新疆南疆牛乳头瘤病毒1型SY-12株全基因序列分析及蛋白表达研究

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：分类号：Ｓ８５２．６５单位代码１０７５７密级：公开学号：１０７１００５３２０１５０２０蟓里木太嗲ＴＡＲＩＭＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文新疆南疆牛乳头瘤病毒ＳＹ－１２１型株全基因序列分析及蛋白表达研究ＷｈｏｌｅＳｅｑｅｎｃｅＡｎａｌｓｉｓａｎｄＥｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＰｒｏｔｅｉｎｏｆＢｏｖｉｎｅｕｙｐ－Ｐａｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ１ＧｅｎｏｔｅＳＹ１２ＳｔｒａｉｎｉｎＳｏｕｔｈｅｒｎＸｉｎｉａｎｐｙｐｊｇ研究生姓名：张婉琪指导教师：胡律軍教授：理学硕士申请学位门类级别专业名称：微生物学研究方向：畜禽疫病病原学及其免疫研究所在学院：牛侖科学学院新疆？阿拉尔二〇一八年六月 学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研。据我所知，论文中不包含其他个人或宄成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外。对本人研宄做出重要贡献的个人及集体集体已经发表或撰写过的研宄成果，均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。：学位论文作者签名：签字日期冰年Ｊ月么曰学位论文版权认定和使用授权书本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借用。本人授权塔里木大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：签字日期：年月日＆导师签字：签字日期：义４年ｔ月＞日 新疆南疆牛乳头瘤病毒1型SY-12全基因序列分析及蛋白表达研究摘要牛乳头瘤病是由牛乳头瘤病毒（Bovinepapillomavirus,BPV）引起的一种肿瘤性疾病。患牛主要表现为患病处有突出体表外的赘生瘤体，且极易通过畜群间的接触引发交叉感染。已知的牛乳头瘤病毒Ⅰ型和Ⅱ型可以通过畜群混饲造成跨种间传播，主要表现为马属动物感染牛乳头状瘤病毒。因乳头瘤病毒的宿主特异性、组织局限性，以及细胞培养增殖病毒困难，目前倾向于分子水平的研究。本研究基于新疆南疆一例疑似感染牛乳头状瘤病例的样本基因分型鉴定，对牛乳头状瘤病毒1型SY-12株全长基因组序列测序及结构特征分析，并构建SY-12株L1基因的原核表达系统和E6真核表达系统，为进一步研究牛乳头瘤的基因分型、疫源追溯、病毒分子遗传演化规律、疫苗研究等提供理论依据。1.在临床诊断、病理组织学检查基础上，采用乳头瘤病毒通用引物MY11/MY09成功扩增出L1基因部分片段并测序，核苷酸同源性比较分析确定该患病动物为BPV-1型牛乳头瘤病毒感染。2.设计特异性扩增引物、测序引物，完成牛乳头瘤病毒1型SY-12全基因组序列测定。确定SY-12基因序列全长7946bp，具有BPV的功能基因结构，包括早期编码区基因E6、E7、E1、E2、E4、E5和晚期编码区基因L1和L2，为Delta属牛乳头瘤病毒。3.以L1基因的特异性引物扩增出1488bp目的片段，并构建BPV-1L1基因的原核表达系统pET32a-L1，经诱导条件优化后获得分子量大小为75KD的目的融合蛋白，与预期蛋白大小相符。4.以E6基因特异性引物，成功克隆BPV-1E6基因，目的基因大小为414bp，构建E6真核表达系统pEGFP-N1-E6并转染至BHK-21细胞内，倒置荧光显微镜下可见明显绿色荧光。关键词：牛乳头瘤病毒1型；基因分型；全基因组；L1基因；原核表达；E6基因；真核表达Ⅰ WholeSequenceAnalysisandExpressionoftheProteinofBovinePapillomavirus1GenotypeSY-12StraininSouthernXinjiangAbstractBovinepapillomatosisisaneoplasticdiseasecausedbyBovinepapillomavirus(BPV).Thecattlewasinfectedwiththedisease,mainlymanifestedbytheprominentsupernumerarytumoroutsidethebodysurface,anditwaseasilytocausecrossinfectionthroughthecontactbetweenherds.BovinepapillomavirustypeIandtypeIIcanbetransmittedacrossdifferentspeciesthroughherdfeeding,mainlyduetoinfectionofbovinepapillomavirusinequineanimals.Becauseofitshostspecificity,tissuelimitationanddifficultyincellproliferation,thepapillomavirusiscurrentlyatthemolecularlevel.Inthisstudy,basedonasamplegenotypingidentificationofasuspectedcaseofinfectedbovinepapillomainsouthernXinjiang,thewholegenomesequenceofthebovinepapillomavirustype1SY-12strainanditsstructuralcharacteristicswereanalyzed.TheprokaryoticexpressionsystemoftheSY-12L1geneandtheE6eukaryoticexpressionsystemwereconstructedtofurtherstudythegenomesofbovinepapilloma.Itprovidesatheoreticalbasisforfurtherstudiesongenotyping,traceabilityofepidemicsources,moleculargeneticevolutionandvaccineresearchofbovinepapilloma.1.Onthebasisofclinicaldiagnosisandhistopathologicalexamination,theL1genefragmentwasamplifiedandsequencedsuccessfullywiththecommonprimerMY11/MY09ofpapillomavirus,andthenucleotidehomologywascomparedandanalyzedtodeterminethattheinfectedanimalwasBPV-1typebovinepapillomavirusinfection.2.Thewholegenomesequenceofbovinepapillomavirustype1SY-12strainwassequencedbyspecificamplificationprimersandsequenceprimers.Thefull-lengthoftheSY-12strainwas7946bp,withthefunctionalgenestructureofBPV,includingtheearlycodingregiongeneE6,E7,E1,E2,E4,E5andlatecodingregiongenesL1andL2,whichⅡ belongstothegenusDeltagenusbovinepapillomavirus.3.Thetargetfragmentof1488bpwasamplifiedwiththespecificprimersoftheL1geneandtheprokaryoticexpressionsystempET32a-L1oftheBPV-1L1genewasconstructed.Thetargetfusionproteinwithamolecularweightof75KDwasobtainedaftertheoptimizationoftheinductioncondition,whichwasinaccordancewiththeexpectedproteinsize.4.TheBPV-1E6genewasclonedsuccessfullywiththespecificprimersofE6gene.Thetargetgenewas414BP.TheE6eukaryoticexpressionsystempEGFP-N1-E6wasconstructedandtransfectedintoBHK-21cells.Thecleargreenfluorescencewasvisibleundertheinvertedfluorescencemicroscope.Keywords:Bovinepapillomavirustype1;Genotyping;Whole-genome;L1gene;Prokaryoticexpression;E6gene;EukaryoticexpressionⅢ 本文是国家自然科学基金项目“新疆南疆动物乳头瘤感染流行病学调查及病原分子生物学特性分析”的部分研究成果（项目编号：31660725）课题主持人：胡建军教授（塔里木大学） 目录摘要.......................................................................................................................ⅠAbstract................................................................................................................Ⅱ第1章绪论.........................................................................................................11.1国内外研究现状.....................................................................................11.1.1病毒命名法与分型........................................................................11.1.2牛乳头瘤病毒基因组....................................................................21.1.3牛乳头瘤病毒功能基因简介........................................................21.1.4牛乳头瘤病毒基因分型................................................................31.1.5致癌基因E5、E6、E7基因.........................................................31.1.6流行病学特征................................................................................51.1.7研究现状........................................................................................51.1.8致病机理........................................................................................61.1.9免疫机制........................................................................................71.1.10诊断及预防..................................................................................71.2研究意义....................................................................................................8第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析.............................92.1材料..........................................................................................................92.1.1试验材料........................................................................................92.1.1.1样品来源...............................................................................92.1.1.2主要试剂...............................................................................92.1.2主要仪器设备................................................................................92.2试验方法.................................................................................................92.2.1病理组织学观察............................................................................92.2.2引物及参考毒株..........................................................................102.2.3病料处理......................................................................................102.2.4病料样品DNA的提取...............................................................112.2.5PCR检测体系..............................................................................122.2.6T载体连接和产物转化感受态细胞..........................................122.2.7序列分析......................................................................................132.3试验结果...............................................................................................132.3.1临床症状......................................................................................132.3.2病理组织学观察..........................................................................132.3.3PCR检测结果..............................................................................142.3.4BPVL1基因核苷酸序列同源性分析........................................142.3.5遗传进化树分析..........................................................................152.4讨论........................................................................................................162.5结论........................................................................................................17第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析...........183.1材料与仪器...........................................................................................183.1.1试验材料......................................................................................183.1.2主要试剂......................................................................................183.1.3试验仪器......................................................................................183.2方法........................................................................................................18 3.2.1引物设计与合成..........................................................................183.2.2组织病料的处理..........................................................................193.2.3病料样品DNA的提取...............................................................193.2.4PCR反应扩增体系......................................................................203.2.5PCR产物电泳检测......................................................................213.2.6PCR产物的纯化与测序.............................................................213.2.7数据的拼接及序列分析..............................................................223.3结果........................................................................................................223.3.1SY-12株全基因组PCR扩增.....................................................223.3.2SY-12株全基因组测序同源性分析...........................................223.3.3BPV不同基因型系统进化树的构建.........................................233.3.4SY-12株与参考株全基因组核苷酸序列差异比较..................253.3.5SY-12株与参考株核苷酸和氨基酸同源性分析......................263.3.6SY-12株全基因组结构分析.......................................................273.4讨论........................................................................................................303.5结论........................................................................................................32第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达...................334.1材料与仪器...........................................................................................334.1.1材料..............................................................................................334.1.2试剂..............................................................................................334.1.3仪器设备......................................................................................334.2方法........................................................................................................344.2.1引物的设计与合成......................................................................344.2.2牛乳头瘤病毒1型L1基因的扩增与回收...............................344.2.3连接载体测序..............................................................................364.2.4L1蛋白结构预测分析.................................................................364.2.5原核表达载体的构建..................................................................374.2.5.1双酶切纯化.........................................................................374.2.5.2连接转化.............................................................................374.2.5.3PCR鉴定.............................................................................384.2.5.4重组质粒的鉴定.................................................................394.2.6牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达与检测...........................394.2.7IPTG诱导浓度的比较................................................................404.2.8诱导时间的优化..........................................................................404.2.9重组蛋白可溶性分析..................................................................404.2.10牛乳头瘤病毒1型L1蛋白的提取与纯化.............................414.2.11纯化蛋白Westernblot分析......................................................414.3结果........................................................................................................424.3.1牛乳头瘤病毒1型L1基因的PCR扩增..................................424.3.2基因序列分析..............................................................................434.3.3L1蛋白一级结构分析.................................................................434.3.4L1蛋白二级结构分析.................................................................444.3.5L1蛋白三级结构预测.................................................................444.3.6pET-32a-BPV-1-L1表达载体的构建与鉴定.............................44 4.3.7牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达与检测...........................464.3.8重组蛋白诱导条件的优化..........................................................474.3.9重组蛋白可溶性分析..................................................................474.3.10纯化蛋白Westernblot检测......................................................474.4讨论........................................................................................................484.5结论........................................................................................................49第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建505.1材料与仪器...........................................................................................505.1.1材料..............................................................................................505.1.2试剂..............................................................................................505.1.3仪器设备......................................................................................505.2方法........................................................................................................505.2.1引物设计与合成..........................................................................505.2.2牛乳头瘤病毒1型E6基因的扩增与回收...............................515.2.3E6基因连接载体测序.................................................................525.2.4真核表达载体的构建..................................................................525.2.4.1双酶切纯化.........................................................................525.2.4.2连接转化.............................................................................535.2.4.3菌液PCR鉴定...................................................................535.2.4.4重组质粒的鉴定.................................................................535.2.5BHK-21细胞的培养...................................................................545.2.5.1细胞复苏.............................................................................545.2.5.2细胞传代.............................................................................545.2.5.3细胞冻存.............................................................................545.2.6重组真核表达质粒pEGFP-N1-E6的转染及检测....................545.3结果........................................................................................................555.3.1牛乳头瘤病毒1型E6基因的PCR扩增..................................555.3.2基因序列分析..............................................................................555.3.3E6蛋白一级结构分析.................................................................565.3.4E6蛋白二级结构分析.................................................................565.3.5E6蛋白三级结构预测.................................................................575.3.6pEGFP-N1-E6表达载体的构建与鉴定.....................................575.3.7BHK-21细胞转染结果...............................................................595.4讨论........................................................................................................595.5结论........................................................................................................60第6章总结与展望............................................................................................61附件.......................................................................................................................62参考文献...............................................................................................................65致谢.......................................................................................................................72作者简介...............................................................................................................73 塔里木大学硕士学位论文第1章绪论第1章绪论乳头状瘤病毒（papillomaviruses，PV）广泛存在于自然界，乳头状瘤病毒科成员广泛，能感染所有温血动物。除了α、β、γ、δ、μ、γ属的病毒感染人外，其余病毒属均为动物感染。乳头瘤病毒在各类脊椎动物体内均有发现。目前有超过240种不同类型的乳头瘤病毒被归为37个种属，乳头瘤病毒被认为是可感染脊椎动物的病毒种类中最为庞大的[1]。其中牛乳头状瘤病(Bovinepapillomatosis，BP)是由牛乳头瘤病毒(Bovinepapillomavirous，BPV)引起的一种引发良性或恶性上皮细胞增生的肿瘤性疾病，主要表现为皮肤、黏膜形成纤维乳头状瘤[2-3]。目前该病呈世界流行，患畜感染病毒后或因继发感染造成生产性能的下降，严重的恶性肿瘤病变可导致患畜死亡。因此，乳头状瘤的传播给养殖业带来严重的经济损失[4]。临床上表现为散在性疣样损伤，体表或部分黏膜产生慢性、增生性结节，严重时可连接成片，也称为“疣”[5]。BP的自然感染仅见于3~24月龄的犊牛，目前通过实验室内接种可以感染多种宿主，一般经由皮肤感染。BP潜伏期多为1-6个月，不同年龄、性别、品种的患畜均能感染。其中青年牛发病率较高。动物感染后容易导致畜群间发病，尤其是饲养环境密集的牛群。本病无明显季节性，散在发生，是奶牛常见的良性肿瘤性疾病，易复发。本病为世界流行，不同国家和地区均有发生，易造成动物体质降低，生产性能下降和损害皮革质量。由于病毒分离培养比较困难，目前研究多倾向于BPV流行病学研究、全长序列分析、致癌基因作用机制、病毒的复制与其协同因子间相互作用关系、病毒感染途径和疾病的治疗预防等方向。其中，牛乳头瘤病毒1型成为研究乳头瘤病毒特性的模型，在探讨人类乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染和致癌机制上受到人们的关注。1.1国内外研究现状1.1.1病毒命名法与分型乳头瘤病毒(papillomavirus，PV)和多瘤病毒（Polymavirus，PyV）都属于乳多空病毒科（Papovaviridae）,但两者间基因的差异大，随着对病毒本质的研究，病毒分类国际委员会(InternationalCommitteeontheTaxonomyofViruses,ICTV)依据病毒的结构和功能，将其分为多瘤病毒科和乳头状瘤病毒科。1 塔里木大学硕士学位论文第1章绪论由于L1基因是乳头状瘤病毒中最为保守的基因序列，因此主要依据L1蛋白基因组序列的一致性对该病毒进行分类。当基因序列的一致性低于60%时，认定为同一属；当基因序列的一致性在60%~70%时，认定为同一种；当基因序列的一致性在70%~90%时，认定为同一型；当基因序列的一致性在90%~98%时，认定为同一亚型；当基因序列的一致性高于98%时，认定为突变株。但倭黑猩猩与黑猩猩乳头状瘤病毒的L1基因序列一致性为91%，但不属于同一基因型；野生狍乳头瘤病毒（CcaPV1）的L1基因序列与欧洲麋鹿乳头状瘤病毒(EEPV)、驯鹿乳头状瘤基因（REPV）的一致性分别为71.2%和70.3%，但不属于同一种[6]。1.1.2牛乳头瘤病毒基因组BPV病毒为直径约55~60nm的正二十面体的圆形颗粒，具有长度约为8000bp左右的双链、闭环、超螺旋DNA分子[7]。病毒颗粒在蔗糖和CsCL中的浮密度分别为1.20g/cm3和1.34~1.35g/cm3，沉降系数300s[8]。未成熟的病毒粒子可能为细丝状或管状，病毒可耐受乙醚、酸和热（50℃存活1h）。病毒衣壳主要由72个斜格排列的壳粒组成，基因组DNA包含在衣壳蛋白中，无囊膜[9-10]。牛乳头瘤病毒基因组分子量大小为5×106道尔顿。各型BPV基因组DNA的长度相近，在7000~8000bp之间。各不同型的牛乳头瘤病毒的全长序列和基因结构类似，分为三个功能区:(l)早期转录E区，主要参与细胞的转化、病毒的复制与转录和基因的表达调控，含有的早期蛋白为：El、E2、E4、E5、E6、E7等。E3见于少数乳头状瘤病毒类型，作为一种假定基因，不表达任何的蛋白，不具有早期转录蛋白功能。(2)晚期蛋白编码L区:L1蛋白是衣壳的主要成分，含有型特异性抗原表位；L2蛋白能够和病毒的DNA结合，进入衣壳蛋白后组装成病毒粒子，含有种特异性抗原表位；两者均在高度分化的上皮细胞核中表达，先由L1作为载体介导病毒和细胞受体结合，再由L2和病毒的DNA结合，最终诱导病毒粒子组装。(3)非转录LCR区：具有特异结合位点和调控元件，具有调节作用，是BPV变异最多的区域[11-15]。1.1.3牛乳头瘤病毒功能基因简介据统计，动物乳头状瘤病毒能感染包括人在内的15000多种的哺乳动物和鸟类。其2 塔里木大学硕士学位论文第1章绪论中，牛乳头状瘤病毒（Bovinepapillomavirus,BPV）和兔乳头状瘤病毒（Cottontailrabbitpapillomavirus,CRPV）具有致癌性，已经成为研究人乳头瘤感染的实验模型。并且三者均已确定各基因亚型，且碱基序列明确，其基因组成相同，具有相似的开放阅读框，且位置相近，E7、El、E2、E5的部分基因片段存在重叠区域，E6和E7基因存在重叠片段，E4基因涵盖于E2中，这些基因编码蛋白参与和调控病毒的早期转录，并且早期转录的E区除包括上述基因外，部分基因型还含有E3和E8基因，其中El、E2、E4、E6、E7各基因型内均存在编码，E3仅存在于BPV中，各不同种属基因型内E5和E8基因存在不定。晚期转录区基因L1和L2分别是病毒的主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。L1基因编码的蛋白是病毒的主要衣壳蛋白，同时也是常见的用于研究人乳头瘤病毒基因疫苗的备选基因；L1基因编码的蛋白常以氧化形式存在于病毒样颗粒中，还可以同多种蛋白相互作用，参与病毒转染宿主细胞。L2基因除了参与病毒的包装与感染外，还可以与E2基因共同调控病毒的复制和组装。1.1.4牛乳头瘤病毒基因分型BPV除已发现的13种基因型外，尚有许多未分类的假定基因型，根据其生物学特性和基因组结构可以分为4类[16-19]。不同基因型的侵害部位和临床病变存在一定差异[20-21]。Delta乳头瘤病毒属的BPV1、BPV2及BPV13，可致动物纤维乳头状瘤形成，多感染蹄目动物，宿主和组织嗜性较广。且BPV1和BPV2可以跨种属引起其他家畜羊、驴和马属动物乳头瘤病毒感染。BPV3、BPV4、BPV6、BPV9、BPV10、BPV11及BPV12属于Xi乳头瘤病毒属，感染宿主仅为牛，可以感染上皮细胞诱导真皮乳头状瘤产生。BPV5和BPV8属于Epsilon乳头瘤病毒属，两种乳头状瘤均能产生。在健康皮肤中可以检测到BPV7，目前没有BPV7致病的报道，未被定义种属。BPV1、BPV2、BPV5和BPV8均由同一祖先演化而来。此外，BPV1和BPV2还可引起牛膀胱尿路上皮的非增殖性感染，这可能与膀胱肿瘤的发展变化有关[22]。1.1.5致癌基因E5、E6、E7基因E5蛋白结构为疏水性的多肽，多数具有转化活性。现有研究表明E5在细胞转化、肿瘤形成和免疫调节中具有重要作用。E5蛋白中的跨膜α螺旋结构存在于不同种属的乳头3 塔里木大学硕士学位论文第1章绪论瘤病毒中。E5是由44个氨基酸组成的蛋白，为Ⅱ型跨膜蛋白，当机体感染病毒时，深部上皮细胞内表达，大多数E5在宿主的内质网膜和高尔基体上，是重要的肿瘤转化蛋白，E5的转化活性与生长因子受体和细胞周期依赖性激酶的激活有关。DiMaiO[23]等研究发现，E5蛋白特异性地以血小板衍生生长因子β受体（PDGFβ-R）活化，两者结合，形成稳定的复合物，影响细胞转化，从而诱导致癌。Corteggio[24]等研究发现，MHCⅠ类分子被E5蛋白抑制，影响重链基因的转录、降解重链并且与残留重链相互作用，通过多步反应干扰MHCⅠ类分子生物合成，导致MHCⅠ类分子进行不可逆的下调表达，即当细胞遭受病毒感染时，使T细胞不能识别细胞表面的病原体，使病毒逃避免疫监视，从而影响异常表达间隙连接蛋白，进一步抑制细胞间信息传递[25]。E6基因编码大小为137个氨基酸的E6致癌蛋白。p53是一种重要的肿瘤抑制蛋白，E6可通过泛素化途径来降解p53，使细胞对DNA损伤的反应能力降低，并且E6与细胞内其它蛋白相互作用，可以引起多个代谢途径的改变[26-29]，同时E6也可与CBP/p300相互作用，影响p53或其他转录因子所需的CBP/p300的转录共激活功能[30]。研究表明，动物皮肤角质细胞永生化与E6蛋白作用机制相关[31-33]。BPV-3、BPV-4和BPV-6缺少E6，由E5替代。进一步的研究发现，BPV-9、BPV-10、BPV-11和BPV-12都缺失了E6，而BPV-1、BPV-2、BPV-5、BPV-8和BPV-13仍保留有这一基因。E7是具有锌指结构的由127个氨基酸组成的蛋白，与E5和E6共同作用可诱导细胞转化。E7与E5和E6共表达时，可增强E7的转化能力，这种共表达形式具体表现为诱发间质瘤的发生[34]。当基因中缺失E7时诱导转化效率降低，且导致基因具有不同的转化特性。E7蛋白与p600的结合影响其转化功能，当E7蛋白发生突变，影响p600与E7的结合能力，使转化无效。若p600沉默，表达E7蛋白细胞的转化作用就相应减弱。在某种程度上，转化活性是由E7蛋白与p600的结合能力所决定的。研究表明，E7蛋白与p600相互作用使在无细胞基质作用的癌细胞存活[35]。对人子宫癌衍生细胞的分析首次指出了E6和E7基因在癌症形成中的作用，并且发现病毒DNA会随机整合到宿主基因组中，分裂后的病毒基因只保留了E6和E7基因，表明E6和E7基因在癌症的发生中扮演着极其重要的角色。4 塔里木大学硕士学位论文第1章绪论1.1.6流行病学特征Creech1929年报道牛乳头状瘤[36]以来，该病已呈现出世界范围蔓延的趋势，其中欧洲大陆、新西兰、肯尼亚部分地区、澳大利亚、英国、美国、印度、德国均有发生。我国自1973年首次发现该病以来，国内发病率呈现上升趋势。近年来新疆、海南、广西、贵州、东北等地均有报道发生，由于乳头瘤病毒可以造成奶牛乳房肿瘤，人工挤奶的牛场患病率明显高于机械化牛场。但是由于缺乏有效的组织培养系统，病毒分离困难，对乳头状瘤病毒的研究进展缓慢。本病无明显季节性，散在发生，是奶牛常见的良性肿瘤性疾病，易复发。本病为世界流行，不同国家和地区均有发生，易造成动物体质降低，生产性能下降和损害皮革质量。饲养密集的牛群更容易诱发该病。研究表明，BPV可能与环境因素（如欧洲蕨类植物）协同致瘤[37]。当牛食用欧洲蕨或感染牛病毒性腹泻病毒时，机体出现慢性免疫抑制，使潜伏的牛乳头瘤病毒激活，有助于病毒的持续感染和乳头状瘤的扩散。蕨类植物中的原蕨苷可以作为突变剂，启动致癌基因的表达增强病毒致癌性。密集饲养时，畜舍中金属异物和建筑等造成家畜皮肤损伤，牛乳头状瘤病毒可以通过破损的皮肤或黏膜造成感染，引起病变。通常良性肿瘤可自行消退，但在环境中存在致癌辅助因子时，也可能持续发展成高危型癌症，常见继发为膀胱癌和消化道癌，BPV-2感染膀胱粘膜后，在外界环境协同作用下引发的膀胱癌与地方性血尿综合症相关。位于消化道的乳头状瘤主要通过口腔侵入，牛感染BPV-1型乳头瘤疾病时，公牛阴茎和包皮可引发纤维状乳头瘤，严重时，肿瘤可沿会阴生长至背部，致组织坏死、生殖机能丧失；公牛可通过交配引发母牛阴道乳头状瘤，并能继续传播，造成群间传播。此外，患病动物与健康动物混饲或经破损的皮肤直接接触时易造成病毒的感染，同时病毒影响机体代谢途径，造成免疫系统抑制，对疾病的作用机制产生影响。1.1.7研究现状研究发现，世界各地均有报道疾病的发生，现已遍及全球[38-40]。随着分子生物学技术的不断发展，BPV的研究取得了较大的成果。杨海宁以牛乳头瘤病毒1型E6蛋白(BPV-1E6)为研究模板，研究了对E6与p73靶分子之间作用关系[41]。齐长明等利用博5 塔里木大学硕士学位论文第1章绪论宁霉素霜剂对皮肤乳头状瘤进行了治疗，呈现出较好的治疗效果[42]。贺志昊对新疆北疆地区牛乳头瘤病毒感染进行了流行病学研究，并对主要流行株进行了基因分型和蛋白表达研究[43]。王青青等对新疆南疆地区的牛乳头状瘤感染进行了鉴定与分型工作[44]。权鑫对中药作用牛乳头状瘤病毒感染进行了研究，得出中药苦参碱既具有直接灭活BPV的能力，又具有抑制增殖及预防感染的作用[45]。史巧云对BPV-13型进行全基因组克隆测定工作，并研究了致癌基因E5的真核表达[46]。彭昊等对广西地区黄牛乳头瘤进行基因分析，确定为牛乳头瘤病毒1型，这也是我国南方地区首次报道1型乳头瘤病毒的分离[47]。本课题对新疆南疆的BPV-2型AKS-01株进行了全长序列分析[48]。Borzacchiello等人的研究表明，环境因素可诱发BPV恶性病变，伴发地方性血尿症的尿生殖道乳头状瘤，即协同致瘤[49-54]。BPV的感染主要造成生产机能下降，当肿瘤恶变后，与外界环境共同作用同样具有致死性。研究表明除BPV1、BPV2可跨种间造成马属动物和羊的感染，其余牛乳头瘤病毒均具有严格的种属特异性[55]。日本Ogawa等人2002年对健康皮肤和感染肿瘤的皮肤进行研究，研究结果表明牛乳头瘤病毒也存在于正常皮肤中，同时检测出11种假定新型牛乳头瘤病毒(BAPV1-10、BAPV11MY)。Silva等人2010年通过调查研究发现巴西南部皮肤肿瘤是由BPV1、BPV2、BPV6混合感染引起[56]。Carvalho等人2011年通过调查72份牛乳头状肿瘤病料检测出BPV1、BPV2、BPV3、BPV4、BPV5、BPV6、BPV8、BPV9、BPV10以及2种BPV11的亚型[57]。daSilva等2011年研究发现BPV1、BPV2、BPV3、BPV6以及猫科乳头瘤病毒可共同被检测到，结果表明猫科乳头瘤病毒可诱导牛皮肤肿瘤。巴西Batista等人2013年收集60份动物皮肤肿瘤牛乳头状肿瘤，检测到BPV1-6、BPV8-10感染动物，引起皮肤菜花样肿瘤。1.1.8致病机理当动物皮肤受到损伤时，例如金属异物刺伤等使天然保护屏障受损，病毒会随着破溃处进入细胞的基底层。病毒作用于机体细胞，早期转录产生的E5、E6和E7蛋白，使病毒借助宿主细胞DNA复制体系，维持病毒活性DNA复制[58-59]，当环境协同因素作用时，诱使病毒逃避免疫机制，诱发病变；当病毒到达基底干细胞处，病毒粒子在与细胞受体结合后，病毒进行转录与复制，早期转录基因开始病毒的复制，当病毒基因组扩6 塔里木大学硕士学位论文第1章绪论增完成，晚期转录基因L1和L2与其组装成病毒粒子，在感染组织的上皮细胞中表达。即病毒感染发生在基底层未分化的细胞，而病毒基因组的扩增和繁殖包装成病毒颗粒，发生在感染上皮的终末分化层细胞中[60-61]，当包装后的病毒粒子逃避细胞内的免疫捕获，到达细胞上皮并释放，引发动物致病；同时潜伏于基底层的病毒，随外界刺激可诱发机体致病。1.1.9免疫机制病毒的生命周期依赖于上皮细胞，因此患病动物对病毒产生的免疫反应较弱。当患病动物自然感染病毒产生的体液免疫对BPV的持续感染和免疫保护效果不明显，绝大多数感染患畜可以依据天然免疫机制清除病毒，即机体乳头瘤可自行脱落。在感染过程中，细胞介导免疫反应中细胞杀伤作用被激活，将病毒感染的细胞杀死或清除，同时针对BPVL1蛋白的抗体也随之产生。许多个体可以产生足够强的细胞免疫，当同型别BPV再次感染时，细胞免疫发挥了作用[62]。在病毒感染晚期，病毒的衣壳蛋白和E7能诱导较弱的体液免疫和细胞免疫，此时肿瘤一般消失。但具体免疫机制尚不清楚。1.1.10诊断及预防据临床表现、病理观察和流行病学等对牛乳头状瘤病做初步的诊断；应用免疫组化、免疫荧光、血凝试验或ELISA等实验室检测方法，结合临诊资料也能确诊。由于BPV分型较多，对组织的特异性也有差异，因此，分子杂交技术和基于PCR检测的全基因组序列测定分析技术是十分必要的。牛乳头状瘤一般可以自然消退。皮肤体表乳头状瘤瘤体可随机体自身免疫机制逐渐萎缩脱落、自行消散，但当病毒感染严重时，体表缀连成片时，手术也无法彻底根除，不仅影响动物机体正常功能，二次破溃易造成继发感染和种群间传播。现有研究表明，预防和治疗牛乳头状瘤病毒感染的方法主要包括疫苗预防法、外科手术摘除法、中药治疗法等，均有一定的治疗效果，但临床创面容易受到饲养环境限制，引起继发炎症反应，造成预后不良，且多有复发病例报道。因此，疾病主要以预防为主治疗为辅，加强饲养管理，做好患畜隔离饲养，避免混饲。7 塔里木大学硕士学位论文第1章绪论1.2研究意义BPV损害动物皮革质量，降低动物体质，并且当该病发生在家畜生殖器时会损伤公畜和母畜的生殖机能，降低生产性能。近年来，随着饲养规模的不断扩大和外来引种需求，牛乳头瘤病的影响日益严重。牛乳头瘤病毒仅在动物体内复制，很难进行人工培养，而晚期基因区编码衣壳蛋白形成的病毒样颗粒(viruslikeparticles，VLP)能作用机体产生中和抗体，可预防病毒的感染[63]。基于此，依据现代基因工程技术发展基因工程疫苗将会成为未来防控的主要方向。随着分子克隆技术和测序技术的发展与应用，目前研究热点主要围绕BPV全基因组结构特性分析、部分基因组功能以及主要的致癌基因与诱导因子间的相互作用关系和负责参与细胞转化的基因开展。研究发现不论是病毒全基因组还是克隆的部分片段在一定条件作用下均可诱导细胞转化。并且研究表明，细胞转化致癌并不是因为DNA整合导致的，这对研究BPV转化机理具有重要意义。在健康皮肤组织中检测到的病毒，在环境介导下易引发疾病产生，严重的甚至诱发癌症的发生，将导致动物群间感染、死亡并使养殖户受到严重的经济损伤。另外，随着人类尖状湿疣和宫颈癌的发病率的急速上升，BPV可以作为研究HPV感染途径、作用机制、病毒宿主和环境因素之间相互作用关系的体内模型，能够为人乳头瘤病的检测与治疗奠定基础。本研究基于对新疆南疆牛乳头状瘤病的调查研究，分析南疆地区牛感染BPV的基因分型情况。通过对牛乳头状瘤病毒全基因组的序列特征分析，为进一步研究疾病的流行、疫源追溯以及病毒分子遗传演化等提供理论依据。通过对牛乳头状瘤病毒1型的L1基因的研究，构建牛乳头瘤病毒L1基因原核表达体系，对L1基因进行原核表达，为后续研究衣壳蛋白的作用机制，免疫原性和基因疫苗的研发奠定了基础。对牛乳头状瘤病毒1型E6基因的研究，构建牛乳头状瘤病毒的E6基因真核表达体系，对E6基因进行真核表达，为后续研究牛乳头瘤病毒E6蛋白的致癌机制，及蛋白与宿主致病机制之间的相互作用奠定基础。8 塔里木大学硕士学位论文第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析牛乳头瘤病是由牛乳头瘤病毒（Bovinepapillomavirus,BPV）引起的一种肿瘤性疾病[2]。临床上主要表现为患病处有突出体表外的乳头状赘生瘤体，多以1岁左右牛感染发病且表现明显。在牛乳头瘤病毒基因型中，BPV-Ⅰ型和BPV-Ⅱ型可跨种间传播，给动物健康造成影响。因乳头瘤病毒基因型多达13种以上，而临床诊断、病理学检查只能作出初步判断，且无法鉴定病毒基因类型。本研究在临床诊断、组织病理学观察基础上，以乳头状瘤病毒衣壳蛋白L1基因的通用引物MY11/MY09[64]对采集的疑似乳头瘤病料样本进行基因分型鉴定。2.1材料2.1.1试验材料2.1.1.1样品来源样品来源于新疆南疆某养殖户疑似感染患病牛，手术方式收集体表赘生瘤样品，一份保存于4%甲醛溶液中，另一份置于50%的甘油磷酸缓冲液并-20℃保存备用。2.1.1.2主要试剂D2000Marker、2×TapPCRMasterMix、T载体连接试剂盒、普通琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提取试剂盒、6×loadingBuffer、溴化乙锭（EB）购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖（西班牙Biowest）、LB培养基（固、液）、氨苄青霉素购自宝信生物技术有限公司；组织DNA提取试剂盒E.Z.N.A.TissueDNAKit购自Omega公司；其余耗材和试剂为国产或进口的分析纯。2.1.2主要仪器设备本试验中所需仪器设备参见表2-1所示。2.2试验方法2.2.1病理组织学观察取4%甲醛固定的体表赘生瘤，经修块处理后，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、HE染色、脱水、透明、封片后在光学显微镜下观察[44]。9 塔里木大学硕士学位论文第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析表2-1主要仪器和设备Table2-1Themaininstrumentsandequipmentforexperiment仪器设备型号厂家单道微量移液器FinnpipetteF3Thermo科技有限公司37℃培养箱GSP-9080MBE上海博讯有限公司-40℃超低温冰柜DN-HW328中科美菱低温科技有限责任公司梯度PCR仪TC-5000TECHNE小型台式高速冷冻离心机5415REppendorf公司水平电泳仪DYY-12北京市六一仪器厂超净工作台SW-CJ-2FD上海博迅实业有限公司电热鼓风干燥箱GZX-9070MBE上海博迅实业有限公司医疗设备厂隔水式恒温培养箱GHP-9080上海一恒科学仪器有限公司三温三控水浴锅XMTP-204上海博迅实业有限公司医疗设备厂小型台式高速离心机Centrifuge5415REppendorf公司电子分析天平AUY220SHIMADZU公司高压灭菌锅HirayamaHVE-50日本凝胶成像仪ChemiDocMP乌鲁木齐祥生仪器有限公司核酸蛋白测定仪BioDrop-Duo英国柏楉(Biochrom)有限公司制冰机FM180上海楚柏实验室设备有限公司微波炉G70F20CN3L-C2(B0)格兰仕加热制冷循环器JμLaboF12天津市布鲁克科技有限公司-80℃超低温冰柜MDF-U33VSANYO电器集团恒温摇床SHZ-82A金坛市医疗仪器厂超纯水仪Milli-Q上海摩速科学器材有限公司2.2.2引物及参考毒株参考通用引物MY11/MY09，由上海生物工程有限公司合成。本章中所涉及牛乳头瘤病毒参考株见表2-2，通用引物序列参见表2-3。2.2.3病料处理取-20℃保存的赘生瘤体样品，用超纯水洗净病料表面的杂质，在干净灭菌的小平皿内剪至组织块成末状并转移至事先准备的灭菌冷冻研钵内，加入适量超纯水，研磨至液体状态；以每管20~30mg做为标准，于1.5mL灭菌清洁的离心管中分装，做好标记-20℃冻存备用。10 塔里木大学硕士学位论文第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析表2-2GenBank中登录的BPV参考株Table2-2BPVreferencestrainsfromGenBank名称基因型种属登录号BPV-1BostaurusPapillomavirus1DeltapapillomavirusX02346，AB626705BPV-2BostaurusPapillomavirus2DeltapapillomavirusM20219，KC878306.1BPV-3BostaurusPapillomavirus3XipapillomavirusAJ620207BPV-4BostaurusPapillomavirus4XipapillomavirusX05817BPV-5BostaurusPapillomavirus5EpsilonpapillomavirusAJ620206BPV-6BostaurusPapillomavirus6XipapillomavirusAJ620208BPV-7Bostauruspapillomavirus7unnamedNC_007612BPV-8BostaurusPapillomavirus8EpsilonpapillomavirusDQ098913BPV-9BostaurusPapillomavirus9XipapillomavirusAB331650BPV-10BostaurusPapillomavirus10XipapillomavirusAB331651BPV-11BostaurusPapillomavirus11XipapillomavirusAB543507BPV-12BostaurusPapillomavirus12XipapillomavirusJF834523BPV-13BostaurusPapillomavirus13DeltapapillomavirusJQ798171表2-3引物合成Table2-3Primersynthesis，，名称引物序列（5-3）片段大小MY11GGMCAGGGWCATAAYAATGG460bpMY09CGTCCMARRGGAWACTGATC2.2.4病料样品DNA的提取试验操作参照Omega公司E.Z.N.A.TissueDNAKit试剂盒说明进行，具体操作步骤如下：取一管经上述处理后的病料于-20℃反复冻融3次，也可在-80℃下进行；取冻融完毕的病料分别加入220μLBufferTL和25μL蛋白酶OB，充分振荡混匀，水浴锅保持55℃，水浴放置3~5h，期间每隔20min振荡离心管，确保管内样品完全混和均匀；观察管内组织液体，清亮透明后，12000r/min离心5min，吸取上清到新离心管中，注意不要吸取沉淀，弃沉淀，向上清中加入220μLBufferBL，混匀后70℃水浴10min；向上述液体中加入200μL提前预冷的无水乙醇混和均匀，全部液体移入吸附柱中（吸附柱放入收集管内）；静置5min，12000r/min离心30s；弃废液，吸附柱置于新的收集管内，加入500μLHBCBuffer（使用前事先加入无水乙醇，混匀），12000r/min离心11 塔里木大学硕士学位论文第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析30s；加入700μLWBCBuffer（使用前事先加入无水乙醇，混匀），12000r/min离心30s；重复上述步骤；12000r/min离心2min；静置5min，将吸附柱置于干净的离心管中，移液枪吸取75μL70℃预热的ElutionBuffer，垂直悬空加入，静置2min，12000r/min离心2min洗脱病毒DNA；于核酸检测仪内检测收集的DNA核酸浓度，封口，标记，-20℃保存备用。2.2.5PCR检测体系MY11/MY09引物PCR反应体系参照表2-4，加入试剂后混匀，瞬时离心，PCR反应条件参照表2-5进行。表2-4PCR反应体系Table2-4PCRReactionSystem试剂加样量（μL）模板DNA5.0ddH2O18.02×TapMasterMix25.0引物MY111.0引物MY091.0总计50.0表2-5PCR反应条件Table2-5PCRReactionCondition步骤温度时间循环数预变性95℃5min1变性95℃30s退火47.5℃30s35延伸72℃1min总延伸72℃10min1取部分PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，拍照。将剩余PCR样品全部点样，切胶回收，回收步骤参照第4章天根生物技术有限公司普通琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行。2.2.6T载体连接和产物转化感受态细胞取纯化产物，将回收目的片段与PGM-T载体按摩尔比1:3到1:8进行连接，16℃过夜连接。取10μL连接产物加入100μLDH5α（感受态的制备参见附录）中轻弹混匀，12 塔里木大学硕士学位论文第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2~3min。向离心管中加入250~500μL37℃预热的不含抗生素的LB液体培养基，吹打混匀，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管中菌液混匀，吸取100μL到含有氨苄抗性的LB固体培养基上，均匀涂开倒置平板，37℃培养过夜。挑取4~6个白色单菌落分别至5mL含有终浓度50~100μg/mL的氨苄的液体培养基中，180r/min37℃恒温摇床培养过夜，经菌液PCR鉴定后，选取有目的带的菌液，提取质粒送至北京金锘锐杰基因科技有限公司测序。2.2.7序列分析将阳性质粒送样测序，以3次完全相同的结果为标准，作为测序结果，将测序结果于NCBI数据库中进行在线Blastn比对，比对完成后在DNAStar软件MegAlign中与GenBank中下载的BPV参考毒株进行ClustalW核苷酸同源性比对分析；比对后序列与参考序列的L1基因利用MEGA6.0软件采用邻近法行系统发育分析，绘制遗传进化树。2.3试验结果2.3.1临床症状患病牛右前肢关节处至蹄部可见明显体表赘生瘤体，呈结节状纤维乳头状瘤，颜色灰褐色至深褐色，大小不等，于膝关节至蹄部连接成片，质地坚硬，粗糙呈菜花状（图2-1）。图2-1牛乳头状瘤临床症状观察Fig.2-1Clinicalsymptomsofbovinepapillomatosis2.3.2病理组织学观察将保存于4%甲醛溶液中赘生瘤样品，经病理组织切片观察，表皮角质化过度，颗粒细胞部分空泡化，并且存在嗜酸性包涵体（图2-2）[44]。上述病变特征与感染BPV的13 塔里木大学硕士学位论文第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析病理组织变化相似[65]。注：A：箭头所示为细胞空泡化；B：过度角质化图2-2组织病理学观察（HE染色）Note：A：Koilocytesareindicatedbyblackarrows.B：Illustrateepidermalhyperplasiawithmarkedacanthosisinthestratumcorneumandstratumspinosumareseen.Fig.2-2Histopathologicalexaminationofpapillomas2.3.3PCR检测结果提取患病牛体表赘生瘤体样品DNA，通用引物MY11/MY09进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测出与预期大小相符的约为460bp的片段（图2-3）。注：M：DNAmarkerD2000；1：空白对照；2：PCR扩增片段图2-3PCR扩增结果Note:M:DNAmarkerD2000;1:Blankcontrol;2:ThePCRproductFig.2-3TheelectrophoresisresultofthePCRamplification2.3.4BPVL1基因核苷酸序列同源性分析以通用引物MY11/MY09扩增得到的序列，经测序后在NCBI中比对，结果表明，14 塔里木大学硕士学位论文第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析该测序序列与BPV-1型参考株的核苷酸同源性达到99%以上，命名为SY-12，提交NCBI，获得GenBank登录号为：KX271663.1。SY-12与不同基因型的BPV参考株L1基因核苷酸序列同源性如下：与BPV-1型参考株（X02346和AB626705）的核苷酸同源性分别为99.5%和99.1%；与BPV-2型参考株（KC878306）和BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性均为83.5%；而与BPV-3型参考株（AF486184）、BPV-4型参考株（X05817）、BPV-5型参考株（AF457465）、BPV-6型参考株（AJ620208）、BPV-7型参考株（NC-007612）、BPV-8型参考株（DQ098913）、BPV-10型参考株（AB331651）、BPV-11型参考株（AB543507）、BPV-12型参考株（JF834523）、BPV-9型参考株（AB331650）分别为60.8%、56.6%、62.0%、59.0%、59.4%、62.5%、57.3%、57.8%、62.7%、59.7%（图2-4）。图2-4BPVL1基因部分序列核苷酸同源性比较Fig.2-4ComparisonofnucleotidehomologyinpartialsequenceofBPVL1gene2.3.5遗传进化树分析用MEGA6.0软件对SY-12与BPV参考株L1基因同源性比较，Neighbor-JoiningMethod构建遗传进化树，如图2-5。从图中可以看出SY-12与参考株BPV-01型参考株X02346和BPV-1型参考株AB626705位于同一分支为BPV-1型牛乳头瘤病毒，同时与BPV-02型参考株KC878306和BPV-13型参考株JQ798171位于同一分支上为Delta属；BPV-5型参考株（AF457465）和BPV-8型参考株（DQ098913）位于同一分支上为Epsilon属；BPV-3型参考株（AF486184）、BPV-4型参考株（X05817）、BPV-11型参考株（AB543507）、BPV-10型参考株（AB331651）、BPV-9型参考株（AB331650）、BPV-615 塔里木大学硕士学位论文第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析型参考株（AJ620208）、BPV-12型参考株（JF834523）位于同一分支上为Xi属；BPV-7型参考株（NC-007612）为未被定义的PV属[66]。图2-5BPVL1基因部分序列构建遗传进化树Fig.2-5PhylogenetictreeofbovinepapillomavirusbasedonpartialsequencesofL1ORFbyMEGA6.0software.2.4讨论新疆南疆某养殖户疑似感染患病牛，经临床诊断、病理组织切片观察、PCR检测、基因序列分析，确定该患牛感染BPV-1。贺志昊在2014年对新疆北疆地区进行了BPV流行病学的调查，并得出主要流行株为BPV-2[43]；王青青2015年检测出新疆南疆BPV-2型[44]；史巧芸2015年在海南完成了对BPV-13的研究工作[46]；彭昊2016年在广西检测出BPV-1[47]；张海2017年在贵州检测出BPV-2型[67]；证实在国内，新疆地区存在BPV不同基因型感染。常规的临床检查并不能完全的确定该病的发生，易造成漏诊、误诊情况的发生。L1基因是牛乳头瘤病毒基因组中保守的基因片段，被广泛用于基因分型。依据L1基因设计简并引物和通用引物常用于检测乳头状瘤病毒感染，并且应用于乳头瘤病毒基因型鉴定[68]。因此，采用分子生物学检测可确定病毒基因类型，提高疾病检测的准确率。16 塔里木大学硕士学位论文第2章牛乳头状瘤病毒1型SY-12株的基因鉴定及分析参照核苷酸同源性比对分析和系统进化树分析，新疆南疆牛乳头瘤病毒序列SY-12株与BPV-01型参考株（X02346和AB626705）的核苷酸同源性分别为99.5%和99.1%，均为BPV-1型，并且与BPV-02型参考株KC878306和BPV-13型参考株JQ798171位于同一分支上为Delta属。通过核苷酸同源性分析发现，本实验发现SY-12株病毒基因型与BPV-01型参考株X02346的核苷酸同源性达到99.5%，可能具有相同来源，均为Delta属。通过对新疆南疆BPV-1型SY-12株的基因分型鉴定，为下一步研究BPV-1型全长基因序列奠定基础，为后续新疆南疆地区动物感染乳头瘤病毒流行病学研究及病毒基因数据库的建立具有重要意义。2.5结论本试验通过临床诊断、病理组织切片观察，以通用引物MY11/MY09成功扩增并测序出L1基因部分片段，通过与GenBank中序列Blastn在线比对，确定该患病动物为BPV-1型感染。通过DNAStar软件分析核苷酸同源性，确定与BPV-1型参考株（X02346和AB626705）的核苷酸同源性分别为99.5%和99.1%。构建系统进化树，结果显示新疆南疆牛乳头瘤病毒获取序列SY-12与BPV-01型参考株（X02346和AB626705）、BPV-02型参考株KC878306和BPV-13型参考株JQ798171位于同一分支上为Delta属。17 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析牛乳头瘤病毒依据L1基因的保守性可以分为13种不同的基因型，另外还有若干未被分型的假定基因型。依据病毒基因分类将牛乳头状瘤病毒分为4种不同的病毒属，其中BPV-1、BPV-2和BPV-13型属于Delta乳头瘤病毒属；BPV-3、BPV-4、BPV-6、BPV-9、BPV-10、BPV-11和BPV-12为Xi属乳头瘤病毒属；BPV-5和BPV-8为Epsilon属乳头瘤病毒属；及尚未分型的乳头状瘤病毒属BPV7。仅对牛乳头瘤病毒部分基因序列进行分析，难以掌握病毒的遗传特性。因此，本研究从分子水平上对新疆南疆牛乳头瘤病毒1型SY-12株进行全基因组序列测定和基因组结构特征分析，为进一步开展新疆南疆乳头状瘤基因功能研究和疾病疫源追溯奠定基础。3.1材料与仪器3.1.1试验材料-20℃保存于50%甘油磷酸缓冲液中体表赘生瘤体样品。3.1.2主要试剂TaqDNA聚合酶、PCR试剂、血液/细胞/组织DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购于天根生物科技（北京）有限公司；BigDye购于美国应用生物系统公司；AxygenDNA凝胶回收试剂，AXYGEN公司；AxyprepDNAGelEXractionkit，爱思进生物技术（杭州）有限公司。3.1.3试验仪器本试验所需的仪器设备参照表3-1所示。3.2方法3.2.1引物设计与合成依据GenBank中已发表的牛乳头瘤病毒1型参考株全基因组编码序列（NC00152-2和X02346），依据Primer5.0软件设计扩增引物如表3-2所示；测序引物如表3-3所示。所有引物均提交上海生物工程有限公司合成。18 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析表3-1主要仪器和设备Table3-1Themaininstrumentsandequipmentforexperiment仪器设备型号厂家PCR仪TC-5000TECHNE小型高速冷冻离心机Centrifuge5415REppendorf公司电泳仪DYY-12北京市六一仪器厂凝集成像仪GelDocTMXR+Bio-RAD公司单道微量移液器FinnpipetteF3Thermo科技有限公司37℃培养箱GSP-9080MBE上海博讯有限公司核酸蛋白测定仪BioDrop-Duo英国柏楉(Biochrom)有限公司超净工作台SW-CJ-2FD上海博迅实业有限公司加热制冷循环器JμLaboF12天津市布鲁克科技有限公司表3-2扩增引物Table3-2Amplificationprimer扩增引物名称位置上下游引物序列(5′→3′)预期扩增片段/bpSY-12-P1-P26557-6981ntP1：TAACWGTIGGICAYCCWTATT425bpP2：CCWATATCWVHCATITCICCATC6823F：SY-12-6823F-6642R6823-6665nt7789bpGCCTCCTACCTCATCGATATTAGA6642R：ACTCTTTTAGTGGGTTTCCATCTG3.2.2组织病料的处理取-20℃保存的50%甘油磷酸缓冲液中体表赘生瘤体样品，灭菌的超纯水洗去病料表面的杂质，于干净灭菌的小平皿内剪至组织块成末状；将上述组织碎完全转移至事先准备的灭菌冷冻研钵内，加入适量超纯水，研磨至液体状态；以每管20~30mg为量，于清洁灭菌的1.5mL离心管中分装，封口，标记-20℃冻存备用。上述所有操作均在超净工作台内冰上进行，注意无菌操作。3.2.3病料样品DNA的提取经上述操作处理后的样品，-20℃反复冻融3次后提取样品DNA，具体的试验操作步骤参照试剂盒说明书的提取步骤进行。于核酸检测仪内检测收集的DNA核酸浓度，标记后于-20℃冻存备用。19 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析表3-3测序引物Table3-3Sequencingprimers测序引物名称位置测序引物序列(5′→3′)SY-12-631R1-570ntTAGTGGGACCTCGCTTCCTASY-12-421F516-983ntCCTTTCTGCAAAACCAGAGCSY-12-475F643-1056ntAGACATGGTTCAAGGTCCAAATSY-12-1458F860-1420ntAGTTCGAAACTCGCCTCAAASY-12_1327F1381-1920ntCAGTTTTTAAGCTGGGGCTCTSY-12-2454R1820-2396ntAAGGTTTGCACCCGACTATGSY-12_3010R2354-2950ntGTGCGCATGTACAAATTGCTSY-12-3484R2844-3420ntGGCGACTGCTTCTCTTCTTCSY-12-3252F3320-3863ntATCCGAAGGACCTGAAGGAGSY-12-3753F3834-4375ntGCCAAGTCAAAGGCAAGACTSY-12-4629R3940-4570ntGTGGACGAGTCAGTACCTATGGSY-12-4434F4510-4970ntCATCGCTTGCATCAATAGGASY-12-5421R4860-5330ntCACTGGGCTAGCAGGGTAAGSY-12-4832F4910-5550ntGTAGGAGGCTCGGGTTTAGGSY-12_6067R5460-6020ntCAGGGGTACAGCCTAGCAACSY-12-6642R5960-6580ntACTCTTTTAGTGGGTTTCCATCTGM13F6557-6981ntTGTAAAACGACGGCCAGTM13R6557-6981ntCAGGAAACAGCTATGACCSY-12-6823F6920-7092ntGCCTCCTACCTCATCGATATTAGASY-12-7578R7080-7470ntTACTGGTGGCCCGTCTAATCSY-12-127R7438-7946ntCACAGACAGTCCAACCCTGA3.2.4PCR反应扩增体系采用20μLPCR扩增反应体系参照表3-4，混匀后瞬时离心，PCR反应条件参照表3-5进行。表3-4PCR反应体系Table3-4PCRReactionSystem试剂加样量（μL）模板DNA1.0ddH2O15.52×LABuffer2.0引物PrimerF（10mM）0.4引物PrimerR（10mM）0.4总计20.020 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析表3-5PCR反应条件Table3-5PCRReactionCondition步骤温度时间循环数预变性95℃3min1变性95℃30s退火54℃45s32延伸72℃1kb/min总延伸72℃10min13.2.5PCR产物电泳检测制备1.5%琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入100mL1×TBE，微波炉内高火加热4min直至琼脂糖完全融化，混匀后，待温度稍降，瓶内加入10μL溴化乙锭（EB），摇匀。取干净的制胶板，倒胶后缓慢插入梳子，室温静置30min后于电泳液内点样。待电泳结束后，取出胶块，于凝胶成像系统中拍照保存。3.2.6PCR产物的纯化与测序参照AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，具体操作步骤如下：（1）所有PCR产物点样，电泳结束后凝胶成像仪下拍照，准备清洁灭菌的离心管，将含有目的DNA条带的凝胶于紫外仪下切胶回收，称取离心管和胶块的重量，计算胶块重量作为一个凝胶体积（每0.1g的胶块重量为100μL体积）。（2）离心管内加入3个胶体积的BufferDE-A，尽量将胶块碾碎于液体，混匀后于75℃水浴加热直至胶块完全融化，期间不断振荡液体。（3）加入0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，移液器混匀（注：片段小于400bp时，加入1个胶体积量的异丙醇）。（4）将上述步骤中的混合液体，用移液器转移至吸附柱内，吸附柱置于试剂盒提供的离心管内，12000r/min离心1min，弃废液。（5）将吸附柱放回离心管中，加入500μLBufferW1，12000r/min离心30s，弃废液。（6）将吸附柱放回离心管中，加入700μLBufferW2，12000r/min离心30s，弃废液，重复实验操作一次。21 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析（7）将吸附柱放回离心管，12000r/min离心2min。（8）将吸附柱置于试剂盒内提供的新的离心管内，吸附膜中央加入25μL去离子水，室温静置2min，12000r/min离心2min洗脱DNA。将上述回收产物送测序公司测序，测序引物见表3-3。3.2.7数据的拼接及序列分析使用DNASTAR.Lasergene.v7.1进行数据的拼接，拼接序列在NCBI中进行Blastn查询，利用DNAStar软件分析新疆南疆SY-12株全基因序列与GenBank中登录的参考株。用MEGA6.0软件邻近法进行系统发育分析，并绘制遗传进化树。3.3结果3.3.1SY-12株全基因组PCR扩增根据GenBank中BPV-1参考毒株序列（NC001522和X02346），设计扩增引物，对新疆南疆SY-12株进行全基因组扩增，得到1个大的扩增片段，以1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离得到约为7800bp的大片段，结果如图3-1显示。注：M：DL10000Marker；1：空白对照；2：PCR扩增片段图3-1PCR扩增SY-12株全基因组的电泳结果Note:M:DL10000Marker;1:Blankcontrol;2:ThePCRproductFig.3-1PCRamplificationforthecompletegenomeoftheSY-12strain3.3.2SY-12株全基因组测序同源性分析为保证SY-12株全基因组测序结果的准确性，本试验参照BPV-1参考株设计了特异22 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析性扩增引物（表3-2），在对SY-12株基因组进行PCR扩增、测序的基础上，同时又设计了特异性测序引物（表3-3）对SY-12株的PCR产物进行了再测序。DNASTAR.Lasergene.v7.1对测序数据进行拼接，得到SY-12株全基因组序列（登录号为KX907623.1），全长为7946bp，A+T%含量为54.76%，G+C%含量为45.24%。DNASTARMegAlign的ClustalWMethod对SY-12株全基因组与BPV参考毒株序列（表3-6）全基因组比较分析，SY-12株与BPV-1型参考株（X02346和NC001522）的核苷酸同源性达到99.4%、99.4%，与BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306）的核苷酸同源性均达到了87.1%，与BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性达到了85.7%，见图3-2。表3-6GenBank中登录的BPV参考株Table3-6BPVreferencestrainsfromGenBank名称基因型种属登录号BPV-1BostaurusPapillomavirus1DeltapapillomavirusX02346，NC-001522.1BPV-2BostaurusPapillomavirus2DeltapapillomavirusPPB2CG，KC878306.1BPV-3BostaurusPapillomavirus3XipapillomavirusAF486184BPV-4BostaurusPapillomavirus4XipapillomavirusX05817BPV-5BostaurusPapillomavirus5EpsilonpapillomavirusAF457465BPV-6BostaurusPapillomavirus6XipapillomavirusAJ620208BPV-7Bostauruspapillomavirus7unnamedNC_007612BPV-8BostaurusPapillomavirus8EpsilonpapillomavirusDQ098913BPV-9BostaurusPapillomavirus9XipapillomavirusAB331650BPV-10BostaurusPapillomavirus10XipapillomavirusAB331651BPV-11BostaurusPapillomavirus11XipapillomavirusAB543507BPV-12BostaurusPapillomavirus12XipapillomavirusJF834523BPV-13BostaurusPapillomavirus13DeltapapillomavirusJQ7981713.3.3BPV不同基因型系统进化树的构建依据BPV基因组中最保守的，并被广泛用于基因分型的负责编码主要外壳蛋白的L1基因为基准。以不同基因型BPV的L1基因为参照序列，应用MegAlign软件对SY-12株与BPV不同基因型的L1基因序列进行同源性分析，采用MEGA6软件建立相应的系统进化树（图3-3）。BPV不同基因型参考株见表3-6。从进化树上可以看出：SY-12株与BPV-1参考株（X01346和NC-001522.1）位于同一进化分支上，均为BPV-1基因型。同时，与参考株BPV-2型（PPB2CG和KC878306）、BPV-13型（JQ798171）同属Delta属。BPV-5（AF457465）和BPV-8（DQ098913）属23 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析于Epsilon属；BPV-3（AF486184），BPV-4（X05817），BPV-6（AJ620208），BPV-9（AB331650），BPV-10（AB331651），BPV-11（AB543507）和BPV-12（JF834523）同属Xi属，以及还未被定义的PV属BPV-7（NC-007612）。图3-2BPV全基因组序列同源性分析Fig.3-2HomologyanalysesofthecompletegenomicsequenceofBPV注：代表SY-12株图3-3L1基因序列构建的不同基因型BPV系统进化树Note:ReferstoSY-12strainFig.3-3PhylogenetictreeinferredfromtheL1nucleotidesequencesofdifferentgenotypesofBPV24 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析3.3.4SY-12株与参考株全基因组核苷酸序列差异比较通过对SY-12株全基因组与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）比较分析，在4094~4375nt和7643~7916nt之间核苷酸序列有较大差异。图3-4SY-12与参考株基因组核苷酸序列差异比较Fig.3-4ComparisonofnucleotidedifferencesbetweentheSY-12strainandreferencestrainsSY-12株全基因组在4094nt和4100nt处分别为A和C，而参考株（X01346和NC-001522.1）则为T和G；SY-12株全基因组在4112nt、4114nt和4135nt处均为A，而参考株（X01346和NC-001522.1）则为C、G和G；SY-12株全基因组在4198nt和4234nt处分别为G和T，而参考株（X01346和NC-001522.1）则为A和C；SY-12株全基因组在4327nt和4377nt处均为A，而参考株（X01346和NC-001522.1）则为T和G；SY-12株全基因组在7643nt和7645nt处分别为C和A，而参考株（X01346和NC-001522.1）则为A和G；SY-12株全基因组在7681nt和7684nt处均为C，而参考25 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析株（X01346和NC-001522.1）则均为T；SY-12株全基因组在7691nt、7701和7724nt处分别为G、T和A，而参考株（X01346和NC-001522.1）则为A、C和G；SY-12株全基因组在7762nt处为C，而参考株（X01346和NC-001522.1）则出现缺失；SY-12株全基因组在7915nt和7916nt处分别为G和T，而参考株（X01346和NC-001522.1）则为A和G（图3-4）。3.3.5SY-12株与参考株核苷酸和氨基酸同源性分析将SY-12株的E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1和L2的核苷酸、氨基酸分别与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306.1）和BPV-13型参考株（JQ798171）相比较。SY-12株E1基因的核苷酸同源性与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306.1）和BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性分别为99.6%、99.6%、90.6%、90.3%、91.6%，氨基酸同源性分别为99.3%、99.3%、94.5%、95.5%、95.5%；SY-12株E2基因的核苷酸同源性与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306.1）和BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性分别为99.8%、99.8%、94.0%、94.8%、93.9%，氨基酸同源性分别为91.2%、91.2%、93.7%、95.1%、95.4%；SY-12株E4基因的核苷酸同源性与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306.1）和BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性分别为99.4%、99.4%、94.4%、96.5%、96.5%，氨基酸同源性分别为75.2%、75.2%、89.4%、92.9%、93.8%；SY-12株E5基因的核苷酸同源性与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306.1）和BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性分别为99.3%、99.3%、92.6%、92.6%、90.4%，氨基酸同源性分别为97.8%、97.8%、97.8%、97.8%、95.6%；SY-12株E6基因的核苷酸同源性与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306.1）和BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性分别为99.5%、99.5%、87.9%、87.7%、88.9%，氨基酸同源性分别为99.3%、99.3%、83.3%、83.3%、85.5%；SY-12株E7基因的核苷酸同源性与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG26 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析和KC878306.1）和BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性分别为99.7%、99.7%、93.0%、92.2%、92.4%，氨基酸同源性分别为99.2%、99.2%、93.0%、93.0%、93.8%；SY-12株L1基因的核苷酸同源性与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306.1）和BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性分别为99.7%、99.7%、84.5%、84.5%、85.7%，氨基酸同源性分别为99.2%、99.2%、92.5%、92.1%、92.7%；SY-12株L2基因的核苷酸同源性与BPV-1型参考株（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306.1）和BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性分别为99.1%、99.1%、79.2%、79.0%、79.5%，氨基酸同源性分别为98.9%、98.9%、84.2%、84.2%、83.6%。3.3.6SY-12株全基因组结构分析SY-12株全基因组序列与GenBank中BPV-1型参考株全基因组结构进行比较分析，SY-12株含有BPV-1基因型所具有的结构特征，包括三个区域，非编码区（Non-codingregion），即病毒复制转录必要元件的上游调控区（URR）或长控区（Longcontrolregion，LCR区），早期转录区（E区），含6个开放读码框（ORFs）；负责编码衣壳蛋白的晚期基因区（L区），含L1和L2两个ORFs[11-15]。通过与BPV-1型参考序列比对，提交BPV-1型SY-12株全基因组序列至GenBank，获得登录号为KX907623.1。各功能基因位置如下：91~504nt为E6基因，479~862nt为E7基因，849~2666nt为E1基因，2608~3840nt为E2基因，3191~3529nt为E4基因，3879~4013nt为E5基因，4187~5596nt为L2基因，5609~7096nt为L1基因；其余则为非编码区即病毒复制转录的上游调控区和长控区，并且基因组缺失E3和E8基因。在早期转录区，SY-12株基因组的E区含有六个开放阅读框，分别为E6、E7、E1、E2、E4和E5，其中E6、E7和E1基因有部份重叠，E4完全在E2中，在3191～3529nt。结构示意如图3-5所示，具体分析如下。分析SY-12株全基因组序列，具有E1结合位点（AACAAT）EIBS，即非编码区4~9nt和长控区6557~6562nt；在SY-12株全基因组序列具有TATA框（TATAAAA/T），即非编码区58~64nt和7109~7115nt；在SY-12株全基因组序列具有回文结构即BPV非27 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析编码区增强子的序列TCGGTGCACCGA，7627~7638nt；在SY-12株全基因组序列中具有4个核因子结合位点NF-1（TTGGCA），即位于E6基因282~287nt、E4基因3469~3474nt、L2基因4732~4737nt和非编码区7326~7331nt处；在SY-12株全基因组序列中存在4个多腺苷酸化信号PolyA（AATAAA），即晚期转录区4180~4185nt和6434~6439nt处，非编码区7092~7097nt和7156~7161nt处。在SY-12株全基因组序列中存在10个E2结合位点（E2BS）的共有序列ACC-N[69]6-GGT，即位于早期转录区基因E1的2396~2407nt处，非编码区的7203~7214nt、7365~7376nt、7408~7419nt、7510~7521nt、7591~7602nt、7620~7631nt、7760~7771nt、7781~7792nt、7896~7907nt。在SY-12株全基因组序列中存在19个六T串联区（TTTTTT），即非编码区26~31nt处，位于早期转录区基因E1的1455~1460nt、1889~1894nt、2048~2053nt、2049~2054nt、2192~2197nt、2546~2551nt、2547~2552nt，位于早期转录区基因E5的3957~3962nt，位于晚期转录区基因L2的4123~4128nt，跨L2基因与非编码区的5597~5602nt，位于非编码区的5598~5603nt和5599~5604nt，位于晚期转录区基因L1的5703~5708nt和6338~6343nt，位于非编码区的7438~7443nt、7439~7444nt、7440~7445nt、7924~7929nt。在SY-12株全基因组序列中存在23个六A串联区（AAAAAA），位于非编码区的40~45nt，位于早期转录区基因E6的384~389nt，位于早期转录区基因E1的1510~1515nt、2120~2125nt、2121~2126nt、2122~2127nt、2123~2128nt，位于早期转录区基因E2的2749~2754nt，位于晚期转录区基因L2的5575~5580nt、5576~5581nt，位于晚期转录区基因L1的6166~6171nt、7056~7061nt、7078~7083nt、7079~7084nt、7080~7085nt、7081~7086nt、7082~7087nt、7083~7088nt、7084~7089nt、7085~7090nt、7086~7091nt、7087~7092nt、7088~7093nt。28 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析TGTTACTGATCGTCTAGAAAATGGCGCCTGCCCTCCTCTTGAATTAAAAAACAAGCACATAGAAGATGGGGATATGATGGAAATTGGGTTTGGTGCAGCCAACTTCAAAGAAATTAATGCAAGTAAATCAGATCTACCTCTTGACATTCAAAATGAGATCTGCTTGTACCCAGACTACCTCAAAATGGCTGAGGACGCTGCTGGTAATAGCATGTTCTTTTTTGCAAGGAAAGAACAGGTGTATGTTAGACACATCTGGACCAGAGGGGGCTCGGAGAAAGAAGCCCCTACCACAGATTTTTATTTAAAGAATAATAAAGGGGATGCCACCCTTAAAATACCCAGTGTGCATTTTGGTAGTCCCAGTGGCTCACTAGTCTCAACTGATAATCAAATTTTTAATCGGCCCTACTGGCTATTCCGTGCCCAGGGCATGAACAATGGAATTGCATGGAATAATTTATTGTTTTTAACAGTGGGGGACAATACACGTGGTACTAATCTTACCATAAGTGTAGCCTCAGATGGAAACCCACTAAAAGAGTATGATAGCTCAAAATTCAATGTATACCATAGACATATGGAAGAATATAAGCTAGCCTTTATATTAGAGCTATGCTCTGTGGAAATCACAGCTCAAACTGTGTCACATCTGCAAGGACTTATGCCCTCTGTGCTTCAAAATTGGGAAATAGGTGTGCAGCCTCCTACCTCATCGATATTAGAGGACACCTATCGGTATATAGAGTCTCCTGCAACTAAATGTGCAAGCAATGTAATTCCTGCAAAAGAAGACCCTTATGCAGGGTTTAAGTTTTGGAACATAGATCTTAAAGAAAAGCTTTCTTTGGACTTAGATCAATTTCCCTTGGGAAGAAGATTTTTAGCACAGCAAGGGGCAGGATGTTCAACTGTGAGAAAACGAAGAATTAGCCAAAAAACTTCCAGTAAGCCTGCAAAAAAAAAAAAAAAATAAAAGCTAAGTTTCTATAAATGTTCTGTAAATGTAAAACAGAAGGTAAGTCAACTGCACCTAATAAAAATCACTTAATAGCAATGTGCTGTGTCAGTTGTTTATTGGAACCACACCCGGTACACATCCTGTCCAGCATTTGCAGTGCGTGCATTGAATTATTGTGCTGGCTAGACTTCATGGCGCCTGGCACCGAATCCTGCCTTCTCAGCCAAAATGAATAATTGCTTTGTTGGCAAGAAACTAAGCATCAATGGGACGCGTGCAAAGCACCGGCGGCGGTAGATGCGGGGTAAGTACTGAATTTTAATTCGACCTATCCCGGTAAAGCGAAAGCGACACGCTTTTTTTTCACACATAGCGGGACCGAACACGTTATAAGTATCGATTAGGTCTATTTTTGTCTCTCTGTCGGAACCAGAACCGGTAAAAGTTTCCATTGCGTCTGGGCTTGTCTATCATTGCGTCTCTATGGTTTTTGGAGGATTAGACGGGCCACCAGTAATGGTGCATAGCGGATGTCTGTACCGCCATCGGTGCACCGATATCGATTTGGGGCTCCCCAAGGGACTGCTGGGATGACAGCTCCACATTATGTTGAATGGGTGCATAATCAGCTTAATTGGTGAAGACAAGCTACAAGTTGTAACCTGATCTCCACAAAGTACCGTTGCCGGTCGGGGTCAAACCGTCTTCGGTGCTCGAAACCGCCTTAAACTACAGACAGGTCCCAGCCAAGTAGGCGGATCAAAACCTCAAAAAGGCGGGAGCCAATCAAAATGCAGCATTATATTTTAAGCTCACCGAAACCGGTAAGTAAGTACTATGTATTTTTTCCCAGTGAATAATTGTT图3-5SY-12基因组结构图Fig.3-5StructureofcompletegenomicsequenceoftheSY-12strain29 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析注：A：SY-12株基因组结构示意图序列代表上游调控区的各结构，红色加粗代表E1结合位点（AACAAT）EIBS；绿色加粗下划线代表TATA框（TATAAAA/T）；黄色背景代表回文结构（TCGGTGCACCGA）；蓝色加粗下划线代表核因子结合位点NF-1（TTGGCA）；方框内代表多腺苷酸化信号PolyA（AATAAA）；加粗下划线代表E2结合位点（E2BS）的共有序列（ACC-N6-GGT）；双下划线代表六T串联区（TTTTTT）；灰色背景波浪线代表六A串联区（AAAAAA）。Note：A：GenomicstructureofAks-01.Upstreamregulatoryregion.BoldandredtextsdenotetheNF-1(TTGGCA).BoldandgreentextsdenotestheTATAbox[TATA(A/T)A(A/T)].Shadedboxesofyellowdenotethepalindromestructure(TCGGTGCACCGA).BoldandbluetextsdenotestheNF-1(TTGGCA).Therectangledenotespolyadenylationsignals(AATAAA).BoldandunderlinedenotestheE2-bindingmotif[ACC-N6-GGT].AdoubleunderlinedenotestheseriesofTTTTTT.WavylinesandshadedboxesdenotetheseriesofAAAAAA.SY-12株氨基酸序列中，E6(图3-6)和E7（图3-7）蛋白的氨基酸序列中出现典型[48]，E2蛋白缺乏亮氨酸拉链结构（LX[70]的锌指结构（CX2CX29CX2C）6LX6LX6LX6L）。MDLKPFARTNPFSGLDCLWCREPLTEVDAFRCMVKDFHVVIREGCRYGACTICLENCLATERRLWQGVPVTGEEAELLHGKTLDRLCIRCCYCGGKLTKNEKHRHVLFNEPFCKTRANIIRGRCYDCCRHGSRSKYP.Note:Boldfacelettersdenotethezincfingersoftheamino-acidsequenceofE6protein(CX2CX29CX2C)图3-6E6蛋白氨基酸序列的锌指结构Fig.3-6Zincfingersoftheamino-acidsequenceofE6proteinMVQGPNTHRNLDDSPAGPLLILSPCAGTPTRSPAAPDAPDFRLPCHFGRPTRKRGPTTPPLSSPGKLCATGPRRVYSVTVCCGNCGKELTFAVKTSSTSLLGFEHLLNSDLDLLCPRCESRERHGKR.Note:Boldfacelettersindicatethezincfingersoftheamino-acidsequenceofE7protein(CX2CX29CX2C)图3-7E7蛋白氨基酸序列的锌指结构Fig.3-7Zincfingersoftheamino-acidsequenceofE7protein3.4讨论乳头瘤病毒（PapillomaVirus，PV）是一类闭合环状的DNA致瘤病毒，BPV是PV家族成员之一。根据对BPV核苷酸同源性分析，已确定BPV有13个基因型以及若干未分类的假定基因型，而这些牛乳头状瘤病毒主要包含在四个不同的属内：Delta属、Epsilon属、Xi属以及还未被定义的PV属（BPV-7）。本试验依据第2章中应用一对通用引物对新疆南疆某农户的患牛病料进行了病毒的PCR法检测，检测结果为牛乳头状瘤病毒基因1型。采用特异性扩增引物和测序引物对SY-12株全基因组序列进行测序，成功克隆BPV-1-SY-12的全长序列，SY-12株全基因组与BPV参考毒株序列全基因组核30 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析苷酸序列比较分析显示，BPV-1型SY-12株与参考株BPV-1型（X01346和NC-001522.1）、BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306.1）和BPV-13型（JQ796171）的核苷酸同源性达到了99.4%、99.4%、87.1%、87.1%和85.7%，并同属Delta属。结果显示SY-12株全基因组与BPV-1参考毒序列核苷酸序列存在着部分差异，但是新疆南疆SY-12株可能与BPV1-X01346和BPV1-NC-001522.1流行株具有相同的来源。对BPV-1-SY-12全基因组序列分析，全基因组长为7946bp，A+T%含量为54.76%，G+C%含量为45.24%，共有8个开放阅读框，即6个早期编码区和2个晚期编码区依次为E6、E7、E1、E2、E4、E5、和L1、L2。其中E6与E7基因部分片段重叠，E7和E1基因部分重叠，E1和E2基因部分重叠，E4基因完全包含在E2基因内。对SY-12全基因组分析，在早期转录区存在2个核因子结合位点NF-1（TTGGCA），在晚期转录区和上游调控区各有1个核因子结合位点NF-1（TTGGCA），在非编码区和长控区各有1个E1结合位点（AACAAT）EIBS，在非编码区和上游调控区各具有1个TATA框（TATAAAA/T），在上游调控区具有BPV非编码区增强子的序列TCGGTGCACCGA即回文结构，在晚期转录区中存在2个多腺苷酸化信号PolyA（AATAAA），在上游调控区存在2个多腺苷酸化信号PolyA（AATAAA）。在SY-12株全基因组序列中存在10个E2结合位点（E2BS）的共有序列ACC-N[71-75]6-GGT，主要位于早期转录区和上游调控区。在SY-12株全基因组序列中存在多个六T串联区（TTTTTT）和六A串联区（AAAAAA），并且在SY-12株氨基酸序列中，在E6和E7蛋白的氨基酸序列中均出现典型的锌指结构（CX[48]2CX29CX2C）。目前认为该结构是细胞内核酸结合蛋白所具备的特异性结构，因而认为E6、E7蛋白是DNA结合蛋白，可以调节基因的活性，进一步影响宿主细胞的增殖和分化，使该过程失去控制而形成肿瘤[48]。目前对牛乳头瘤病毒的研究多集中针对功能基因和基因型鉴定的方向，随着分子生物学的发展，从分子水平上阐明乳头状瘤病毒不同基因型和基因结构成为可能。新疆南疆SY-12株全基因组序列的测定，对我国以及新疆地区的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律和遗传演化起到重要的作用。31 塔里木大学硕士学位论文第3章牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析3.5结论本试验依据第2章中已鉴定的BPV-1基因型，设计扩增引物和测序引物，成功克隆出牛乳头瘤病毒1型SY-12株全长基因组。通过与参考序列比对分析，确定SY-12株为牛乳头瘤病毒1型，序列全长7946bp，A+T%含量为54.76%，G+C%含量为45.24%，具有BPV的功能基因结构，即6个早期编码区基因E6、E7、E1、E2、E4、E5和2个晚期编码区基因L1和L2。与参考序列BPV-1参考株（X01346和NC-001522.1）、参考株BPV-2型（PPB2CG和KC878306）和BPV-13型（JQ798171）同属Delta属牛乳头瘤病毒。32 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达BPV的基因组主要由早期转录区、晚期转录区和长控区3部分组成，其中L1基因位于晚期转录区具有良好的免疫原性，因此可以作为基因工程疫苗的候选基因。本研究以BPV-1型L1基因为目的基因，设计一对特异引物扩增该基因，将获得的目的基因序列构建在pET32a表达载体中，在宿主菌BL21中进行体外诱导表达，以期获得L1蛋白，为后续基因工程疫苗的研究奠定基础。4.1材料与仪器4.1.1材料保存于-20℃冰箱中的牛乳头状体表赘生物样品。4.1.2试剂大肠埃希菌DH5α、BL21（DE3）、原核表达载体pET-32a，均由本实验室保存。2×TaqpfuPCRMastermix，PGM-T载体连接试剂盒，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒，质粒小提取试剂盒，低分子量蛋白MARK均购自天根生物技术有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ，XholⅠ购自大连宝生物（TATARA）公司；E.Z.N.A.Cycle-PureKit、E.Z.N.A.TissueDNAKit购自美国OMEGA公司；蛋白MARK购自Thermo生物科技公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购自北京索来宝生物技术有限公司；醋酸纤维膜、Westernblot试剂购自博士德生物技术有限公司；Anti-HPVantibody(BPV-1/1H8+CAMVIR)单克隆抗体购自Abcom公司，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自北京中彬金桥生物技术有限公司；显影定影试剂盒，超敏ECL化学发光即用型底物购自博士德生物技术有限公司；琼脂糖、甘氨酸、SDS、琼脂粉、Trisbase、溴化乙锭、TEMED、IPTG等均购自北京天根生物工程技术服务有限公司；LB培养基（固、液）和氨苄购自宝信生物技术有限公司；其余耗材试剂为国产或进口的分析纯试剂。4.1.3仪器设备试验所需仪器设备参照表4-1。33 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达表4-1主要仪器和设备Table4-1Themaininstrumentsandequipmentforexperiment仪器名称型号生产公司单道微量移液器FinnpipetteF3Thermo科技有限公司梯度PCR仪TC-5000TECHNE有限公司梯度PCR仪Thermo科技有限公司恒温水浴锅DK-8D上海博讯实业有限公司超净工作台SW-CJ-2FD上海博迅实业有限公司电子分析天平AUY220SHIMADZU公司核酸蛋白测定仪BioDrop-Duo英国柏楉(Biochrom)有限公司灭菌枪头AXYGEN生物技术有限公司电泳仪DYY-7C北京市六一仪器厂凝胶成像仪ChemiDocMP乌鲁木齐祥生仪器有限公司制冰机FM180上海楚柏实验室设备有限公司微波炉G70F20CN3L-C2(B0)格兰仕小型高速冷冻离心机centrifuge5415R北京智杰方远科技有限公司37℃培养箱GSP-9080MBE上海博讯有限公司-80℃超低温冰柜MDF-U33VSANYO电器集团垂直电泳仪美国Bio-Rad公司蛋白转印系统美国Bio-Rad公司加热制冷循环器JμLaboF12天津市布鲁克科技有限公司电热鼓风干燥箱GZX-9070MBE上海博讯实业有限公司医疗设备厂隔水式恒温培养箱GHP-9080上海一恒科学仪器有限公司恒温培养摇床振荡器ZHWY-200D上海智诚分析仪器制造有限公司高压锅HirayamaHVE-50HIRYAMA4.2方法4.2.1引物的设计与合成依据GenBank中已发表的牛乳头瘤病毒1型全基因组编码序列（KX907623.1）中的L1基因，利用Primer5.0软件设计1对上游下游分别含有EcoRⅠ和XholⅠ限制性内切酶位点的引物如下。上游引物：5’-ATGAATTCATGGCGTTGTGG-3’（下划线为酶切位点）；下游引物：5’-CCGCTCGAGGTGCAGTTGACTTACCTTCTG-3’（下划线为酶切位点）。引物送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。4.2.2牛乳头瘤病毒1型L1基因的扩增与回收-20℃冻存DNA为模板进行PCR扩增，采用50μL反应体系参照表4-2，混匀后瞬时离心，PCR反应条件参照表4-3进行。34 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达表4-2PCR反应体系Table4-2PCRReactionSystem试剂加样量（μL）模板DNA5.0ddH2O18.02×TappfuPCRMasterMix25.0引物PrimerF1.0引物PrimerR1.0总计50.0表4-3PCR反应条件Table4-3PCRReactionCondition步骤温度时间循环数预变性95℃5min1变性95℃30s退火58℃45s35延伸72℃1min30s总延伸72℃10min1取部分扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。电子天平称取0.25g琼脂糖加入锥形瓶中，量取25mL1×TAE工作液加入锥形瓶中，混匀微波炉高火加热1min使琼脂糖完全溶解，待温度稍降低后加入2.5μL的溴化乙锭，混匀后倒胶，待凝胶凝固后，胶块置于电泳槽内进行点样，Marker和PCR后样品各5μL，120V，110mA，电泳25min后照胶。将剩余全部PCR样品参照上述操作全部点样后，参照北京天根生物技术服务有限公司的普通琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，操作步骤如下：（1）紫外仪下将所需目的片段DNA条带位置切下，放入事先准备好的高压灭菌的干净的离心管中，称重；（2）按照每0.1g凝胶加入100μL溶胶液PN，将称重后的胶块内加入等体积的PN，50℃水浴加热直至完全溶解，期间多次振荡保证溶解充分；（3）吸附柱于收集管内，加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，弃废液，吸附柱放回收集管内；（4）待胶块完全溶解后，温度降至室温，将全部的液体加入上一步处理好的吸附35 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达柱内，静置2min，12000r/min离心1min，弃废液，吸附柱放回收集管内；（5）向吸附柱内加入600μL漂洗液PW，静置2min，12000r/min离心1min，弃废液，吸附柱放回收集管内；重复以上操作一次；（6）吸附柱放回收集管内，12000r/min离心2min，尽量除尽漂洗液，静置8min，将漂洗液彻底晾干，防止漂洗液残留对后续实验结果产生影响；（7）吸附柱放于高压灭菌的离心管中，向吸附膜中央悬空加入75μL的洗脱液EB，室温静置5min，12000r/min离心2min收集DNA溶液。-20℃冻存备用。4.2.3连接载体测序将回收目的片段与PGM-T载体按摩尔比1：8进行连接，16℃过夜连接。取10μL连接产物加入100μLDH5α中轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min30s。向离心管中加入500μL不含抗生素37℃预热的LB液体培养基混匀，37℃、180r/min振荡培养45min。将离心管中菌液混匀，吸取100μL至含有氨苄抗性的LB固体培养基上，均匀涂开倒置平板，37℃培养过夜。挑取白色单菌落至5mL含有终浓度50~100μg/mL的氨苄的液体培养基，37℃培养过夜，菌液PCR后提取质粒送至北京金锘锐杰基因科技有限公司测序，将测序正确的序列与GenBank中BPV-1L1基因序列进行比对分析。4.2.4L1蛋白结构预测分析用DNAstar软件对测序得的牛乳头瘤病毒1型新疆南疆SY-12株L1基因序列推测其可能的氨基酸序列，并对其组成和结构进行分析。(1)一级结构分析：用ExPASyTools软件在线分析L1蛋白的一级结构。(2)二级结构分析：用ExPASyTools软件中的SOSUI分析工具，分析L1蛋白的二级结构。(3)三级结构分析：用ExPASyTools软件中的SWISS-MODEL和Phyre分析工具，对L1蛋白的三级结构进行分析。36 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达4.2.5原核表达载体的构建4.2.5.1双酶切纯化测序正确的目的片段和原核表达载体pET32a分别使用限制性内切酶EcoRⅠ/XhoⅠ进行双酶切。载体为50μL反应体系，反应体系如下：载体40μL，10×buffer5μL，ddH2O3μL，EcoRⅠ1μL，XhoⅠ1μL；目的片段40μL反应体系，反应体系如下：胶回收产物20μL，10×buffer5μL，ddH2O11μL，EcoRⅠ2μL，XhoⅠ2μL。PCR管内加入上述反应物后混匀，置于恒温水浴锅内37℃双酶切3h，3h后酶切产物参照E.Z.N.A.Cycle-PureKit纯化回收试剂盒（OMEGA公司）分别回收目的片段和载体，步骤如下：（1）依据酶切产物与BufferCP溶液1:5的比例向载体中加入BufferCP溶液250μL、目的片段中加入200μL；（2）上述液体于离心管内分别混匀，分别全部加入吸附柱CA2中（吸附柱置于收集管中），12000r/min离心1min，弃废液，吸附柱放回收集管中；（3）加入700μL漂洗液WB，12000r/min离心1min，弃废液，吸附柱放回收集管中，重复操作1次；（4）吸附柱放回收集管中，12000r/min离心3min，除尽漂洗液，静置5min，彻底晾干；（5）将吸附柱置于干净的离心管中，向吸附膜的中间悬空分别滴加30μL(35μL)缓冲洗脱液EB，室温放置2min，12000r/min离心2min收集DNA溶液，-20℃保存。4.2.5.2连接转化取上述操作中纯化产物进行连接转化，按照10μL连接体系进行；反应体系如下：纯化后DNA片段5μL，纯化后载体1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigasebuffer1μL，ddH2O2μL；阴性对照反应体系如下：纯化后载体1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigasebuffer1μL，ddH2O7μL；上述反应物混匀后于16℃水浴过夜连接。冰上准备感受态细胞DH5α融化备用，感受态细胞DH5α的制法参见附件3；取出连接产物在超净工作台中将两管连接产物分别加入感受态细胞中，轻弹混匀并标记，冰浴37 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达30min；42℃热激90s；冰浴2~3min；加入500~800μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃180r/min摇菌60min；结束后8000r/min离心5min，弃上清，剩余部分液体混匀吸取100μL含有菌体的液体，用灭菌涂布棒均匀涂于Ampr板上，至完全吸收后标记，恒温培养箱内37℃倒置过夜培养。4.2.5.3PCR鉴定挑取Ampr板上10~15个单菌落接种于Ampr终浓度(50μg/mL)LB液体培养基中过夜摇菌，做菌液PCR进行鉴定，并进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果中出现阳性条带即选取最亮的2~4个，吸取相应的菌液100μL到5mL含Ampr(50μg/mL)LB液体培养基进行摇菌，为提质粒备用。质粒提取参照北京天根生物技术有限公司质粒小提取试剂盒进行，操作步骤如下：(1)取5mL菌瓶内过夜培养菌液，收集到同一个离心管中，12000r/min离心1min，尽除上清；(2)沉淀中加入300μL预冷的溶液P1(第一次用之前加RNaseA)，彻底悬浮细菌沉淀；(3)离心管中加入300μL溶液P2，立即温和地充分上下翻转6~8次；再加入400μL溶液P3，出现白色絮状物质，立即温和地上下翻转6~8次，12000r/min离心10min；(4)柱平衡步骤：吸附柱(放入收集管中)加500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中(当天处理当天使用)；(5)将步骤(3)的上清液全部加入吸附柱中，不能吸到沉淀。12000r/min离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；(6)加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复操作1次；(7)吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min；(8)吸附柱放入干净的离心管中，向吸附膜的中间悬空滴加75μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000r/min离心2min，标记后-20℃保存。38 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达4.2.5.4重组质粒的鉴定提取的质粒命名为pET-32a-L1，做双酶切鉴定，并将鉴定为阳性的质粒分装送北京金锘锐杰基因科技有限公司进行测序鉴定。4.2.6牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达与检测将上述测序成功的重组质粒pET-32a-L1转化到BL21感受态细胞中（DE3）中，感受态的制备方法详见附录，并用空载体pET-32a做阴性对照，具体操作如下：在超净工作台中将重组质粒pET-32a-L1和空载体pET-32a各取5μL分别加入100μLBL21感受态细胞中，轻弹混匀并标记，冰浴30min；42℃热激90s；冰浴2~3min；加入500~800μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃180r/min摇菌60min；结束后8000r/min离心5min，弃上清，剩余部分液体混匀吸取100μL含有菌体的液体，用灭菌涂布棒均匀涂于Ampr板上，至完全吸收后标记，恒温培养箱内37℃倒置过夜培养。37℃恒温培养箱培养过夜后，挑选单菌落在含Ampr+的5mL液体LB培养基中活化过夜，取50μL菌液重新在含Ampr+的5mL液体LB培养基中活化3h，加3μLIPTG（100μL/mL），6h后停止摇菌，4℃离心收集菌液1mL得到菌体，用预冷的PBS洗涤菌体两次，最后加入100μLPBS和100μL蛋白上样缓冲液，混匀煮沸10min，4℃冰箱冷却后做SDS-PAGE分析。SDS-PAGE凝胶的配制如表4-4，4-5。表4-412%SDS-PAGE分离胶的配制Table4-412%SDS-PAGEpreparationoftheseparationgel试剂加入量（mL）H2O1.6530%Acr-Bis(29:1)2.01.5mol/1Tris.cl(PH8.8)1.2510%SDS0.0510%AP0.05TEMED0.002Total5.0待分离胶配置完毕后向玻璃板间灌制分离胶后立即覆盖一层超纯水，30min后可以看到明显分层，将水倒掉后用滤纸吸干，将配制好的浓缩胶混匀后灌制玻璃板间，并立即插入梳子，静置1h，组装好电泳系统，加入电泳缓冲液后检测电泳槽是否漏液，小心39 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达拔取梳子，Marker5μL，蛋白样品10μL，80V跑完浓缩胶后调120v跑完胶，待出现溴酚蓝指示线后结束电泳，卸下胶板，凝胶用考马斯亮蓝室温下染色1h后脱色，置于脱色摇床上过夜，期间多次更换脱色液直至背景清晰，拍照保存。表4-5SDS-PAGE浓缩胶的配制Table4-5PreparationofSDS-PAGEConcentratedgel试剂加入量（mL）H2O2.030%Acr-Bis(29:1)0.51.0mol/1Tris.cl(PH6.8)0.510%SDS0.0410%AP0.03TEMED0.004Total3.04.2.7IPTG诱导浓度的比较挑选单菌落在含Ampr+的5mL液体LB培养基中活化过夜，准备5个菌瓶，每瓶取60μL菌液重新在含Ampr+的6mL液体LB培养基中活化3h，3h后移液枪吸取1mL，作诱导前对照；分别加入IPTG（100μL/mL）至终浓度0.4、0.6、0.8、1.0mM，37℃诱导6h后停止摇菌，4℃离心收集菌液1mL得到菌体，用预冷的PBS洗涤菌体两次，最后加入100μLPBS和100μL蛋白上样缓冲液，混匀煮沸10min，4℃冰箱冷却后做SDS-PAGE分析。4.2.8诱导时间的优化挑选单菌落在含Ampr+的5mL液体LB培养基中活化过夜，准备5个菌瓶，每瓶取60μL菌液重新在含Ampr+的6mL液体LB培养基中活化3h，3h后移液枪吸取1mL，作诱导前对照；每瓶内加入IPTG（100μL/mL）至终浓度1.0mM，37℃诱导，每1h收样1mL连续收样6h，4℃离心收集菌液1mL得到菌体，用预冷的PBS洗涤菌体两次，最后加入100μLPBS和100μL蛋白上样缓冲液，混匀煮沸10min，4℃冰箱冷却后做SDS-PAGE分析。4.2.9重组蛋白可溶性分析挑选单菌落在含Ampr+的5mL液体LB培养基中活化过夜，取50μL菌液重新在含Ampr+的5mL液体LB培养基中活化3h，3h后移液枪吸取1mL，作诱导前对照；加入IPTG40 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达（100μL/mL）至终浓度1.0mM，37℃诱导4h后停止摇菌，4℃离心分别收集上清和沉淀，用预冷的PBS分别洗涤菌体两次，最后分别加入100μLPBS和100μL蛋白上样缓冲液，混匀煮沸10min，4℃冰箱冷却后做SDS-PAGE分析。4.2.10牛乳头瘤病毒1型L1蛋白的提取与纯化按4.2.6的方法将菌体扩大到200mL含有Ampr+抗性的液体LB培养基中培养，4℃离心回收菌体，用预冷的PBS洗涤2次后离心收集菌体，加5mLLysisBuffer，在-80℃冰箱中10min后置室温解冻。反复3次后用超声波破碎3次，4℃低温12000r/min离心30min，取沉淀，参照北京康为世纪有限公司His标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）纯化说明书操作进行，操作如下：（1）将超声处理后的蛋白沉淀重悬于预冷的BindingBuffer缓冲液中，使包涵体充分溶解；（2）10000r/min离心20min，收集上清；（3）将Ni-AgaroseResin填料混匀后加入层析柱，使用前先混匀，移液枪吸取1mL加入层析柱后室温静置10min，待溶液和凝胶产生明显分层后打开层析柱底部，让乙醇缓慢流出；（4）加入5倍柱体积的去离子水，洗脱乙醇，再用8倍柱体积的BindingBuffer平衡层析柱，平衡结束后将制备好的蛋白样品通过蠕动泵上样；（5）将事先准备好的蛋白样品负载上柱，流速依据实际操作调节，收集流穿液，标记-20℃冻存备用；（6）15倍柱体积的BindingBuffer冲洗柱子，洗除杂蛋白；（7）使用适量ElutionBuffer洗脱，收集洗脱峰，每1mL收集1管，标记-20℃冻存备用；（8）洗脱结束，5倍柱体积的BindingBuffer冲洗柱子，5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡层析柱，封柱后4℃保存。4.2.11纯化蛋白Westernblot分析将纯化后蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，待出现溴酚蓝指示线移至凝胶底部时停止41 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达电泳。用制备滤纸和PVDF膜，将滤纸、凝胶和转移板内膜在事先配制好的转移缓冲液（0.037%SDS、48mmol/LTris，39mmol/L甘氨酸）中浸泡5min，PVDF膜在甲醛溶液中活化30s，在ddH2O中漂洗10次去除甲醛；按照滤纸、PVDF膜、滤纸的顺序依次将它们叠放在一起，注意要除去它们之间的气泡，按凝胶侧靠阴极、PVDF膜侧靠阳极将它们放入转印槽中，120V电转移1.5h；注意不断加碎冰覆盖避免电转液过热对试验结果造成影响。蛋白转印结束后，取出PVDF膜，标记好蛋白面。先将膜在封闭液中封闭2h，再将膜在含有抗1型牛乳头瘤衣壳蛋白抗体Anti-HPVantibody(BPV-1/1H8+CAMVIR)的封闭试剂(TBS)中孵育1h，用PBST洗涤5次，每次5min，再用特定的HRP标记的羊抗鼠二抗即辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)孵育2h，用PBST洗涤5次，每次5min；使用ECM(免疫印迹增强化学发光法)显色，显影结束后，于暗室内准备显影液、定影液、胶片，按照操作步骤对Westernblot结果进行胶片显影。具体操作如下：将清洗干净的PVDF膜置于暗盒内，暗盒内提前铺好干净的保鲜膜，参照超敏ECL化学发光即用型底物，提前将试剂平衡至室温，制备工作液，将平衡至室温的A液和B液等体积混合至试剂提供的滴瓶内，用量为A、B两液各250μL，将配好的发光底物工作液均匀滴加在印迹膜上，注意印迹膜上蛋白面朝上，合上暗盒将印迹膜（PVDF膜）与工作液暗孵育1~10min，依据胶片曝光自己控制反应时间，将洁净的保鲜膜平整铺在孵育工作液的印迹膜上，避免起泡，在暗室内取一张X胶片剪成合适大小，小心置于暗盒内的印迹膜上，曝光5s至1min立即显影定影，将X光片完全浸于显影液内，显影10s至10min，注意完全避光，在清水中冲洗干净，完全除尽显影液，胶片浸没与定影液内，定影1~3min，在清水中冲洗干净去除残留液。4.3结果4.3.1牛乳头瘤病毒1型L1基因的PCR扩增以BPV-1型病毒基因组为模版，设计L1基因特异性引物，产物经1%琼脂糖凝胶，结果表明，PCR产物扩增大小为1488bp，与预期目的片段大小相符，未见非特异性扩增条带（图4-1）。42 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达注：M:DL2000Maker；1:阴性对照；2:BPV1L1基因PCR扩增产物；图4-1BPV1L1PCR产物电泳结果Note:M:DL2000Maker;1:negativecontrol;2:PCRproductofBPV1-L1Fig.4-1ElectrophoresisresultsofBPVL1DNAPCRproducts4.3.2基因序列分析经测序后，获得L1基因全长序列，序列长度为1488bp，与BPV-1参考株（X02346和NC001522）核苷酸同源性均达到99.7%，氨基酸同源性均达到99.2%；与BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306）的核苷酸同源性均达到了84.5%，氨基酸同源性分别为92.5%、92.1%；与BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性达到了85.7%；氨基酸同源性为92.7%。L1基因与BPV-1参考株（X02346和NC001522）相比，5处发生突变：A135G、C1043A、C1052A、G1192C、C1251G，其中同义突变两处，错义突变3处，348位氨基酸由苏氨酸变为天冬氨酸即Thr→Asn，351为氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸即Thr→Lys，398位氨基酸由谷氨酸变为谷氨酰胺即Glu→Gln。4.3.3L1蛋白一级结构分析参照ExPASyTools软件将L1基因核苷酸序列转为氨基酸序列，比对结果如表4-6，L1蛋白的氨基酸数目为495，原子总数为15718，蛋白等电点为8.86，正负电荷残基数分别为59和51，分子式为C2486H3889N681O735S16，蛋白不稳定系数为39.42，平均疏水性为-0.466，脂肪系数为78.02。43 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达表4-6L1蛋白一级结构Table4-6TheprimarystructureofL1protein氨基原子总分子质等电负电正电分子式不稳定平均疏脂肪系酸数数量/ku点荷残荷残系数水性数目基/个基/个4951571855590.318.865159C2486H3889N681O735S1639.42-0.46678.024.3.4L1蛋白二级结构分析参照ExPASyTools软件中的SOSUI分析工具，将L1基因核苷酸序列转为氨基酸序列，比对结果如表4-7，L1蛋白中α螺旋占20.61%，延长链占27.88%，β折叠占11.72%，无规则卷曲占39.80%。表4-7L1蛋白二级结构Table4-7ThesecondarystructureofL1proteinα螺旋延长链β折叠无规则卷曲20.61%27.88%11.72%39.80%4.3.5L1蛋白三级结构预测参照ExPASyTools软件中的SWISS-MODEL和Phyre分析工具，将L1基因核苷酸序列转为氨基酸序列，在线分析蛋白三级结构如图4-2。注：A：SWISS-MODEL预测结果B：Phyre预测结果图4-2L1蛋白三级结构预测Note：A：ProteintertiarystructureoftheL1bythetoolofSWISS-MODELB：ProteintertiarystructureoftheL1bythetoolofPhyreFig.4-2ThetertiarystructurepredictionoftheL1protein4.3.6pET-32a-BPV-1-L1表达载体的构建与鉴定用限制性内切酶EcoRⅠ和XholⅠ分别双酶切胶回收目的片段和pET-32a质粒，分别纯化回收目的基因L1小片段和载体pET-32a大片段，与T4连接酶作用过夜连接，转入44 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达E.coliDH5α感受态细胞中，利用载体的氨苄抗性筛选阳性克隆子。挑取阳性克隆过夜培养，菌液PCR扩增（扩增条件同试验4.2.2），得到单一条带与目的条带相符，重组质粒构建模式如图4-3；将鉴定为阳性克隆的重组质粒经EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，获得约5.4kb和1.5kb两条带，大小与载体片段和目的片段长度相符（图4-4）。测序结果进一步证实原核表达载体构建成功。图4-3pET-32a-BPV-L1的构建图Fig.4-3ConstructionofpET-32a-BPV-L145 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达MDNA分子量标准1pET-32a-BPV-L1PCR产物2、3、4pET-32a-BPV-L1EcoRⅠ和XholⅠ双酶切图4-4重组质粒pET-32a-BPV-L1的PCR和酶切鉴定MDNAmaker1PCRamplificationofpET-32a-BPV-L12,3,4pET-32a-BPV-L1digestedbyEcoRⅠ/XholⅠFig.4-4IdentificationofrecombinantplasmidpET-32a-BPV-L1byrestrictionenzymedigestionandPCRamplification4.3.7牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达与检测提取经IPTG诱导后的BL21大肠杆菌中的蛋白，经12%分离胶进行SDS-PAGE电泳分析得到大小约在75KD处有目的条带，而空的表达载体pET-32a在该位置处没有条带(图4-5)，结果与预期结果相同，说明L1蛋白可以在外源细胞（BL21）中表达。注：M：Marker；1为pET-32a对照；2为L1基因全长蛋白表达；图4-5蛋白电泳图Note:M:Marker;1:pET-32a;2:L1protein;Fig.4-5TheelectrophoresisresultofL1protein46 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达4.3.8重组蛋白诱导条件的优化经测序正确的重组质粒转入BL21后，在不同IPTG诱导浓度下，当IPTG终浓度为0.8mM时可以从蛋白电泳图中明显看出重组蛋白表达；当改变诱导时间时，诱导时间为4h时，从蛋白电泳条带可明显看出重组蛋白表达；结果如图4-6所示。注：A：不同时间IPTG诱导表达；B：不同浓度IPTG诱导表达M：Marker；1，8为pET-32a对照；2~7为IPTG诱导浓度为0.8mM时，分别诱导1、2、3、4、5、6h表达产物；9~12为0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM，诱导4h表达产物图4-6重组蛋白诱导条件优化电泳图Note:A:differenttime;B:differentconcentrationM:Marker;1,8:pET-32a;2~7:0.8mMIPTG,1,2,3,4,5,6hexpressionproduct;9~12:4h,concentration,0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mMFig.4-6InductionconditionsoptimizationofL1recombinantprotein4.3.9重组蛋白可溶性分析按照优化后条件诱导表达重组蛋白，超声破碎后分别收集沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明蛋白主要在沉淀中（包涵体）表达(图4-7)。4.3.10纯化蛋白Westernblot检测收集纯化后蛋白，转膜后经1:1500稀释的商品化的一抗Anti-HPVantibody(BPV-1/1H8+CAMVIR)孵育，再经1:2000稀释的特定的HRP标记的羊抗鼠二抗即辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)孵育。用手术剪剪取75KD处PVDF膜，经过X胶片的显影定影后，可见明显条带（图4-8），表明目的蛋白表达成功。47 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达注：M：14.4~94.0kDaMarker；1：L1基因全长蛋白表达；2：上清中的蛋白；3：沉淀中的蛋白；图4-7重组蛋白可溶性分析Note:M:14.4~94.0kDaMarker;1:L1protein;2:Proteininthesupernatant;3:ProteininprecipitationFig.4-7SolubilityanalysisoftheL1recombinantprotein注：M：Marker；1~6：纯化后收集不同流传液内蛋白Westernblot结果图4-8重组蛋白Westernblot检测Note:M:Marker;1~6:PurificationresultsFig.4-8WesternblotingoftheL1recombinantprotein4.4讨论乳头瘤病是自然界中一种较为常见的肿瘤性疾病，可以感染多种宿主，其中以人乳头瘤疾病较为常见，并且危害最为严重。牛乳头瘤疾病是一种基层比较常见的疾病，也称为“疣”；大多数的牛乳头瘤病毒感染患畜可以自行痊愈，但当病毒感染比较严重，与外界环境协同作用下动物经常容易发生二次感染。如伤口愈合不完全，圈舍刮蹭伤口以及与患病动物混饲等情况。一般认为蕨类植物饲喂动物与乳头瘤病毒的发生有直接的联系，但就新疆饲养环境来看，动物感染乳头瘤病毒主要还是与外界畜舍环境和混饲有关，同时不能排除外来引种造成的影响。在晚期表达的基因组中包含L1和L2，在牛乳头瘤病毒基因组中，作为最保守的片段常被用来鉴定新的基因型。Love等人的研究首次报道了在本氏烟草内成功表达并分离了48 塔里木大学硕士学位论文第4章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型L1基因克隆及原核表达完整的BPV-1L1类病毒颗粒(VLPs)，且证明了这些病毒颗粒可引起高强度的特异性免疫反应，为潜在疫苗的制备提供了一个新的方向[76]。本试验通过设计一对L1基因的特异性引物，通过PCR扩增的方法成功扩增出大小为1488bp的目的片段，通过转化连接和送样测序进一步确定为所需目的片段。基于此成功构建出BPV-1L1基因的原核表达载体pET32a-L1，对获得的含有目的基因的重组质粒进行诱导表达，诱导后表达分子量大小为75KD的融合蛋白，与预期蛋白大小相符。对诱导蛋白条件进行摸索，确定在诱导时间为4h，诱导浓度为0.8mM时蛋白表达量最优，分析蛋白的表达形式得出蛋白主要以包涵体的形式存在，并且可以和纯化试剂盒内His.Tag结合。本试验成功对L1基因进行了原核表达，对后续研究预防乳头瘤病疫苗、免疫组化试剂和诊断试剂的研究奠定基础，为研究疾病致病机理与防控策略提供实验室准备。4.5结论本试验成功克隆BPV-1L1基因，目的基因大小为1488bp，编码496个氨基酸；成功构建BPV-1-L1原核表达体系，并成功表达出大小为75KD的目的蛋白，为后续L1基因相关疫苗与诊断试剂的研究奠定基础。49 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建BPV全基因组E6基因长度为414bp，由137个氨基酸组成，蛋白具有典型的锌指结构（CX2CX29CX2C），能破坏细胞肌动蛋白骨架，即细胞不依赖支持物生长（肿瘤细胞特性），通过对E6蛋白的研究将有利于进一步研究致癌机理。本研究以BPV-1型E6基因为目的基因，构建重组质粒对其进行表达，以期为细胞转染研究E6蛋白对细胞功能的影响及免疫组化奠定基础。5.1材料与仪器5.1.1材料试验样品牛乳头状体表赘生物采集自新疆南疆某农户患病牛，保存于实验室-20℃冰箱中。5.1.2试剂大肠埃希菌DH5α、BL21（DE3）、真核表达载体pEGFP-N1，BHK-21细胞均由本实验室保存。2×TaqpfuPCRMastermix，PGM-T载体连接试剂盒，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒，D2000Marker，质粒小提取试剂盒均购自天根生物技术有限公司；限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ购自大连宝生物（TATARA）公司；E.Z.N.A.Cycle-PureKit、E.Z.N.A.TissueDNAKit购自美国OMEGA公司；LB培养基（固、液）、卡那霉素购自宝信生物技术有限公司；DMEM高糖培养基，胎牛血清，脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen；其余试剂耗材为进口的分析纯试剂。5.1.3仪器设备试验所需仪器设备参照表5-1所示。5.2方法5.2.1引物设计与合成依据GenBank中已发表的牛乳头瘤病毒1型全基因组编码序列（KX907623.1）中的E6基因，利用Primer5.0软件设计1对上游下游分别含有BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶位点的引物如下。上游引物：5’-CCAAGCTTATGGACCTGAAACCTTTTGCAAG-3’50 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建下划线为酶切位点；下游引物：5’-GCGGATCCTGGGTATTTGGACCTTGAACCATG-3’下划线为酶切位点。引物提交上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表5-1主要仪器和设备Table5-1Themaininstrumentsandequipmentforexperiment仪器名称型号生产公司单道微量移液器FinnpipetteF3Thermo科技有限公司梯度PCR仪TC-5000Techne有限公司梯度PCR仪Thermo科技有限公司恒温水浴锅DK-8D上海博讯实业有限公司超净工作台SW-CJ-2FD上海博迅实业有限公司电子分析天平AUY220SHIMADZU公司核酸蛋白测定仪BioDrop-Duo英国柏楉(Biochrom)有限公司灭菌枪头AXYGEN生物技术有限公司电泳仪DYY-7C北京市六一仪器厂凝胶成像仪ChemiDocMP乌鲁木齐祥生仪器有限公司制冰机FM180上海楚柏实验室设备有限公司微波炉G70F20CN3L-C2(B0)格兰仕小型高速冷冻离心机Centrifuge5415R北京智杰方远科技有限公司37℃培养箱GSP-9080MBE上海博讯有限公司-80℃超低温冰柜MDF-U33VSANYO电器集团CO2培养箱美国Bio-Rad公司倒置显微镜美国Bio-Rad公司加热制冷循环器JμLaboF12天津市布鲁克科技有限公司电热鼓风干燥箱GZX-9070MBE上海博讯实业有限公司医疗设备厂隔水式恒温培养箱GHP-9080上海一恒科学仪器有限公司恒温培养摇床振荡器ZHWY-200D上海智诚分析仪器制造有限公司高压锅HirayamaHVE-50HIRYAMA5.2.2牛乳头瘤病毒1型E6基因的扩增与回收以-20℃冻存DNA为模板进行PCR扩增，采用50μL反应体系参照表5-2，混匀后瞬时离心，PCR反应条件参照表5-3进行。取部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。电子天平称取0.25g琼脂糖加入锥形瓶中，量取25mL1×TAE工作液加入锥形瓶中，混匀微波炉高火加热1min使琼脂糖完全溶解，待温度稍降低后加入2.5μL的溴化乙锭，混匀后倒胶，待凝胶凝固后，胶块置于电泳槽内进行点样，Marker和PCR后样品各5μL，120V，110mA，电泳25min后照胶。51 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建将剩余全部PCR样品参照上述操作全部点样后，参照北京天根生物技术服务有限公司的普通琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，操作步骤参照试验第4章。表5-2PCR反应体系Table5-2PCRReactionSystem试剂加样量（μL）模板DNA5.0ddH2O18.02×TappfuPCRMasterMix25.0引物PrimerF1.0引物PrimerR1.0总计50.0表5-3PCR反应条件Table5-3PCRReactionCondition步骤温度时间循环数预变性95℃5min1变性95℃30s退火58℃30s30延伸72℃50s总延伸72℃10min15.2.3E6基因连接载体测序将回收E6目的片段与PGM-T载体按摩尔比1：8进行连接，16℃过夜连接。取10μL连接产物加入100μLDH5α中轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min。向离心管中加入500~800μL不含抗生素的37℃预热的LB液体培养基混匀，37℃、150r/min振荡培养60min。将离心管中菌液混匀，吸取100μL到含有卡那抗性的LB固体培养基上，均匀涂开倒置平板，37℃培养过夜。挑取白色单菌落至5mL含有终浓度50~100μg/mL的卡那液体培养基，37℃培养过夜，菌液PCR后提取质粒送至北京金锘锐杰基因科技有限公司测序，将测序正确的序列与GenBank中BPV-1E6基因序列进行比对分析。5.2.4真核表达载体的构建5.2.4.1双酶切纯化测序正确的目的片段和真核表达载体pEGFP-N1分别使用限制性内切酶BamHⅠ和52 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建HindⅢ进行双酶切。载体为50μL反应体系，反应体系如下：载体40μL，10×buffer5μL，ddH2O3μL，BamHⅠ1μL，HindⅢ1μL；目的片段40μL反应体系，反应体系如下：胶回收产物20μL，10×buffer5μL，ddH2O11μL，BamHⅠ2μL，HindⅢ2μL。PCR管内加入上述反应物后混匀，置于恒温水浴锅内37℃双酶切3h，3h后酶切产物参照E.Z.N.A.Cycle-PureKit纯化回收试剂盒（OMEGA公司）分别回收目的片段和载体，具体操作步骤参照试验第4章。5.2.4.2连接转化取上述操作中纯化产物进行连接转化，按照10μL连接体系进行；反应体系如下：纯化后DNA片段5μL，纯化后载体1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigasebuffer1μL，ddH2O2μL；阴性对照反应体系如下：纯化后载体1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigasebuffer1μL，ddH2O7μL；上述反应物混匀，于16℃水浴过夜连接。冰上准备感受态细胞DH5α融化备用，感受态细胞DH5α的制法参见附件3；取出连接产物在超净工作台中将两管连接产物分别加入感受态细胞中，轻弹混匀并标记，冰浴30min；42℃热激90s；冰浴2~3min；加入500~800μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃180r/min摇菌60min；结束后8000r/min离心5min，弃上清，剩余部分液体混匀吸取100μL含有菌体的液体，用灭菌涂布棒均匀涂于Kana+板上，至完全吸收后标记，恒温培养箱内37℃倒置过夜培养。5.2.4.3菌液PCR鉴定挑取Kana+板上10~15个单菌落接种于Kana+终浓度(50μg/mL)LB液体培养基中过夜摇菌，做菌液PCR进行鉴定，并进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果中出现阳性条带即选取最亮的2~4个，吸取相应的菌液100μL到5mL含Kana+(50μg/mL)LB液体培养基进行摇菌，为提质粒做准备。质粒提取参照北京天根生物技术有限公司质粒小提取试剂盒进行，具体操作步骤参照第4章。5.2.4.4重组质粒的鉴定提取的质粒命名为pEGFP-N1-E6并做双酶切鉴定，并将鉴定为阳性的质粒送测序公司进行测序鉴定。53 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建5.2.5BHK-21细胞的培养5.2.5.1细胞复苏从液氮罐中取出冻存细胞后迅速放入37℃恒温水浴锅内，迅速旋转冻存管解冻细胞。15mL离心管内按比例加入DMEM高糖培养基和胎牛血清共3mL，将溶解后的细胞悬液移液枪吸取至上述离心管内，吹打混匀（上述操作均在细胞间超净工作台内进行），1500r/min，离心5min，弃上清，15mL离心管内按比例加入DMEM高糖培养基和胎牛血清共3mL，重悬细胞，将上述细胞悬液转移至细胞培养瓶内，置于含5%CO2培养箱中37℃培养，6~8h更换一次细胞培养液。5.2.5.2细胞传代倒置显微镜下观察上述细胞，于细胞培养瓶内生长达90%时，将细胞培养液倒掉，PBS洗3次，加入DMEM培养基清洗后弃去，仅留可覆盖瓶底液体即可，加入1mL胰酶，消化1~2min并拍打至散，显微镜下可明显见细胞脱落即可，弃胰酶，加入事先准备好的按比例配比的DMEM高糖培养基和胎牛血清共5mL，3000r/min，离心5min，弃上清，加入事先准备好的按比例配比的DMEM高糖培养基和胎牛血清共3mL，重悬细胞，向事先准备的细胞培养板内每孔加入250μL细胞悬液，其余细胞悬液全部加入一个新的细胞瓶内，按比例加入DMEM高糖培养基和胎牛血清共7mL，细胞培养板内每孔加入300μL，轻轻吹打混匀，其余培养基加入细胞培养瓶内，标记后于37℃、5%CO2培养箱内培养，6~8h更换一次细胞培养液。5.2.5.3细胞冻存将DMSO(二甲基亚砜)、胎牛血清和高糖培养基DMEM按1:2:7的比例配制好，-4℃预冷备用；观察细胞瓶内细胞覆盖完全，弃去培养液，PBS洗3次；加入1mL胰酶消化1~2min后加入含有血清的DMEM高糖培养基，混匀后，1500r/min，离心5min；加入预冷的细胞冻存液，吹打混匀，每只冻存管内1.5mL分装标记；4℃放置20min，-20℃放置30min，-80℃过夜后于液氮罐中保存备用。5.2.6重组真核表达质粒pEGFP-N1-E6的转染及检测观察试验5.2.5.2中细胞培养板内细胞，待细胞生长至70%时，参照54 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒，准备脂质体进行细胞转染。准备转染液，准备4个1.5mL的灭菌离心管，分别标记为A1、A2、B1、B2；A1管内加入10μLpEGFP-N1质粒DNA和90μLDMEM高糖培养基，A2管内加入10μLpEGFP-N1-E6重组质粒DNA和90μLDMEM高糖培养基，分别混匀，静置；B1、B2管内均为5μL脂质体和95μLDMEM高糖培养基，分别混匀，静置；将对应编号的A、B两液轻轻混匀，注意将B液轻柔的加入A液中，室温静置18~20min，形成DNA-脂质体混合物；待计时器剩余4~5min时，将CO2培养箱内细胞培养板取出，先用PBS洗3遍，再用DMEM高糖培养基清洗3次；向A、B混合液中加入200μL的DMEM高糖培养基，轻轻混匀后用移液枪转移至细胞培养板内各孔，标记，37℃、5%CO2培养箱内培养6~8h，每孔加入250μL含有胎牛血清的DMEM高糖培养基继续培养；24h后更换细胞培养液，72h后于倒置荧光显微镜下观察。5.3结果5.3.1牛乳头瘤病毒1型E6基因的PCR扩增以牛乳头瘤病毒1型基因组DNA为模板，用E6基因特异性引物PCR扩增E6基因片段。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的E6基因片段约为414bp，与预期目的片段大小相符，空白对照未扩增出任何条带，未见非特异性扩增条带（图5-1）。5.3.2基因序列分析经测序后，获得E6基因全长序列，序列长度为414bp，与GenBank中序列大小相符，与BPV-1参考株（X02346和NC001522）核苷酸同源性均达到99.5%，氨基酸同源性均达到99.3%；与BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306）的核苷酸同源性分别为87.9%和87.7%，氨基酸同源性均为83.3%；与BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性达到了88.9%；氨基酸同源性为85.5%。E6基因与BPV-1参考株（X02346和NC001522）相比，2处发生突变：33位A33C、48位T48C，均为同义突变。55 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建注：M:DL2000Maker；1:阴性对照；2:BPV1E6基因PCR扩增产物；图5-1BPV1E6PCR产物电泳结果Note:M:DL2000Maker;1;negativecontrol;2:PCRproductofE6Fig.5-1ElectrophoresisresultsofBPVE6DNAPCRproducts5.3.3E6蛋白一级结构分析参照ExPASyTools软件将E6基因核苷酸序列转为氨基酸序列，比对结果如表5-4，E6蛋白的氨基酸数目为137，原子总数为2190，蛋白等电点为8.75，正负电荷残基数分别为23和16，分子式为C686H1088N208O191S17，蛋白不稳定系数为46.28，平均疏水性为-0.366，脂肪系数为70.44。表5-4E6蛋白一级结构Table5-4TheprimarystructureofE6protein氨基酸原子总分子质等电点负电荷正电荷分子式不稳定平均疏脂肪系数目数量/ku残基/个残基/个系数水性数137219015850.488.751623C686H1088N208O191S1746.28-0.36670.445.3.4E6蛋白二级结构分析参照ExPASyTools软件中的SOSUI分析工具，将E6基因核苷酸序列转为氨基酸序列，比对结果如表5-5，E6蛋白中α螺旋占25.55%，延长链占20.44%，β折叠占8.76%，无规则卷曲占45.26%。表5-5E6蛋白二级结构Table5-5ThesecondarystructureofE6proteinα螺旋延长链β折叠无规则卷曲25.55%20.44%8.76%45.26%56 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建5.3.5E6蛋白三级结构预测参照ExPASyTools软件中的SWISS-MODEL和Phyre分析工具，将E6基因核苷酸序列转为氨基酸序列，在线分析蛋白三级结构如图5-2。注：A：SWISS-MODEL预测结果B：Phyre预测结果图5-2E6蛋白三级结构预测Note：A：ProteintertiarystructureoftheE6bythetoolofSWISS-MODELB：ProteintertiarystructureoftheE6bythetoolofPhyreFig.5-2ThetertiarystructurepredictionoftheE6protein5.3.6pEGFP-N1-E6表达载体的构建与鉴定用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切胶回收目的片段和pEGFP-N1真核表达质粒，分别纯化回收目的基因E6小片段和载体pEGFP-N1大片段，与T4连接酶作用过夜连接，转入E.coliDH5α感受态细胞中，利用载体卡那抗性筛选阳性克隆子。挑取阳性克隆过夜培养，菌液PCR扩增（扩增条件同试验5.2.2），得到单一条带与目的条带相符，重组质粒构建模式如图5-3；将鉴定为阳性克隆的重组质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，获得约4.7kb和414bp两条带，大小与载体片段和目的片段长度相符（图5-4）。测序结果进一步证实真核表达载体构建成功。57 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建图5-3pEGFP-N1-E6的构建图Fig.5-3ConstructionofpEGFP-N1-E6注：M：DNA分子量标准；1：pEGFP-N1-E6PCR产物；2、3、4：pEGFP-N1-E6BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物图5-4重组质粒pEGFP-N1-E6的PCR和酶切鉴定Note:MDNAmaker1PCRamplificationofpEGFP-N1-E62，3，4pEGFP-N1-E6digestedbyBamHⅠ/HindⅢFig.5-4IdentificationofrecombinantplasmidpEGFP-N1-E6byrestrictionenzymedigestionandPCRamplification58 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建5.3.7BHK-21细胞转染结果参照LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒操作，将重组质粒pEGFP-N1-E6和空载体分别转染BHK-21细胞，并以脂质体转染BHK-21细胞。经72h培养结束后，于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。结果如图5-5所示，其中A为未经转染的BHK-21细胞，A1为荧光显微镜下结果，可见无绿色荧光激发；B为pEGFP-N1空载体经脂质体转染BHK-21细胞72h后结果，B1为荧光显微镜下结果，可明显见有绿色荧光激发；C为pEGFP-N1-E6重组质粒经脂质体转染BHK-21细胞72h后结果，C1为荧光显微镜下结果，可明显见有绿色荧光激发。因此依据实验结果可得出成功构建pEGFP-N1-E6重组质粒，并成功在BHK-21细胞中表达。注：A、A1：BHK-21细胞对照；B、B1：pEGFP-N1空载体转染BHK-21细胞；C、C1：重组质粒转染BHK-21细胞图5-5绿色荧光蛋白表达结果图Note:A、A1:BHK-21cells;B、B1:BHK-21cellstransfectedwithpEGFP-N1;C、C1:BHK-21cellstransfectedwithpEGFP-N1-E6Fig.5-5Expressionofgreenfluorescentprotein5.4讨论本实验通过设计一对E6基因的特异性引物，通过PCR扩增的方法成功扩增出大小为414bp的目的片段，通过转化连接和送样测序进一步确定为所需目的片段。基于此成功构建出BPV-1E6基因的真核表达载体pEGFP-N1-E6，对获得的含有目的基因的重组质粒参照LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒转染BHK-21细胞，72h后倒置荧光显59 塔里木大学硕士学位论文第5章新疆南疆牛乳头瘤BPV-1型E6基因克隆及真核表达载体的构建微镜下观察，可见明显绿色荧光，而对照组未见有荧光出现。克隆的E6基因与BPV-1参考序列（X02346和NC001522）核苷酸同源性均达到99.5%，氨基酸同源性均达到99.3%；与BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306）的核苷酸同源性分别为87.9%和87.7%，氨基酸同源性均为83.3%；与BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性达到了88.9%；氨基酸同源性为85.5%。并且通过序列比对分析，2处发生突变：33位A33C、48位T48C，均为同义突变，对氨基酸并无影响。本试验选择一种较为便利的真核表达载体，免去了实验过程中间接免疫荧光反应，同时选择的真核表达体系相较于原核表达体系，表达系统翻译后表达产物生物活性比原核系统表达产物要高，并且较适合于临床应用。本试验选择pEGFP-N1载体，pEGFP是一种荧光效果较好的基因，其产生的荧光效果比普通的GFP要强，更便于观察目的基因的表达情况。同时该质粒内启动子SV40和PCMV的存在能够使基因在细胞中稳定表达；依据质粒的复制能力，在宿主细胞分裂过程中，目的基因可以随胞质传给下一代，保证了稳定遗传，同时质粒上的多克隆位点便于目的基因的插入[77]。BPV-1的E6基因编码137个氨基酸的癌蛋白，具有转化细胞的活性。不仅可以与感染病毒的宿主的DNA结合并且蛋白能与p53蛋白结合，而p53肿瘤抑制蛋白主要是调节细胞周期和细胞凋亡，两者结合后可使p53蛋白降解或阻止蛋白进入细胞核内发挥作用，最终导致细胞正常的调节功能和凋亡受阻，是致癌变的关键环节。本试验基于BPV-1型SY-12株全基因组序列，设计E6基因扩增引物，成功构建E6真核表达系统并在BHK-21细胞内检测成功，为后续研究功能基因的致癌特性奠定基础。5.5结论本试验成功克隆BPV-1E6基因，目的基因大小为414bp，编码137个氨基酸；成功构建BPV-1-E6真核表达体系，并转染至BHK-21细胞中，倒置荧光显微镜下可明显见绿色荧光蛋白表达。60 塔里木大学硕士学位论文第6章总结与展望第6章总结与展望1.对新疆南疆某农户牛乳头状瘤赘生样品进行病理组织学检查和BPV基因分型鉴定，证实该患畜为BPV-1型牛乳头瘤病毒感染。2.完成牛乳头瘤病毒1型SY-12株全基因组序列测序。序列全长7946bp，A+T%含量为54.76%，G+C%含量为45.24%，具有BPV的功能基因结构，与参考序列比对分析，确定SY-12株为牛乳头瘤病毒1型，为Delta属牛乳头瘤病毒。3.成功克隆BPV-1L1基因并构建原核表达载体pET32a-BPV-1-L1，优化诱导后经蛋白表达纯化，得到大小为75KD的目的融合蛋白。4.扩增BPV-1E6基因并构建BPV-1-E6真核表达体系pEGFP-N1-E6，转染至BHK-21细胞，倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。本试验对牛乳头瘤病毒基因1型进行分子生物学研究，完成SY-12株全长基因序列测序分析，成功构建了牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达体系和牛乳头瘤病毒1型E6基因真核表达体系。为疫源追溯、遗传演化规律研究、疾病的防控提供了理论依据，为进一步研究功能基因的作用机制和疫苗及诊断试剂奠定基础。61 塔里木大学硕士学位论文附件附件附件1：pET-32a(+)质粒图谱62 塔里木大学硕士学位论文附件附件2：pEGFP-N1质粒图谱63 塔里木大学硕士学位论文附件附件3：实验试剂的制备1DH5α（BL21）的制备灭菌的接种环接取一环DH5α（BL21）菌液，无抗性平板上划线过夜培养，挑取平板上的单菌落，接入含有5mL液体无抗性的液体培养基内，37℃恒温摇床内200r/min摇菌5h，结束摇菌后吸取2mL菌液至100mL无抗性的液体培养基，37℃恒温摇床内200r/min摇菌4h，将制备好的菌液分装于4个50mL离心管内，配平，冰上静置10min，4℃4000r/min离心10min，弃上清，加入30mL4℃预冷的CaCl2溶液，4℃4000r/min离心10min，弃上清，加入2mL4℃预冷的15%CaCl2溶液，重悬菌体，1.5mL离心管每管100μL分装，-80℃冻存备用。2pET32a载体的制备取1μLpET32a质粒转入DH5α中，轻弹混匀，冰上放置30min，42℃水浴90s，冰上放置2min，加入500μL无抗的37℃预热的LB液体培养基，37℃恒温摇床内150r/min摇菌60min，Ampr+板上37℃过夜培养，挑取单菌落于含有Ampr+抗性的液体培养基内，37℃恒温摇床内150r/min过夜培养，提取质粒，标记备用。3pEGFP-N1载体的制备取1μLpEGFP-N1质粒转入DH5α中，轻弹混匀，冰上放置30min，42℃水浴90s，冰上放置2min，加入500μL无抗的37℃预热的LB液体培养基，37℃恒温摇床内150r/min摇菌60min，Kana+板上37℃过夜培养，挑取单菌落，于含有Kana+抗性的液体培养基内，37℃恒温摇床内150r/min过夜培养，提取质粒，标记备用。4考马斯亮蓝R-250染色液0.5g考马斯亮蓝R-250，50mL冰醋酸，125mL异丙醇，325mL高压灭菌的ddH2O，搅拌均匀，室温保存备用，可回收重复使用。5考马斯亮蓝脱色液50mL冰醋酸，25mL乙醇，425mL高压灭菌的ddH2O，混匀，室温保存备用，可回收重复使用。64 塔里木大学硕士学位论文参考文献参考文献[1]RopertoS,RussoV,OzkulA,etal.Bovinepapillomavirustype2infectstheurinarybladderofwaterbuffalo(Bubalusbubalis)andplaysacrucialroleinbubalineurothelialcarcinogenesis[J].JournalofGeneralVirology,2013,94(Pt2):403-408.[2]daSilvaMA,CarvalhoCC,CoutinhoLC,etal.Co-infectionofBovinePapillomavirusandfeline-associatedPapillomavirusinbovinecutaneouswarts[J].TransboundEmergDis,2012,9(6):539-543.[3]BrandtS,ApprichV,HacklV,etal.PrevalenceofbovinepapillomavirusandtreponemaDNAinbovinedigitaldermatitislesions[J].VetMicrobiol,2011,148(2-4):161-167.[4]LimaEG,LiraRC,JesusAL,etal.DevelopmentofaDNA-basedvaccinestrategyagainstbovinepapillomavirusinfection,involvingtheE5orL2gene[J].Genetics&MolecularResearchGmr,2014,13(1):1121-1126.[5]CampoMS.Bovinepapillomavirusandcancer[J].VetJ,1997,154(3):175-188.[6]扈荣良.现代动物病毒学[M].中国农业出版社,2014.[7]CampoMS.Papillomavirusanddiseaseinhumansandanimals[J].Veterinary&ComparativeOncology,2003,1(1):3-14.[8]袁世山,陆承平.牛乳头状瘤病毒研究进展[J].动物检疫,1989(01):20-22.[9]BernardHU,BurkRD,ChenZ,etal.Classificationofpapillomaviruses(PVs)basedon189PVtypesandproposaloftaxonomicamendments[J].Virology,2010,401(1):70-79.[10]deVilliersEM.Cross-roadsintheclassificationofpapillomaviruses[J].Virology,2013,445(1-2):17-27.[11]WilsonAD,ArmstrongEL,GoftonRG,etal.Characterisationofearlyandlatebovinepapillomavirusproteinexpressioninequinesarcoids[J].VetMicrobiol,2013,162(2-4):369-380.[12]WhelanF,SteadJA,ShkumatovAV,etal.AflexiblebracemaintainstheassemblyofahexamericreplicativehelicaseduringDNAunwinding[J].NucleicAcidsRes,2012,40(5):2271-2283.[13]MorrisonMA,MorrealeRJ,AkunuruS,etal.TargetingthehumanpapillomavirusE6andE7oncogenesthroughexpressionofthebovinepapillomavirustype1E2proteinstimulatescellularmotility[J].JVirol,2011,5(20):10487-10498.65 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塔里木大学硕士学位论文致谢致谢本论文是在导师胡建军教授的悉心指导下完成，感谢导师在三年的研究生学习生涯中对我的关心与帮助，感谢导师对论文的选题和撰写的帮助，值此毕业之际，谨向尊敬的胡老师表达我诚挚的谢意，胡老师严谨的治学态度和求真务实的生活作风必对我未来的学习和工作产生深远的影响。感谢实验室的喻华英教授、李有文教授、焦海宏副教授、陈瑛老师和艾克拜尔.热合曼老师及其他老师对我实验和论文的帮助，感谢喻华英教授对我学习和生活的关心与帮助，感谢实验室的同学及我的研究生同学为我实验上提供的便利。感谢我的父母，提供给我的学习环境，感谢王青青同学为我学习和生活提供的便利和帮助，感谢我的室友为我的求学之路增光添彩，在此特向所有帮助过我的人们表达我最诚挚的祝福与祝愿。感谢塔里木大学提供的的宽严并济的科研环境，感谢塔里木大学轻松舒适的校园环境，值此毕业之际祝愿各位，咫只的天南地北，好去者前程万里。72 塔里木大学硕士学位论文作者简介作者简介张婉琪，女，汉族，出生于1993年，新疆哈密。2011年9月至2015年6月就读于塔里木大学动物科学学院动物医学专业，获得学士学位。2015年9月至2018年6月就读于塔里木大学生命科学学院攻读硕士学位。在校期间获得全国英语竞赛自治区三等奖，塔里木大学研究生英语演讲比赛二等奖，主要研究方向为畜禽疫病病原学及病毒学的研究。硕士期间发表论文张婉琪,胡建军,闫石磊,黄耀杰,徐建平,黄忠武,郑毛亮,孟子嫣,李元元,王娜,王青青.牛乳头瘤病毒基因2型新疆南疆Aks-01流行株全基因组序列测定及其特征分析[J].病毒学报,2015,31(04):370-378.张婉琪,张迎春,胡建军，彭安业,王青青,王娜,张莹钰,黄耀杰,崔鑫,雷红.牛冠状病毒BCV-Aks-01新疆南疆株全基因组序列测定及其分子特征分析[J].病毒学报，2017，33(04):583-592.王青青,张婉琪,库尔班妮萨·图尔荪,依再提古力·阿布拉,吐热依赛姆·赛买提,努尔阿丽亚·马木提,胡建军.羊脑包虫和鼻蝇蛆混合感染的诊断[J].中国兽医杂志,2016,52(02):51-52.73