人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白l1基因的克隆和序列分析

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　　人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的克隆和序列分析摘要:目的从已感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中获得HPV16型晚期表达基因L1，为HPV感染的检测和治疗奠定基础.方法根据引物设计原则设计一对特异引物，并用PCR方法从宫颈癌组织中获得L1基因，用pGEM-T作为克隆载体，构建重组质粒并以双脱氧法双向测定插入片段序列，拼接出L1基因序列，自动测序验证并分析序列.结果从西安地区1例宫颈癌临床标本克隆到的1株HPV16型L1蛋白编码序列经BLAST2.0分析与既往报道序列存在高度同源性.结论构建的重组质粒为进一步研究L1蛋白的表达及其免疫学创造了条件.　　Keyan;L1gene;cloning;humanpapillo-mavirus;cervicalcarcinoma　　Abstract:AIMToobtaintheL1majorcapsidproteingeneofhumanpapillomavirustype16fortheexploringoftheclin-icalanalysisandtreatmentofHPV.METHODSL1geneplifiedfromhumancervicalcarcinomabyRT-PCR.TheproductofPCRE.coli JM-109.FolloesinedbyanautomatedDNAsequencer.RESULTSThesequenceoftheclonedL1genefromthishu-mancervicalcarcinomamuneactivity.　　0引言　　人乳头病毒（humanpapillomavirus，HPV）为无囊膜小DNA病毒，它与多种良、恶性肿瘤的发生相关［1，2］，其中HPV16型是广泛存在于我国妇女宫颈癌的主要型别［3-5］.HPV基因为双链闭环DNA分子，编码10个开放读框，所有的开放读框均由一条DNA链编码，且几个基因的读框有部分重叠，晚期编码区的基因分别是L1和L2，而L1蛋白结构比较保守，在其N端含较多抗原表位，是病毒的主要衣壳蛋白和HPV的重要抗原［6］，能刺激机体产生保护性抗体.因为病毒很难在体外大量培养，妨碍了对病毒自然感染和装配的研究，所以对L1基因的克隆在进行HPV感染宫颈癌的预防和治疗方面具有深远的意义.　　1材料和方法　　1.1材料 宫颈癌组织标本采自第四军医大学西京医院妇产科1例未经任何治疗的手术患者（女性，46岁），手术切除后经临床病理诊断确诊为宫颈癌.标本取回后立即冻存于-20℃.载体pGEM-T，E.coliJM109由本所保存，质粒提取试剂盒（iniprepsDNAPurificationSyetem）购自美国Promega公司，限制性内切酶EcoRⅠ，SalⅠ，TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNAmarker（DL2000）、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、dNTP混合物购自大连宝生物公司，电泳凝胶片段回收试剂盒购自北京宝泰克生物科技有限责任公司.　　1.2方法宫颈癌组织DNA的提取按Cotter［12］的方法，取黄豆大小的组织块，加入20mmolL-1pH8.0TE匀浆，并加入EDTA，SDS，蛋白酶K和RNase中，于37℃水浴保温过夜.用等体积的酚氯仿异戊醇（25241）抽提及0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，再用700mLL-1乙醇洗涤沉淀，自然风干，用100μL水溶解沉淀，稀释5倍作为模板.根据Seedorf等［13］报道，L1基因全长1596bp（5559～7154），经限制性酶切分析结果（.firstmarket.cut-ter/cut2.htm）发现在6818处存在EcoRⅠ酶切位点.根据文献报道和引物设计原则，我们自行设计了从起始点至6818处的一对引物，为了便于克隆测序和表达，在引物的5’末端和3’末端分别引入了EcoRⅠ 和SalⅠ酶切位点.并在3’端引入额外终止码TAG.引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物1（5’-CGGAATTCCAATTATTGCTGAT-GCAGGTGAC-3’）和引物2（5’-CGCGTCGACC-TACATAGAATGTATGTATGTC-3’）.该引物扩增的靶序列为1256bp.将提取的DNA作为模板，加入特异引物，扩增靶片段DNA.PCR扩增条件:dNTP2.5mmolL-1，引物各50μmolL-1，MgCl225mmolL-1Taq酶2.5U，加H2O至25μL.扩增参数设定为:94℃5min变性后进行35个循环，94℃1min，52℃1min，72℃1.5min，末次循环后延伸10min.将经琼脂糖电泳后回收的PCR产物与克隆载体pGEM-T与T4DNA连接酶连接6h，连接产物转化至E.coliJM109感受态细胞中，经氨苄青霉素和蓝白斑筛选后，挑取白色单菌落扩大培养，以iniprepsDNA纯化试剂盒按说明书步骤提取质粒，并进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，阳性克隆送博亚公司行DNA序列测定.　　2结果　　2.1HPV┐16型L1基因PCR扩增结果以从宫颈癌组织中提取的总DNA作为模板，用设计的引物进行PCR扩增，产物以8gL-1琼脂糖凝胶电泳分析，可见一清晰的条带（Fig1），与预计的片段大小一致，为1.2kb左右. 　　2.2重组质粒的双酶切鉴定将扩增产物与载体pGEM-T连接，构建了重组质粒HPV16L1-pGEMT.将重组质粒用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切鉴定，结果以8gL-1琼脂糖凝胶电泳分析（Fig2），可见重组质粒的插入片段与预计片段大小一致.　　2.3重组质粒的序列测定和分析将含重组质粒的阳性克隆经上海博亚生物技术有限公司自动测序仪行正、反双向测定，拼接出完整序列.经blast同源性分析证实，我们获得的HPVL1基因与报道的HPV16型L1基因原始序列（GeneBank9627100）一致性高达99%.但是，我们发现所克隆的L1基因与原始序列有4个核苷酸的不同，使得对应编码的氨基酸发生变化.原始序列5892处的C变为了T，核苷酸三联密码由CCT→TCT，其编码的氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸;6337处的核苷酸C变为T，核苷酸三联密码由GCT→GTT，其编码的氨基酸由缬氨酸变为丙氨酸;6423处的核苷酸A变为G，核苷酸三联密码由ACT→GCT，其编码的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸;6799处的核苷酸T变C，核苷酸三联密码由ATG→ACG，其编码的氨基酸由苏氨酸变为甲硫氨酸.图1－图2略 　　3讨论　　多年的研究表明，HPV约有100多种不同型别，按致癌的危险性分为3类:低危型（主要包括HPV6，11，13，32，42和44等）、高危型（主要有16，18，45，52和56等）和中间型（主要有31，33，35和45等）.而HPV16属于与宫颈癌、喉癌、食道癌发生发展密切相关的高危型别，流行病学调查表明，90%的宫颈癌组织中可检测出某一型别的HPV［8，9］.由于HPV晚期基因L1是编码病毒的主要衣壳蛋白和HPV的重要抗原，能刺激机体产生保护性抗体，可避免机体再受同型别HPV的感染.为此，对该基因的克隆有助于开发出准确可靠的诊断试剂盒，对HPV感染的早期诊断有很大的实用价值.该基因的成功克隆为其相应蛋白表达的后续工作奠定了坚实基础，并为进一步应用到临床判断HPV感染患者愈后以及开发出具有预防功能的生物制剂都具有广阔的前景和重大意义.本实验从西安地区1例宫颈癌患者手术标本中成功地克隆到HPV16型L1基因，对其进行测序和相似性检索分析，证明其与已经报道的序列有极高的相似性，高达99%，说明该株病毒确为HPV16型. 　　实验中我们对所得到的序列进行了重复克隆和多次测序，发现所得到的HPV16L1DNA序列与Seedorf报道的原始序列及谷鸿喜等［16］研究报道的序列相比较均有4处碱基变化，并导致了其相对应位置编码的氨基酸的改变.这几处氨基酸的改变对HPV16L1蛋白的结构和功能具体有何影响，尚待进一步研究探索，同时，该实验结果也提示各地区的宫颈癌组织中所获HPV16L1基因有所差异，在针对各地区的HPV感染检测时，应考虑地区因素.