能促进RANKL的产生，还可以减低骨髓微环境中OPG含量。MM细胞产生一种syndecan-1(CDl38)跨膜糖蛋白，此蛋白可以与OPG的肝素结合域结合，介导OPG进入细胞内并被溶酶体降解。syndecan-1甚至能下调OB细胞和基质细胞的OPGmRNA的表达，引起OPG分泌减少，进一步使RANKL/OPG比值升高，打破骨平衡状态。40 2.骨代谢指标在骨髓瘤骨病中的作用及意义患者的临床表现及影像学检查及是目前诊断MBD的主要手段，常规的影像检查包括对头颅、颈椎、胸椎、腰椎、肋骨、股骨和骨盆等的X射线或核磁共振扫描。然而，组织病理结果显示，一些细微的骨骼损伤并不能被影像学检查发现，因此应用血清学指标来诊断骨髓瘤骨病，是目前探索的热点。2.1β-骨胶原交联(β-CTX)破骨细胞被激活后，首先在骨面形成一个封闭的腔隙，并往腔隙内释放大量的酸性物质，溶解骨基质中的羟基磷灰石。当骨中的无机质被溶解吸收后，OB细胞开始分泌大量的蛋白水解酶，最主要的两种蛋白酶为组织蛋白酶K(CathepsinK)和基质金属蛋白[29]酶-9(Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)。组织蛋白酶K和基质金属蛋白酶-9在降解Ⅰ型胶原蛋白时释放β-CTX，骨吸收增加时I型胶原蛋白降解加速，β-CTX的含量[30-31]也增加，β-CTX也是目前国内外公认的能代表骨吸收活性的生化指标。[5、21]彭风平和褚彬等人的报道称，初诊MBD患者血清中的β-CTX水平较无骨病者显著增高，治疗后β-CTX水平明显减低，提示β-CTX可以用来评价骨髓瘤骨病严重程度[32]和评估骨病治疗疗效。而Kay等人的研究显示，在一些伴有骨痛而影像学未发现骨骼损害的MM患者中，β-CTX水平就已经升高，可以把β-CTX作为早期诊断MBD的指标之一。2.2抗酒石酸酸性磷酸酶5b同工酶(TRACP-5b)抗酒石酸酸性磷酸酶5b同工酶(tartrate—resistantacidphosphataseisoform-5b，TRACP-5b)主要由破骨细胞分泌，是目前判断OC细胞活性的第二代生化标志。在骨吸收过程中，OC细胞活化，同时分泌大量的TRACP-5b，TRACP-5b水平可直接[33][34]反映OC细胞的活性和骨吸收状态。Terpos等人的研究发现，在初诊MBD患者中，TRACP-5b的含量明显增高，经过治疗后TRACP-5b的含量逐渐恢复正常，且血清中TRACP-5b的含量与骨破坏程度相关。41 2.3MBD患者血清中I型前胶原氨基端延长肽(PINP)浓度减低骨基质由无机质和有机质组成，无机质主要是羟基磷灰石，有机质主要是各种胶原蛋白，其中Ⅰ型胶原蛋白占有机质的90%以上，是骨基质的主要组成部分。I型胶原蛋白先以I型胶原蛋白前胶原的形式在OB细胞内合成，再由特异性蛋白酶切割为I型前胶原氨基端延长肽(PINP)、I型前胶原羧基端延长肽(PICP)和I型胶原蛋白。PINP与合成的I型胶原蛋白比例为1：1，是评估胶原合成速率的重要指标，固血清中的PINP可[35-36][21]以反映OB细胞的活性及骨形成速度。国内报道显示，骨髓瘤骨病患者血清中的PINP含量低于无骨骼损害者，即使经过双磷酸盐和抗肿瘤化疗后，患者的临床症状及反映破骨细胞活性的指标均有所改善后，MBD患者血清中PINP及APL的含量仍然低于正常水平。说明即使是缓解期的MM患者OB细胞的活性依然是减低的，考虑与治疗中应用大剂量的糖皮质激素有关系，也可能是因为MBD患者存在OB细胞的衰竭。不过，也有报道称发现进展期患者血清中的PINP水平高于缓解期患者，提示MM患者疾病进展时OB[30]细胞的活性有所增加。3.维生素D3在骨髓瘤骨病中的作用及意义维生素D3(vitaminD3)为环戊烷多氢菲类化合物，属类固醇衍生物，在肝内25-羟化酶及肾内1a羟化酶的催化作用下转变为1α,25-(OH)2D3。1α,25-(OH)2D3即活性维生素D3，可促进对钙、磷离子在小肠的吸收并减少肾脏排出，从而增加血液中血钙、磷[37]离子的浓度，1α,25-(OH)2D3对成骨细胞及破骨细胞均有调节作用。生理剂量的1[38]α,25-(OH)2D3可活化相关转录因子，促进成骨细胞的增殖和骨基质形成；而高浓度1α,25-(OH)2D3则是一种很强的骨吸收刺激因子，浓度越高，诱导OC细胞分化成熟的能[39-40]力就越强；研究发现1α,25-(OH)2D3可作用于成骨细胞上的相应受体,促进M-CSF、IL-1、IL-6、RANKL等细胞因子的合成分泌,间接调节OC的形成与分化。但1α,25-(OH)2D3含量的测定方法难度较大，血浆中半衰期约为4h，且易受血液中钙、磷离子浓度的影响。而维生素D3是合成1α,25-(OH)2D3的前体，血清含量高，生物活性稳定，且两者浓度[41]呈正相关，目前国内外多应用血清中维生素D3含量来反映1α,25-(OH)2D3水平。[42]李铁军等人的报道称，在骨髓细胞培养中，单核前体细胞募集、融合形成破骨细胞样细胞的能力与1,25-二羟基维生素D3的浓度呈正相关，并称D3可能直接作用于单核前体细胞上的相关受体，促进形成破骨细胞。1α,25-(OH)2D3也可以增强PTH诱导的42 [43]骨吸收作用,与PTH协同调节骨代谢的平衡。而维生素D3在MBD患者中的表达水平及临床意义目前还少有报道。4.骨髓瘤骨病治疗的进展以双膦酸盐为主的药物治疗、放疗及手术治疗是目前治疗MBD的主要手段，虽然在一定程度上可以改善患者症状，但效果尚不理想。近年来发现免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和一些靶向治疗药物可抑制骨吸收和促进骨形成，是MBD治疗的重要进展。4.1双磷酸盐双磷酸盐目前仍然是治疗MBD的标准方案，其可以抑制OC细胞活性而影响其骨重[32]吸收，减少骨骼损伤。双膦酸盐是焦膦酸盐分子的稳定类似物，不仅可以抑制OC细胞介导的骨重吸收作用，还可抑制OC细胞的分化成熟，甚至还可以抑制肿瘤细胞扩散、[44][45]浸润和黏附于骨基质。Soe等观察到，MBD患者单次应用双磷酸盐治疗后，反映骨破坏的β-CTX水平就已经显著下降，但抑制作用具有时间依赖性，但如果不进行每月1次的规律维持治疗，β-CTX就会升高。同时双膦酸盐还是一种血管生成抑制药物，减少骨内的血管新生，不利于骨骼损伤的恢复。随着使用剂量的累积，还将导致一定毒副作用，如颌骨坏死与肾脏衰竭，限制[46]了双磷酸盐的长期应用。4.2硼替佐米硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，既有强大的抗肿瘤作用，又能抑制破骨细胞的成[47][48]熟，同时也能增加OB细胞的活性。NF-κB在破骨细胞的形成和生存中起着至关重[49-50]要的作用，硼替佐米可以通过抑制NF-κB活性，减少OPG/RANKLRANK系统介导的破[47]骨细胞激活。国外Terpos等人应用硼替佐米治疗34例复发的多发性骨髓瘤患者，治疗sRANKL的水平显著下降，同时代表破骨细胞骨活性的β-CTX水平降低。也有报道称[51]，硼替佐米还可以降低骨髓瘤骨病患者DKK-1的表达，增加OB细胞的数量。Zangari[52]等人的报道称，硼替佐米治疗有效患者血清中的碱性磷酸酶(ALP)明显升高，固对骨[47]髓瘤骨病患者的新骨生可能成具有促进作用。也有报道称应用硼替佐米治疗有效的43 MM小鼠骨密度增加，无效的小鼠骨密度没有增加；而应用地塞米松治疗有效的小鼠，骨密度没有增加。以上研究结果显示硼替佐米可以抑制骨吸收和增加骨形成。4.3免疫抑制剂[53]免疫调节剂可以下调转录因子PU.1的表达,阻断OB细胞的形成，但免疫调节剂[54]对成骨细胞的影响报道较少。Terpos应用沙利度胺联合地塞米松治疗35例难治/复发MM患者,3个月后血清中的β-CTX和TRACP-5b明显减低，6个月后sRANKL水平和sRANKL/OPG比例也降低，而且sRANKL/OPG和β-CTX、TRACP-5b的变化有一定的相关性，[51、但治疗过程中血清bALP水平无明显变化,表明沙利度胺不影响新骨形成，这也与鲍立55][56]等人的报道基本一致。但Knobloch等人的研究显示沙利度胺可上调DKK1的表达，有助于提高OB细胞的活性。4.4靶向治疗药物4.4.1针对OPG/RANKLRANK系统的抑制剂RANKL是OPG/RANKL/RANK系统的关键因子，也是OB细胞活化的核心因子，因此也是治疗MBD的关键靶点。重组OPG（AMGN-0007）是OPG的类似物，可以特异性地结合sRANKL，降低RANKL/OPG比值，抑制OB细胞的激活。目前AMGN-0007的I期临床试验[57]结果显示，皮下注射可迅速有效地抑制MBD患者的骨质破坏。Denosumab(AMG162)是一种人RANKL的单克隆抗体，可以模拟内源性OPG的作用，与RANKL特异性地结合，阻断OPG/RANKL/RANK通路,已有多项II期临床试验证实Denosumab可作为一种安全的药[58][59]物用于绝经后的骨质疏松、MBD和各种骨转移瘤。HenryDH等人报道称，Denosumab抑制骨吸收指标升高的时间长达80d，而双磷酸盐仅30d，颌骨坏死的发生率两者相当，但Denosumab组较少引起肾功能衰竭。4.4.2Dickkopf-1(DKK-1)抑制剂DKK-1是MM细胞分泌的一种可溶性蛋白，可抑制Wnt信号通路，进而抑制OB细胞的分化成熟，导致MM患者骨代谢失衡。阻断DKK1的活性可以抑制骨质破坏，促进新骨[69][28]形成。Yaccoby等人的实验表明：BHQ880(一种抗DKK-l抗体)可以显著升高MBD模44 型小鼠的骨密度，组织病理也证实DKK1抗体使小鼠体内OB细胞数量增多而OC细胞数量减少。4.4.3MIP-1a/CCR1途径抑制剂MIP-1a主要参与骨髓瘤细胞与破骨细胞之间的相互作用，它既可以通过CCR1受体活化破骨细胞细胞，又能促进骨髓瘤细胞的增殖和转移，血清中MIP-1a的水平与MM的[60]分期和预后相关。研究显示，在MM的动物模型中，使用MIP-1a抗体后血清中MIP-1a的水平明显下降，骨骼损害也有所减轻，提示MIP-1a抗体可以治疗MBD。Vallet[61]等人研究发现，MLN3897(特异性CCR1抑制剂)可通过下调细胞融合与c-fos表达，阻断OC细胞的分化。4.4.4其他靶向治疗药物MM细胞和OC细胞都可分泌IL-6，IL-6可以刺激OB产生RANKL激活破骨细胞，活化的OC细胞也可以分泌IL-6促进MM的增值，形成恶心循环。Nguyen等进行的体外研究显示，P38α-MAPK抑制剂SCIO-469可以抑制骨髓间质细胞分泌IL-6，降低破骨细胞活性，减少MM细胞增殖。综上所述，多发性骨髓瘤细胞可直接分泌或刺激骨基质细胞分泌OAFs，OAFs导致OB细胞分泌的RANKL增加，OPG减少，使RANKL/OPG比值增加，OC细胞活性增强；此外，维生素D3、MIP-1α、IL-6等也可以通过OPG/RANKL/RANK系统或直接作用于OB细胞，激活OC细胞，在MBD的发生发展中也具有重要的作用；同时MM细胞还可以分泌成功细胞活性抑制因子（如DKK-1），导致成骨细胞的活性减低；OC细胞活性的增强及OB细胞活性的减弱共同导致了骨髓瘤骨病的发生。TRACP-5b、β-CTX是反映OC细胞活性的良好指标，检测血清中的浓度可以间接反映OC细胞的活性，了解骨质损害的情况。在MBD的治疗方面，除了目前常用的双磷酸盐之外，硼替佐米及免疫调节剂雷利度胺、沙利度胺等药物对MBD也有一定的疗效；一些靶向治疗药物，如AMGN-0007（重组OPG类似物）、Denosumab(RANKL抗体)、BHQ880(DKK-l抗体)等在二期临床的实验中也表现了良好的应用前景。45 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致谢光阴似箭,岁月如梭，转眼间就到了毕业的时刻。研究生的这三年，无疑是我学生生涯乃至我人生成长过程中最重要的三年。在这三年里，我遇到了很多的良师、益友，尤其是我的导师朱尊民教授，给予了我父亲般的关怀与帮助。值此毕业论文完成之际，我衷心地向我的导师、血液科和血研所的各位老师、护士以及我的师弟师妹们表示感谢！首先，我非常、非常地感谢我的导师朱尊民教授！他不仅拥有精湛的医术，渊博的学识，同时还有严谨的态度、崇高的医德医风以及博大的胸怀。在医疗工作上，他对患者关心入微；在教学上，他严谨治学；在生活上，他给了我如父亲般的关怀。每次抢救患者，他都会冲到最前面；每次来医院加班，几乎都可以看到他的身影；他在工作、学习以及生活生上给我的耐心指导，使我终身受益。在这里，我再次衷心感谢我的导师朱尊民教授，同时我是我想对我的导师说：“朱老师，您是我一生的楷模！能成为您的学生是我最幸运的一件事！成为您这样的仁医、大医，也是我一生的追求！”再者，我非常感谢我的带教老师，袁晓莉副主任医师！袁晓莉老师在理论知识的学习中及临床工作的实践中都给予我了细心的指导，同时在科研试验中也给予了我极大的帮助。袁老师丰富的知识，开阔的视野，乐观的心态和严谨的工作作风都是我学习的榜样。无论在工作中还是在学习中，袁老师都想我的姐姐一样，给了无微不至的关怀与帮助。衷心感姜丽老师，在血液内科的基础理论学习及临床实践过程中给予我的宝贵指导及无私帮助！衷心感谢张茵老师、杨靖老师、雷平冲老师、王同保老师、郭建民老师、刘忠文老师、陈玉清老师、臧玉柱老师在学习、工作和科研标本收集的过程中给予的诚挚关怀与无私帮助，在此向他们表示我最忠诚的感谢！衷心感谢刘艳慧老师、王臻老师、白炎亮老师、牛晓娜老师在临床实践工作中的指导与帮助！衷心感谢省医血研所的孙恺老师、张琳老师、商宝军老师、李玉龙老师、李威老师在科研实验工作中给予我的耐心指导与帮助！衷心感谢张文绘师姐、孔黛师姐、时明月师姐、裴晓航师兄、牛俊伟师兄，我的同学高海涛、王芳，以及血液二病区的护士老师们在生活和学业上给予我的帮助！感谢霍磊、王平、张令、杨世伟、周放、徐慧等师弟师妹们给予我的支持与帮助！最后，再次真心感谢所有给予过我关心和帮助的老师、同学和朋友们！马荣军2017年3月18日53 －看＿明德靳民＊於至善＾着錢