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分类号：S476+.12学校代码：10712UDC：632研究生学号：2016051494密级：公开2018届专业学位硕士研究生学位（毕业）论文57株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究类型农业推广硕士领域、方向植物保护研究生赵梦指导教师王敦教授合作指导教师刘新宇研究员完成时间2018年5月中国陕西杨凌 Classificationcode:S476+.12Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2016051494Confidentialitylevel:PublicThesisforMaster’sDegreeNorthwestA&FUniversityin2018STUDYOFENTOMOPATHOGENITICYANDINVIVOCONIDIATIONOF57STRAINSOFTHEENTOMOPATHOGENICFUNGI(EFS)Major:masterofagriculturalextensionResearchfield:plantprotectionNameofPostgraduate:ZhaoMengAdviser:Prof.WangDunCo-adviser:Prof.LiuXinyuDateofsubmission:May2018YanglingShaanxiChina 57株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究摘要昆虫病原真菌作为一种重要的生物防治资源，在农林害虫综合治理中发挥着重要的作用，受到国内外生物防治界的广泛关注。本研究对本实验室之前分离的57株昆虫病原真菌（43株绿僵菌，8株白僵菌，6株棒束孢）的致病力进行评估，以初步筛选出致病性强的菌株，其次对各菌株侵染虫体后的产孢量进行测定，评估其开发利用价值，以便其更好的应用于生产实践中。同时，分析了各菌株的致病性与其侵染虫体后的产孢量之间的关系，以期为优良致病菌株的筛选提供一个特异性指标。本研究的结果如下：1．供试的57株昆虫致病性真菌分离株对黄粉虫幼虫均有很强的致病性，约84.2%的分离株对黄粉虫幼虫的致死率在90%-100%之间，且致死率为100%菌株约有42.1%。2．以平均存活时间（MST）及其差异性作为比较各菌株致病性的标准，其中分离株ILT-01（环链棒束孢，I.cateniannulata）和SH-060（平沙绿僵菌，M.pingshaense）致死时间较其他分离株短，感病后的黄粉虫幼虫的平均存活时间（MST）分别为5.67天和5.91天。3．经产孢量的测定，发现各菌株的产孢量间存有显著性差异，BJZF-07（球孢白僵菌，B.bassiana;16.37×107个分生孢子/昆虫）被发现拥有最高的分生孢子产量，而BJZF-01（球孢白僵菌，B.bassiana;0.59×107个分生孢子/昆虫）产生了最低数量的分生孢子。4．利用皮尔逊相关系数分析显示，在显著性水平P=0.1299的条件下，MST与产孢量之间的相关系数r=-0.2067，说明MST与产孢量之间不存在明显相关性，不能直接根据被感染虫体上的产孢量来判断菌株致病力的强弱。综合分析致病力与产孢量，我们发现棒束孢分离株ILT-01、绿僵菌分离株SH-060致病力强，但是产孢量相对较低，由于在生防真菌杀虫剂的开发上，产孢量是非常重要的因素，所以在实践生产中应注意优化其培养方案，增加产孢量，而SH-054（平沙绿僵菌，M.pingshaense）的致病力和产孢量均有良好表现。因此，ILT-01，SH-060和SH-054均值得被关注，并且作为生物防治剂具有很大的发展潜力。关键词：昆虫病原真菌，黄粉虫，致病力，虫体产孢量项目支持：本研究受杨凌示范区产学研用协同创新重大项目（2017CXY-12）、陕西省和林业公益性行业科研专项（201404403-09）支持，特此鸣谢！ STUDYOFENTOMOPATHOGENITICYANDINVIVOCONIDIATIONOF57STRAINSOFTHENTOMOPATHOGENICFUNGI(EFS)ABSTRACTAsanimportantbiologicalcontrolresource,entomopathogenicfungiplayadecisiveroleinthecomprehensivemanagementofagriculturalandforestrypests.Theyhavereceivedextensiveattentionfromthebiologicalcontrolcommunityathomeandabroad.Thepathogenicityof56isolatesofentomopathogenicfungifromourlabwereevaluated,including42isolatesofMetarhizium,8isolatesofBeauveriabassianaand6isolatesofIsaria.Thenthestrongpathogenicstrainswerepreliminaryscreenedout,andthenthesporulationofthestrainsafterinfestationwitheachstrainwasmeasuredtoevaluateitsdevelopmentandutilizationvalue,sothatitcouldbebetterappliedinproductionpractice.Atthesametime,therelationshipbetweenthepathogenicityofeachstrainanditsconidiationinvivowasanalyzedinordertoprovideaspecificindicatorforthescreeningofexcellentpathogenicstrains.Themajorresultswereasfollows:1.The57isolatesofinsectpathogenicfungitestedwereallpathogenictomealworm（Tenebriomoliter）larvae.About84.2%oftheisolateshadalethalityrateof90%-100%fortheTenebriomoliterlarvae,andThestrainwithalethalrateof100%accountsforabout42.1%ofthetotal.2.Themeansurvivaltime(MST)anditsdifferencewereusedasthecriteriaforcomparingthepathogenicityofthestrains.TheisolateILT-01(I.cateniannulata)andSH-060(M.pingshaense)killedhadshorterlethaltimetomealwormthanallotherentomopathogenicfungiisolates,andthemeansurvivaltime(MST)ofmealworminfectedbythesetwoinsectpathogenicfungiisolateswere5.67daysand5.91days,respectively.3.Therewasasignificantdifferenceinthesporulationofeachstrainbymeasuringthesporulationamount.BJZF-07(B.bassiana,16.37×107conidia/insect)werefoundtohavethehighestconidiationyield,whileBJZF-01(B.bassiana,0.59×107conidia/insect)producedthelowestyield.4.ThroughPearson'scorrelationcoefficientanalysis,weknowthatundertheconditionofsignificancelevelP=0.1299,thecorrelationcoefficientbetweenMSTandsporulationisr=-0.2067.Itimplicatedthattheco-relationshipbetweenMSTandsporulationwasnot significant,anditwasnotpossibletodirectlyjudgethestrengthofthestrainbasedontheamountofsporulationintheinfectedlarvae.Basedonacomprehensiveanalysisofpathogenicityandsporulation,wefoundthatILT-01andSH-060arehighlypathogenic,buttheirsporulationisrelativelylow.Sincesporulationisaveryimportantfactorinthedevelopmentofbiocontrolfungicide,itisimportanttopayattentiontooptimizethecultureprogramandincreasesporulationinactualproduction.Fortunately,SH-054(M.pingshaense)performedwellintermsofpathogenicityandsporulation.Therefore,ILT-01,SH-060andSH-054areworthyofattentionandhavegreatpotentialasbiocontrolagents.KEYWORDS:entomopathogenicfungi,Tenebriomoliter,pathogenicity,invivoconidiation 目录第一章文献综述......................................................................................................................11.1昆虫病原真菌的研究概况.........................................................................................11.1.1昆虫病原真菌定义............................................................................................11.1.2研究价值............................................................................................................11.1.3致病机制............................................................................................................11.1.4研究现状............................................................................................................31.2黄粉虫简介.................................................................................................................51.3室内生物测定法.........................................................................................................61.3.1点滴法................................................................................................................61.3.2喷雾（粉）法....................................................................................................61.3.3药膜法................................................................................................................61.3.4浸渍法................................................................................................................71.3.5浸叶法................................................................................................................71.3.6人工饲料混药法................................................................................................71.4菌种筛选.....................................................................................................................81.4.1生物学特性比较................................................................................................81.4.2毒力测定............................................................................................................81.4.3分子生物学方法................................................................................................81.5研究的目的和意义.....................................................................................................8第二章实验材料与方法........................................................................................................102.1实验材料...................................................................................................................102.1.1供试菌株..........................................................................................................102.1.2供试虫体..........................................................................................................102.1.3实验器具..........................................................................................................102.1.4化学试剂..........................................................................................................102.1.5培养基制备......................................................................................................102.2实验方法...................................................................................................................112.2.1黄粉虫饲养......................................................................................................112.2.2孢子准备..........................................................................................................112.2.3毒力测定..........................................................................................................122.2.4虫体产孢量测定..............................................................................................122.2.5数据分析..........................................................................................................12 第三章实验结果分析............................................................................................................143.1被真菌感染症状.......................................................................................................143.2对试虫的致死率.......................................................................................................143.3平均生存时间...........................................................................................................153.4虫体产孢量...............................................................................................................173.5MST与虫体产孢量的关系.......................................................................................19第四章结论与讨论................................................................................................................214.1结论...........................................................................................................................214.2讨论...........................................................................................................................21参考文献..................................................................................................................................23致谢..................................................................................................................................28作者简介..................................................................................................................................29 第一章文献综述1第一章文献综述1.1昆虫病原真菌的研究概况1.1.1昆虫病原真菌定义能侵染昆虫并在其体内寄生从而引致其发病乃至死亡的真菌就称之为昆虫病原真菌亦或是虫生真菌(宋晓兵等2016)。它们是最大的一群昆虫病原微生物(杜民杰2016)。1.1.2研究价值昆虫在生长发育历程中，不免受到很多病原微生物的威胁，致使其感病甚至死亡。一旦条件合适时，感染昆虫中产生的新孢子和营养细胞就会传播到健康的昆虫群体中，在昆虫种群内引起广泛的流行病。并且大部分的昆虫致病微生物对人和动物均无致病性，对环境友好，同时也可以被开发研制成各种不同的剂型，以便适用于多种施药方式。因而微生物农药在目前的植物保护研究中很受欢迎，具有相当广阔的应用前景，它们将在保护人类健康，防治农业，林业，牧业和园艺害虫等方面展示其应有的价值。致病微生物涵盖了许多种类，除了细菌、真菌以及病毒这三个类群外，病原线虫和一些原生动物等也隶属其中，然而在自然生态系统中，因致病微生物死亡的昆虫群体中，约有60%的个体都是被病原真菌侵染致死的(李月等2017)。昆虫病原真菌和寄主的互作机制对保障生态系统动态平衡，维护生物多样性十分重要，并且对病原菌的进化也产生很大的影响，它是自然界平衡有害昆虫种群数量的一个必要手段(张石柱2010)。利用昆虫病原真菌防治害虫，不但残效期长、绿色无污染还可以防止害虫再猖獗，而且它具有优良的扩散效果，独特的入侵途径（经体壁侵入），较强的土壤宿存能力，在针对刺吸式害虫、地下害虫和鞘翅目害虫的防治上具有其它微生物制剂无可匹敌的优势(王爽等2015)。而且大部分昆虫病原真菌易被人工培养，使用方便，可以实现大规模生产，并且有特定的寄主。因此，研究昆虫真菌是一项有特殊价值的工作。1.1.3致病机制目前，虫生真菌的致病机理一直是研究的热点，其致病过程一般可以分为以下6个阶段（图1-1）：（1）粘附，昆虫病原真菌的毒性首先根据是否成功粘附到昆虫体上来判断。所以粘附是必要的，通常通过分泌粘液来实现。然而，酶，凝集素以及疏水和静电力也起作用，病原体与表皮的粘附力被认为是致病菌株的特征；（2）萌发，当条件合适时，依附在宿主表皮上的感染单位萌发。寄主角质层表面上的水，离子，脂肪酸和营养物质以及宿主的生理状态等多种因素，均能影响孢子的萌发和行为。成功萌发与 257株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究否取决于对可利用的营养物质的同化作用强弱和对存在于表面上的任何有毒物质的承受能力大小(裴炎等2003)；（3）穿透，分生孢子发芽长出芽管，直接穿透表皮或发育成附着胞黏附于体壁上，接着在附着胞上长出颀长的侵染丝穿透表皮，这一过程是整个侵染过程的关键(李文华等2001)。因为芽管萌发时会相应地对虫体产生一个压力，而且粘附后，影响菌株毒力的下一个因素就是水解昆虫表皮的酶，所以穿透作用既是机械的过程也是酶的过程。昆虫病原真菌会分泌脂肪酶，蛋白酶和几丁质酶等，这反映了它们遇到的底物的顺序，分泌的这些酶可依次作用于害虫的体壁，使其降解，以便于孢子萌发产生的芽管能够透过体壁进入体腔(范艳华2006)；（4）侵入，随着宿主体壁降解，侵染丝逐渐侵入虫体并在宿主体腔内肆意繁殖；（5）分泌毒素，昆虫病原真菌侵入害虫前需要克服其保卫反应，而分泌毒素在是此过程中至关重要的一环。另外还有研究显示，真菌感染可引起寄主的肠道菌群紊乱，肠道细菌负荷显着增加，细菌多样性显着降低。此外，真菌释放毒素还会下调中肠中的抗微生物肽和双氧化酶表达，加速寄主死亡(Weietal.2017)；（6）致死，被侵染后，昆虫体腔作为虫生真菌的适生环境之一，菌丝在其内肆意蔓延生长，继而攻击昆虫的各个器官，诱发僵虫病，最终形成僵虫，当环境条件适合时，体腔内的菌丝也可以透过体壁，在僵虫体表生长并萌发形成孢子层，成为病原菌再次侵染的来源(洪华珠和李星1991)。前三个阶段的实现与否，决定了真菌是否成功入侵和感染寄主，当其菌丝在寄主体内大量增殖到一定程度时，就可使寄主死亡(刘艳艳2016)。由此可知，昆虫病原真菌对寄主的侵染过程中，每一步都会受到一系列内在和外在的综合因素影响，它们的致病力必然会受自身的侵染力以及宿主昆虫的敏感性的影响。而且，目前还有研究表明，草食动物诱导的植物挥发物水杨酸甲酯和薄荷醇对昆虫病原真菌的生长和致病性也有积极影响(Linetal.2017)。图1-1虫生真菌的侵染的过程图（Wangetal.2017）Fig.1-1Schematicoftheinfectionprocessofentomopathogenic（Wangetal.2017） 第一章文献综述31.1.4研究现状当前在生产上已得到普遍应用的主要是白僵菌以及绿僵菌(李月等2017)，大量的绿僵菌和球孢白僵菌的商业配方已经被开发并用以作物保护。同时棒束孢作为一类昆虫病原真菌前途无限，由于它杀虫谱广，同时方便大规模生产加工，逐渐被人所重视，现在也已经被开发成杀虫剂并广泛应用在害虫生物防治工作中(孙召红2011)。1.1.4.1绿僵菌绿僵菌（Metarhizium）属于半知菌类，初期菌落呈白色茸毛状，待到产孢阶段时，从菌落中央开始呈现出深浅不一的绿色孢子堆，然后菌落的颜色由绿、灰绿至黑色或维持最初色泽，或呈现翡翠绿，基质背面呈浅栗色，少部分菌种呈红褐色，孢子梗直立不弯曲，单枝或分枝，分生孢子卵圆至长形，单胞顶生，并以粘液粘连在一起成链状(贾春生2002)。绿僵菌可通过体壁感染寄主，诱发昆虫产生绿僵病，成为僵虫，之后菌丝穿透寄主体壁，并在体表形成孢子层。绿僵菌的生长适温为20-30℃，在25℃下最适宜生长和产孢，生长发育要求环境相对湿度大于93%RH，在98%-100%RH范围内最为适宜，在PH为4.7-10.0的环境中都可以存活，但PH为6.9-7.2时最好，即在弱碱弱酸的前提下，其生长较好且产生的分生孢子量较多(周玉宝2011)。绿僵菌作为昆虫病原真菌之一，普遍存在于全球各国的土壤中，在19世纪80年代，它首先被发现是一种生物防治剂，是最早被开发利用的生防真菌之一(张彦丰等2015)。有研究显示，绿僵菌属能寄生约200种昆虫，包括8个目，30个科(何学友等2011)，此外线虫和螨类也可被寄生，目前正在使用这种真菌防治四种类型的主要害虫（甲虫，白蚁，沫蝉和蝗虫）(Zimmermann2010)。它绿色无污染、对人畜无毒，是一种行之有效的生防真菌(王鹏等2010)。病原真菌入侵是宿主和病原体之间生理和生物化学彼此作用的结果，它可以途经体壁，气门和口器等各种部位感染宿主(Gillespieetal.2010)，其中从体壁侵入是主要侵染方式，这充分展现了真菌的特点。现在中国已经可以工业化加工绿僵菌生物制剂，每克商品可产50亿个孢子，孢子萌发率达91%，用绿僵菌防治害虫已越来越普遍(钟少雄和陈玉柳2012)。高书晶等人(2011)进行了杀蝗绿僵菌防治草原蝗虫的田间试验，11天后，防治效果超过了65%。由于以绿僵菌为代表的虫生真菌的独特侵染方式，在防治鞘翅目昆虫成虫上与其他病原微生物相比有很大的优势。蔡守平(2017)在应用绿僵菌进行的林间防治星天牛成虫试验中，接种13天后，林间成虫死亡率可至100%，LT50为5.93天。并且在天然的状态下，它能够长时间生活在土壤中并依然保持活性，因此与其他病原真菌相比，它在土壤地下害虫的防控上具有显著优势，张亚波等人(2015)从被感染的蛴螬幼虫上分离得到黄绿绿僵菌，然后利用该菌对筛胸梳爪叩甲的幼虫进行室内毒力测定，试虫的校正累计死亡率为57.14%。在国外，大量绿僵菌也被开发研究。利用棕色绿僵菌的两个菌株处理松毛虫卵的试验中，致死率在96％至99％之间，处理松毛虫幼虫，绝大多数幼虫在头2-4天内 457株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究被杀死，其死亡率可达94％-100％之间(Aydınetal.2018)。1.1.4.2白僵菌白僵菌（Beauveria）属半知菌类，菌落绒状，菌丝较细呈乳白色。白僵菌易于人工培养，在温度为5-35℃，尤其是23-28℃时，最适合生长。其菌丝在pH值为4-5时繁殖最快，长势最好，在pH值为6.0时最适于产孢。对于分生孢子的存活力则与所处环境的温湿度有紧密的联系，若环境的温度高于35℃，湿度大于70%RH时会显著抑制孢子存活性(杨红艳2010)。有研究显示，在自然状态下，温度在0-10℃范围内时，该菌的侵染单位不会萌发(林华峰等1999)。白僵菌作为一种虫生真菌，其发展历史早、推广面积大，有着适应能力强和宿主范围广的特性，它的寄主除了包括直翅目、鳞翅目、鞘翅目、同翅目等在内的15个目149个科521个属的有害昆虫外，还起码涵盖6个科、7个属、13种蜱螨目的虫子(李增智1990)。它致病性强，田间残效期长，即使在越冬期依然能感染36%-55%的幼虫，导致它们翌年无法羽化，连年施药能显著削弱虫口量，这是其他农药所不及的。此外，自然状态下，该属真菌的分生孢子产生量相对较大，据悉，自然界中，由白僵菌致病死亡的虫数约占患病昆虫总量的20%(高红等2011)，并且对紫外线的抵抗能力较强，紫外线照射20分钟，孢子存活率仍有12%。因此，白僵菌常被选为真菌杀虫剂在害虫生防中大量使用，成为农林害虫综合治理中应用最多的昆虫病原真菌之一，其中最常见的是球孢白僵菌及布氏白僵菌。据悉，前苏联主要是将白僵菌用在马铃薯甲虫的防治上，非洲国家多用于防治二化螟(Ramanujametal.2017)，美国常用它来控制林业害虫，而国内用它防控的昆虫超过40种，杀虫功效超过80%。在利用五株虫生真菌对铜绿丽金龟的幼虫的感染实验中，毒力最强菌株的最高感染率达到了95.83%(赵文琴等2005)。白僵菌对酒蛆也展示出突出的杀虫活性，经田间测试发现，用药一周后，防治效果为81.15%，药后三周，防虫效果达85.19%(周仙红等2014)。白僵菌除了在农业上有很大的应用价值，在卫生防疫上也有不错的表现，据资料报道，它对传播疾病的淡色库蚊有很高的杀病力(Benzinaetal.2018)。1.1.4.3棒束孢棒束孢属（IsariaFries）的大多数成员是重要的昆虫病原真菌(李春如等2007)，它们除作为一种生防菌外，还是重要的资源昆虫，在医药卫生、食品保健、环境保护以及基因工程等领域均有涉足。现在普遍被研究和应用的一般是粉棒束孢、淡紫棒束孢和玫烟色棒束孢。粉棒束孢的杀虫谱广，能有效地杀灭囊括同翅目、鞘翅目、鳞翅目等在内的多个目的害虫，在世界范围内被广泛普及(代永东等2016)。淡紫棒束孢有较强的杀虫活性，在胞囊线虫以及根结线虫的防治上有良好的效果，其发酵液也可促进植物生长，如今，中国已开展相关的液体发酵生产工业，在大豆胞囊线虫防治上被大规模应用，防治效果超过60%(章西2015)，在北美和欧洲已经把它用于温室害虫的生物防治，目前已 第一章文献综述5有该农药产品被登记在册，多在温室粉虱、蚜虫、蓟马和介壳虫的防治中发挥作用(FarguesandBon2004;孟祥云2011)。但目前玫烟色棒束孢在中国的产业化水平还比较低,而在国外已经出现了部分相关的商品,如墨西哥和委内瑞拉分别有注册登记的Pae-sin和Bemisin等(王滨等2018)。1.2黄粉虫简介黄粉虫(TenebriomolitorLinne.)俗称面包虫，属昆虫纲，鞘翅目，拟步行甲科，粉甲虫属，它一生可分为四个阶段—卵、幼虫、蛹和成虫(徐世才等2017)。它是一种大型的仓储害虫(马群等2017)，在极端的干燥环境下依旧能顺利完成整个生长发育过程(徐玲等2017)。它的卵为米粒状，乳白色，长约1-2mm，在24-34℃的温度，55%-75%的湿度下最适合发育，卵期普遍为7-8天；幼虫黄色有光泽，长约35mm，生长适温在22-34℃之间，要求空气湿度是65%-75%RH，生长期为100-122天，并且经试验标明，处于28℃条件下，可以加快黄粉虫幼虫生长速度，相应地可缩短其幼虫期以增强繁殖力(田海林等2016)；蛹约长2-3cm，开始为白色半透明，质软，渐变红棕色后变硬，最恰当的生长温度为25-30℃，空气湿度为65%-75%，蛹期通常为8-10天；成虫呈椭圆形，长约14mm，宽约6mm，初羽化的成虫甲壳薄且软，呈乳白色，然后为黄褐色至黑褐色，有光泽，待发育完全时，外壳变厚变硬，最适宜的生长温度为22-35℃，湿度为55%-75%，生长期为45-60天，有研究认为，饲养黄粉虫时，最合适的生活温度为25℃，饲料含水量最好达20%(陈光道等2017)。综上所述，对黄粉虫整个发育期而言，当温度为22-32℃时适合生长，而最佳的温度为25-30℃。黄粉虫拥有杂食性，群集性以及负趋光性的特点(黄祥财2008)。它饲养简单、营养丰富，对畜禽等动物是一种很好的饲料，黄粉虫蜕也常被当作真菌培养基。同时，由于黄粉虫活动性差，饲养方式简单易行，食料来源丰富，生活周期相对较短，能实现实验室内大规模饲养，所以国外科研人员早已把它们选作试验昆虫(Battaetal.2010)。近年来广大从事科研工作的人员常把黄粉虫用作实验材料，多用于药品和食品开发、环保和制造生物柴油等，并在饲料生产、食品加工和保健品研发等领域进行了深入的探究，获得了一些重大突破，所以它是一种集饲用、食用、环保等多种用途于一身的昆虫资源，很值得被开发和利用(奚增军和徐世才2018)。其次，黄粉虫易于受昆虫内生真菌的侵染而常被当作诱饵，诱集土壤中的病原真菌。李会平等人(2006)顺利采用黄粉虫从各个土样中诱集并分离到了球孢白僵菌，分离率为45%。而且由于它的易感性，也常作为真菌培养过程中的养分之一，增加真菌的产孢量，保持菌株毒力的稳定性(陶淑霞等2017)。此外，它也是强致病性昆虫病原真菌菌株初步筛选的首选模式种，马丽娟等人(2012)在筛选对对斜纹夜蛾的高效菌株时，就先用黄粉虫幼虫初筛出强致病性菌株，然后才对靶标害虫斜纹夜蛾进行生物测定，以此选出更合 657株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究乎生产需求的高质量菌株。1.3室内生物测定法生物测定法（特指杀虫剂生物鉴定）是以昆虫类别以及药剂作用方式为基础创立而成的规范的抗药性检测法，是评价某一杀虫剂对特定昆虫及螨类发挥效力大小的农药生物鉴定法，基于杀虫剂侵入虫体的部位及路径的差异，生物测定常被分为胃毒毒力测定以及触杀毒力测定两大类(马玉婷等2017)。1.3.1点滴法点滴法的目标害虫一般是黏虫、蚜虫、螟蛾、家蝇、叶蝉等。点滴法是用微量注射器、微量点滴仪或毛细管，将适量的待测样品滴在昆虫身体的某一部位，如试虫的胸背或胸腹部，待药液侵入虫体后，施展杀虫活性。接种后，将供试虫体放在瓶中，在适宜的温湿度条件下饲养，一定时间段后，观察统计供试昆虫的存活率和死亡率。将剂量对数作为x轴，概率值为y轴制图，计算该昆虫半致死剂量LD50(夏仪等2017;张帅等2011)。对比抗性级别判断标准，评价试虫的抗性水平，然后根据公式（抗性倍数=抗性种群的LD50/敏感种群的LD50）计算抗性倍数。这一方法由于其施药量相对精准，便于操作而被广泛应用。但点滴法通常需要较多的目标昆虫，要求精准一致的施药部位，而且施药量和药液扩散面积要相等，否则对实验结果会产生较大的干扰。1.3.2喷雾（粉）法喷雾（粉）法的目标害虫一般是东方黏虫、小菜蛾与烟粉虱等。此方法是根据供试药品的剂型选用恰当的喷雾或喷粉设备，然后将适当浓度的杀虫剂均匀喷洒到盛有害虫的容器内，让试虫在活动过程中与之充分接触，等药液蒸发殆尽或虫体沾粉稳固后，把供试昆虫转换到药效试验前的生长条件下恢复1-2h，而后按时检查并记录试虫的生长发病和死亡的情况。喷雾（粉）法在昆虫抗药性研究方向应用较为普遍(GuillNetal.2014;Herronetal.2014;JM.Wangetal.2012)，它是经过杀虫剂接触虫子体壁进而引发其中毒死亡的，属于触杀性毒力鉴定。该方法快速简便，与田间状况最接近，能够同时用不同浓度的药剂处理大批供试昆虫。然而，用该方法喷药时的压力是影响药物喷施均匀性的重要因素，另外，有时胃毒作用的可能性也不能完全消除。1.3.3药膜法药膜法一般适用于黏虫、蚜虫、白蚁和小菜蛾等虫体较小的昆虫。这一方法的基本操作是把合理量的杀虫剂放在容器内，随后匀速转动，使其匀称地涂布于滤纸或容器壁上，晾干后形成一个药膜，而后投入试虫，让其活动一段时间后，转换至适宜的培养环境中，一段时间后定期观察试虫的发病死亡情况，以半数击倒时间（KT50）即以击倒50% 第一章文献综述7供试群体所消耗的时间来显示或衡量供试杀虫剂对该目标害虫群体的毒力(门兴元等2011;王艳斌等2017)。此方法更贴近实际情况，而且简单易行，是利用昆虫的活动过程，当虫体与药剂直接充分接触时，药剂便可途经昆虫表皮进到其体腔使之中毒，所以该方法隶属触杀毒力测定。1.3.4浸渍法浸渍法被普遍运用于蚜虫、蓟马、黏虫、二化螟、蝗虫等昆虫的室内毒力测定，是将药剂按一定比例稀释成一定的浓度，用镊子或滤网将健康的供试虫体浸渍在药剂溶液中，一定的时间段后取出虫子，用滤纸将虫体体表多出的药液吸去，再放入养虫室内饲养，96h后根据虫子的死亡情况估计药剂毒力或其对供试药剂的抗性(任远航等2016;张秀霞等2016)。该操作的原理是触杀毒力测定，操作简单，易于使用，常绘制LD-P（纵轴为死亡率，横轴为药品浓度对数值），求毒力回归方程和LC50评价药品毒力(Chandrasenaetal.2011;Ebrahimietal.2016)。1.3.5浸叶法浸叶法适用于小菜蛾、甜菜夜蛾和叶螨等害虫。其基本操作是将供试药品配制成不一样的浓度梯度，再将大小一致的叶片放在药液中浸泡10s左右，然后将叶片背面朝上放在带滤纸的容器上晾干，每个浓度为一处理，每个重复三次，每次接种30头供试昆虫，一天后检查昆虫死亡情况(柴建萍等2017)。浸叶法是利用害虫取食浸过药品的叶片的方式而使药剂施展效果的，因此该方法属于胃毒毒力测定。这一方法步骤简单，易于操作，在昆虫的抗药性实验中也经常被利用(VastradandLingappa2004)。王玲(2016)改进该方法，设计出药管浸叶法。此方法主要是用2mL的离心管代替培养皿，然后将其与叶片同时浸药后再喂食叶螨，以便尽可能施展杀虫剂的触杀及胃毒活性，他们利用传统的玻片浸叶法与药管浸叶法同时测定同种杀螨剂对室内截形叶螨种群的毒力，通过比较发现，用药管浸叶法做药效试验时，杀虫剂对截形叶螨的毒力发挥更灵敏，生物测定的效果更好。1.3.6人工饲料混药法人工饲料混药法一般用于黏虫、棉铃虫、夜蛾等鳞翅目昆虫的毒力测定。基本步骤首先是把药品和饲料根据合适的配比在器皿内均匀混合，每个样品设3个生物学重复，每次处理20-50头虫子，然后在适宜的温湿度下培养，5d后开始检查试虫的生长发育情况，统计死亡率(PintoandFiuza2003)。该方法是通过害虫取食带毒饲料，使药剂进入消系统而发挥药效，所以是胃毒毒力测定法之一。 857株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究1.4菌种筛选菌种筛选就是为了满足科研或生产的要求，从自然界或人工诱变体中，应用合适的方法，筛选出合乎标准的个体。在实际操作中，多是几种方法结合使用，利用多种测试指标综合考虑。一般常根据菌种的生物学特性结合对防治对象的毒力测定进行筛选，也可以利用分子生物学的方法筛选出优良高效菌株。1.4.1生物学特性比较不同菌株的致病力不同，并且基于特定培养条件下，其菌丝生长量，产孢量，产孢率，孢子萌发率等生物学性状也会存在一定的差异，有些可能存在一定程度的相关性。所以良好的生长性状也是评价一个高效菌株的基本标准。生产上通常会优先考虑菌丝繁殖量大，产孢量多，孢子萌发率高的优良菌株。根据相关研究表明，对于以绿僵菌为代表的虫生真菌来说，一般菌株菌丝生长量越大，孢子萌发率越高，则该菌株的致病性也相应的越强。1.4.2毒力测定当前对高效致病菌株的筛选一般是针对目标害虫的毒力测定。首先收集菌株的分生孢子，然后配成一定浓度的孢悬液或不同浓度梯度的孢悬液，采用适当的生物测定方法，对目标害虫进行室内毒力测定或实施大田试验，根据特定时间段内的试虫的死亡率或致死中时（LT50）等指标，分析供试菌株的致病力。1.4.3分子生物学方法由于在生命科学和化学研究方向的持续进步，人们对生物体的研究已经逐步深入到微观水平。以活体进行毒力测定为基础，在分子水平上，结合致病基因定向筛选策略，可以定向获得一批高效菌株。这种方法可以更直接、更快捷地挑选出符合要求的个体，但是对操作技术要求高。目前通过使用白僵菌属和绿僵菌属的种类作为模型，分子生物学研究揭示了在真菌-昆虫相互作用中起作用并因此促成真菌毒力的基因，以此可以提高真菌毒力和抗逆性的遗传改良，对昆虫病原真菌的了解将增强昆虫病原真菌在野外防治虫害的成本效益(C.WangandWang2017)。1.5研究的目的和意义多年来，化学药剂的使用一直都是从事种植业的劳动者们用来控制害虫的实用性方式，但基于它们对非目标生物，地下水以及农药残留物的影响迫使该行业科研人员将重点放在替代药剂的研发上。伴随全球在有害生物综合管理领域的加强，人类对生物农药 第一章文献综述9的渴求也与日俱增。来自昆虫病原真菌的分生孢子在当前生物农药市场中作为感染单位发挥主要作用(Muñiz-Paredesetal.2017)。以白僵菌和绿僵菌为代表的昆虫病原真菌杀虫剂的开发、研究和应用已经越来越受到人们的青睐，已经被大量开发并应用于农林害虫的综合防治中，是应用最广的昆虫病原真菌。此外棒束孢也因寄主范围广，对人畜安全无害而逐渐被重视，在昆虫生物防控中占据越发重要的位置。因此要全面了解昆虫病原真菌，能更好的发挥虫生真菌作为生防菌株的作用，我们需要筛选出高致病性的菌株。而且生防菌株的生活力、侵染力、毒力等直接决定其商业价值(何恒果等2004)。目前优势致病性菌株的筛选多是利用菌株对防治的毒力测定或是根据毒力测定与特定培养条件下菌株的生物学特性相结合来判断。由于肉眼可直接观察到菌落的特征，所以探究菌落特性与其产孢能力和致病性之间是否存在不可避免的相关性，能为高质量菌株筛选提供便利的筛选方法(韩燕峰2007)。但是很少有人探究菌株感染寄主后的产孢量与其致病力是否存在某种联系，而且菌株感染虫体后的产孢情况更接近自然的实际情况。所以本研究通过人工饲料混药法，测定57株昆虫病原真菌的分离株进行致病力，经过初步筛选，挑出强致病性菌株，然后再对其感染虫体后的产孢量进行测定，对各菌株有初步的了解，综合分析筛选出高质量菌株，进而探究致病力和虫体产孢量的关系，希望建立二者之间的联系，为强致病菌株的筛选以及后期该生物制剂的生产提供依据，使其能更好的为生产实践服务。 1057株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究第二章实验材料与方法2.1实验材料2.1.1供试菌株供试57株昆虫病原菌（43株绿僵菌、8株白僵菌、6株棒束孢）为本实验室从四川土壤中分离，经SDAY培养基培养，用20%甘油保存在-80℃下备用。2.1.2供试虫体黄粉虫蛹购自淘宝，由本实验室人工饲养、选择健康适宜的幼虫为供试幼虫。2.1.3实验器具表2-1实验器具Table2-1Instrumentsusedinthisstudy实验仪器型号公司倒置显微镜尼康TE2000-SNikonNeubauer改进的血细血球计数板LaudaKönigshofen血球计数器人工物候培养箱RGL-P系列合肥华德利科学器材有限公司涡旋混合仪QL-861海门市麒麟医用仪器厂震荡培养箱HZQ-F100太仓市实验设备厂超净工作台SWCJ-JD苏净净化设备有限公司中国江苏徐州盛世玻璃器皿有组培玻璃瓶240mL限公司高压灭菌锅MLS-3751LPanasonic电子天平TX223LSHIMADZU移液器ResearchplusEppendorf陕西华大科技有限公司培养皿19×15mm广东广州亚北酒店用品有限公不锈钢油筛80目司2.1.4化学试剂甘油、吐温20、卡那霉素、四环素2.1.5培养基制备按照表2-2配制，121℃灭菌20min，冷却至50-60℃时加入抗生素。 第二章实验材料与方法11表2-21/4SDAY培养基的配方Table2-2formulaof1/4SDAY成分含量葡萄糖40g/L琼脂20g/L酵母浸出粉10g/L蛋白胨10g/L2.2实验方法2.2.1黄粉虫饲养根据Masoudi（2018）等人的方法，饲养蛹和幼虫阶段。黄粉虫的蛹是商业提供的，保存在塑料盒中，直至成虫出现。随着羽化收集成虫，使之处于培养箱（27℃，L：D=16：8，70±5％RH）中并以小麦麸皮进行饲养。饲养至幼虫阶段时，即可挑选体型大小相似的第六龄至第七龄健康幼虫（1.2cm-1.5cm）作为供试虫体。2.2.2孢子准备2.2.2.1菌株复苏从-80℃冰箱中取出贮存在20%甘油中的56株昆虫病原真菌，在超净台中，取适量菌液，接种在1/4营养强度的SDAY（23mL，4mm）培养基上，用涂布器均匀涂抹，然后用封口膜封口，于温度为25±1°C、相对湿度为75±5%RH的培养箱中黑暗培养。一周之后揭掉封口膜，以降低培养皿中的湿度，增加各菌株的产孢量。培育18天后，待其充分产孢，取出备用。2.2.2.2带菌饲料配制各菌株经1/4SDAY培养基培育18天后，在超净工作台中，用无菌木铲轻轻地刮下56株昆虫病原真菌的分生孢子，分别收集到盛有0.02％吐温-20的无菌水溶液的50mL试管中。然后用无菌不锈钢油筛过滤含分生孢子的悬浮液，以筛去初始悬浮液中的菌丝体。利用涡旋振荡器震荡每个悬浮液，使孢子链分散，配成分布均匀的孢子悬浮液，然后通过血细胞计数器立即估计每个悬浮液的分生孢子浓度。首先应用连续稀释法将样品稀释后，取10μL的待测孢子悬液滴加到血球计数板上有方格刻度的位置上（为防止出现气泡，要将洁净的盖玻片从板的一侧缓慢放下，以使样品布满计数板的刻度），而后用倒置显微镜观察计数，每毫升悬浮液的孢子数=平均每格的孢子数×104×稀释倍数(臧欢等2013)。根据Masoudi（2018）等人的方法，将分生孢子悬浮液与饲料充分搅拌，混合均匀， 1257株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究通过各菌株分生孢子的浓度和无菌小麦麸皮的干湿比重差异，将用于生物测定的分生孢子悬浮液在无菌小麦麸皮基质中调节至2×108个分生孢子/g灭菌饲料的终浓度，并且确定麦麸基质的含水量约为45-50％。2.2.2.3确定分生孢子活力要测定所有带菌的小麦麸皮基质（2×108个分生孢子/g）中昆虫致病真菌分离株的分生孢子活力。首先将0.5克带菌饲料稀释于1mLddH2O中，然后用血细胞计数器对每个样品的分生孢子量进行计数，将孢子浓度调节至1×106个分生孢子/g，然后将100μL的分生孢子悬浮液平铺在整个培养基表面（1/4SDAY），最后在温度为25±1ºC且完全无光的环境培育。24小时后，用显微镜察看各个菌株的孢子萌发状况，只有芽管长度超出分生孢子长径的1/2或短径即判断为萌发，根据萌发率（%）=（孢子萌发数/孢子总数）×100%，计算孢子萌发率(王双等2017)，确保所有供试菌株的分生孢子萌发率始终大于95％。2.2.3毒力测定每个菌株为一处理，每个处理各进行三个生物学重复，标记为R1、R2、R3，每个重复有15只幼虫被处理（总共每次处理45头幼虫）。参照Masoudi（2018）等人的方法，采用人工饲料混药法，将供试的黄粉虫幼虫置于无菌的240mL透气带盖的圆形玻璃组培瓶中，用配制好的带菌饲料（2×108个分生孢子/g），在温度为25±2℃，相对湿度为55±5％RH，光周期为（L：D）14:10的人工培养箱中进行饲养。如上所述处理对照昆虫组，但用0.02％吐温20的无菌水溶液替代真菌孢子悬液。真菌接种后，每天定期观察并统计幼虫的死亡率，持续18天。将感染的幼虫尸体分别置于具有保湿滤纸的无菌24孔塑料培养板内，置于湿室（>90％RH）中培养并检查致病症状。基于接种后18天内宿主每天的死亡率，估算平均生存时间（MST）。2.2.4虫体产孢量测定将死后18天的被感染的幼虫尸体从湿室中取出，从三个重复（R1、R2、R3）中，每个重复各随机挑选5个僵虫（共855个僵虫）。并将这些具有真菌分生孢子生长的虫体单独浸入含有5mL无菌0.02％吐温20的5ml试管中，接着放于恒温摇床培养箱中，以27℃，220rpm，搅拌30分钟。然后将所得分生孢子悬浮液短暂涡旋2min后，将样品连续稀释后取10μL于血球计数板上，然后在倒置显微镜下进行统计。2.2.5数据分析根据单个黄粉虫虫体在2×108个分生孢子/g浓度的带菌饲料的饲养条件下18天内每天的死亡率，利用Kaplan-Meier法计算平均生存时间（MST），然后通过在线工具 第二章实验材料与方法13OASIS的Log-rank法检验差异显著性，以此比较各菌株的致病性(Hanetal2016)。对于产孢量的测定，首先将每个供试菌株侵染虫体后的产孢量进行平方根转换，然后通过单因素方差分析(ANOVA,a=0.05)，用Tukey-KramerHSD检验比较差异显著性。最后利用皮尔逊相关系数法评价MST和供试菌株侵染虫体后的产孢量之间的相关性。以上两项分析均在JMPSAS13.2.0中进行。 1457株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究第三章实验结果分析3.1被真菌感染症状供试的虫生真菌分离株对黄粉虫幼虫均有很强的致病性，黄粉虫幼虫被昆虫病原真菌侵染后，症状表现基本相似，一般从第2天开始，供试幼虫的活动能力逐渐减弱，取食量减少，用镊子触碰虫体，其行为反应明显迟钝，虫体略微肿胀，随着真菌菌丝在昆虫体腔内蔓延，供试虫体逐渐僵硬。僵虫体表颜色油亮发黄，经25℃下保湿培养18天后（图3-2）可看到，僵虫体表均被菌丝包裹并长出孢子层，但其颜色因病原菌株的不同而有所差异，随着孢子增多，其颜色也逐渐加深，当孢子层不断增厚并且肉眼可见，形成触之即落的粉被时，意味着虫体被消解，然后消失(曾纬等2012)。ABC图3-2感病幼虫的产孢情况A：感染白僵菌的幼虫；B：感染绿僵菌的幼虫；C：感染棒束孢的幼虫Fig.3-2SporulationofsusceptiblelarvaeA:infectedlarvaeofBeauveria;B:infectedlarvaeofMetarhizium;C:infectedlarvaeofIsaria3.2对试虫的致死率利用不同白僵菌、绿僵菌和棒束孢的全部57株昆虫病原真菌菌株对黄粉虫幼虫致病力的初步测定显示在表3-3中，生物测定中使用的所有昆虫致病性真菌分离物均发现对黄粉虫幼虫存在致病性，且不同属的真菌或同属的不同菌株对同种供试昆虫的致病性表现出显著性差异。死亡率最高的为100%，最低为62.76%；其中有24株真菌对试虫致死率达到100%，占所测试菌株数量的42.1%；同时也有24株真菌对试虫致死率在90%以上，占所测试菌株数量的42.1%；其中有5株真菌对试虫致死率在80-90%，占所测试菌株数量的8.8%；对试虫致死率在80%以下的菌株只占所测试菌株数量的7.0%。 第三章实验结果分析153.3平均生存时间以平均存活时间（MST）及其差异性作为比较各菌株致病性的标准，由表3-3可知，供试的大多数昆虫致病性真菌分离株对供试幼虫具有7至9天的致死时间，而绿僵菌属的分离株ZHS-123（M.pingshaense），LDS-07（M.robertsii），YYC-095（Metarhiziumsp.）和YYC-099（Metarhiziumsp.）和白僵菌分离株BJZF-02（B.bassiana）对黄粉虫幼虫的致死平均时间大于10天。其中环链棒束孢分离株ILT-01（I.cateniannulata）和平沙绿僵菌分离株SH-060（M.pingshaense）杀死的黄粉虫幼虫的速度比所有其他的昆虫病原真菌分离株快，它们对应的MST分别为5.67天和5.91天，虽显著不同于绿僵菌分离株YYC-082（M.robertsii;6.25天），SH-054（M.pingshaense;6.82天），白僵菌分离株BYYC-05（B.asiatica;6.33天），SH-089（B.bassiana;6.49天），BYYC-07（B.bassiana;6.77天）和棒束孢ILDS-04（I.cateniannulata;6.33天）（表3-3），但是它们的致病性都很高，在昆虫的综合防治中具备很大的潜在开发及应用价值，值得进一步研究利用。表3-3黄粉虫幼虫感染不同昆虫病原真菌菌株的平均生存时间和校正死亡率Table3-3MeanSurvivalTimes(MSTs)andCorrectionmortalityofTenebriomolitorlarvaewithdifferententomopathogenicfungi(EFs)species分离株平均生存时间95%置信区间校正死亡率EFsisolatesMST(±SE)*95%ConfidenceintervalCorrectionmortalityM.pingshaenseSH-0487.29(0.17)abcdefghi6.95~7.62100.00%YYC-0227.73(0.22)abcdefghijkl7.30~8.16100.00%ZSH-0369.24(0.47)hijklmno8.32~10.1790.70%ZSH-0389.38(0.45)ijklmnop8.50~10.26100.00%SH-0638.8(0.33)efghijklmno8.16~9.44100.00%SH-0088.26(0.37)cdefghijkl7.53~8.9895.35%ZHS-12311.03(0.53)opq10.00~12.0686.01%YYC-0878.64(0.34)hijklmno7.99~9.30100.00%LDS-0509.14(0.38)ghijklmno8.40~9.8897.63%LDS-0569.29(0.39)hijklmnop8.53~10.05100.00%YXZ-0187.48(0.20)abcdefghij7.09~7.8697.75%SH-0546.82(0.25)abcdefg6.32~7.32100.00%SH-0037.00(0.17)abcdefgh6.66~7.34100.00%SH-0605.91(0.14)ab5.63~6.19100.00%M.robertsiiYYC-0797.95(0.31)abcdefghijkl7.34~8.5797.75%YYC-0668.07(0.29)bcdefghijkl7.51~8.63100.00%YYC-0249.79(0.55)jklmnopq8.72~10.8790.66%YYC-0826.25(0.19)abc5.88~6.6297.75%LDS-1627.88(0.42)abcdefghijkl7.06~8.7099.95%LDS-00710.61(0.53)nopq9.57~11.6590.70%YYC-0838.60(0.31)defghijklmn8.00~9.20100.00% 1657株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究YCC-0887.02(0.18)abcdefgh6.66~7.38100.00%YYC-1649.95(0.51)lmnopq8.95~10.9586.67%YYC-1039.09(0.32)fghijklmno8.46~9.72100.00%YYC-0918.73(0.40)efghijklmno7.95~9.5097.75%LDS-0138.47(0.38)cdefghijklmn7.72~9.21100.00%SH-0128.27(0.31)cdefghijklm7.67~8.8797.75%Metarhiziumsp.YYC-0697.84(0.30)abcdefghijkl7.25~8.4299.95%YYC-1659.93(0.84)klmnopq8.27~11.5862.76%YCC-09510.54(0.56)mnopq9.43~11.6490.70%YYC-0998.93(0.52)fghijklmno7.90~9.9697.63%YYC-10111.83(0.75)q10.36~13.3169.74%YYC-0218.54(0.62)cdefghijklmn7.33~9.7590.66%SH-1368.44(0.55)cdefghijklmn7.37~9.5283.63%YYC-0809.88(0.53)fghijklmno8.00~9.7674.38%YYC-1578.88(0.45)fghijklmno7.84~9.9190.70%M.brunnuemSH-0587.04(0.33)abcdefgh6.39~7.70100.00%SH-0896.39(0.20)abcd5.99~6.7997.75%JZF-0199.54(0.57)ijklmnop8.43~10.6681.36%SH-1727.78(0.41)abcdefghijkl6.98~8.58100.00%M.bibionidarumSH-0019.96(0.63)lmnopq8.73~11.2065.09%SH-0539.42(0.62)ijklmnop8.21~10.6383.68%M.guizhouenseSH-0707.95(0.39)abcdefghijkl7.19~8.7297.75%B.bassianaBYYC-076.77(0.14)abcdef6.49~7.0599.95%BJZF-078.45(0.25)ijklmnop7.97~8.9397.63%BJZF-017.91(0.33)abcdefghijkl7.27~8.56100.00%BSH-029.63(0.39)lmnopq8.87~10.39100.00%BJZF-0211.58(0.40)pq10.80~12.3799.95%BSH-037.66(0.24)abcdefghijkl7.19~8.1397.75%BSH-046.49(0.21)abcde6.08~6.90100.00%B.asiaticaBYYC-056.33(0.17)abcd6.00~6.67100.00%I.cateniannulataILT-015.67(0.17)a5.34~5.99100.00%IYYC-038.86(0.39)abc8.10~9.6299.95%IYYC-019.76(0.31)ijklmnop9.15~10.37100.00%IJZF-067.60(0.22)abcdefghijk7.18~8.02100.00%ILDS-027.66(0.24)fghijklmno7.19~8.1397.75%ILDS-046.33(0.17)abcd6.00~6.67100.00%CK17.5(0.35)r16.81~18.194.44% 第三章实验结果分析17注：基于2×108个分生孢子/g的接菌浓度和对照组的每天死亡率，运用Kaplan-Meier生存分析来估算MST。组织了三次重复，每个菌株共处理45只幼虫。观察18天内每天的死亡率，并且在25±2℃，55±5％RH和14:10（L：D）下饲养幼虫。*MST后的不同字母表示各组间的显著性（P<0.05,Tukey-KramerHSD检验）。Note:Kaplan-MeiersurvivalanalysiswasusedtoestimateMSTforeachisolatebasedondailymortalityreadingusing2×108conidia/gconcentrationandacontrol.Threereplicationswereconductedandeachincluded45larvae.Themortalityratewasobservedfor18daysandthelarvaerearedat25±2°C,under55±5%RHand14:10(L:D)photoperiod.*DifferentlettersafterMSTindicatethegroupsofsignificance(P<0.05,Tukey-KramerHSDtest)3.4虫体产孢量被侵染虫体上产生的孢子是虫生真菌再次侵染的主要来源，为了使筛选的菌株能更好的为生产实践服务，我们统计了各菌株的产孢量。于接种量为2×108个分生孢子/g饲料的浓度下，被真菌感染致死的黄粉虫幼虫在人工物候培养箱中培养18天后，虫体表面上均获得了真菌分生孢子。但是根据图3-3可知，定量的孢子侵染寄主后，各菌株的产孢量间却存在极为显著差异（ANOVA，F=123.134，df=56，P<0.0001）。由图3-4可知，球孢白僵菌的分离株BJZF-07（B.bassiana；16.37×107个分生孢子/昆虫）的分生孢子产量最高，而球孢白僵菌菌株BJZF-01（B.bassiana；0.59×107个分生孢子/昆虫）分生孢子产量最低。但是，绿僵菌属的分离株LDS-007（M.robertsii；14.45×107个分生孢子/昆虫），LDS-050（M.pingshaense；15.16×107个分生孢子/昆虫），YYC-088（M.robertsii；14.54×107个分生孢子/昆虫），SH-054（M.pingshaense；15.18×107个分生孢子/昆虫），YYC-091（M.robertsii；14.77×107个分生孢子/昆虫）与BJZF-07之间并无显著性差异。同样，绿僵菌分离株SH-008（M.pingshaense；1.98×107个分生孢子/昆虫），棒束孢分离株IJZF-06（I.cateniannulata；0.99×107个分生孢子/昆虫）和ILDS-02（I.cateniannulata；0.93×107个分生孢子/昆虫）与BJZF-01也无显著性差异。基于BJZF-07、LDS-162、LDS-007、YYC-088、SH-054、YYC-091和BJZF-07的高产孢量，它们更容易被生产加工，可以更好的被运用于大生产中。综合毒力测定测定的结果，SH-054在致病力和产孢量的表现均较好，有很可观的应用前景。 1857株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究Numberofconidia/insect(×107)0510152025YYC-069b,c,d,eYYC-079k,l,m,nMetarhiziumspp.YYC-165r,s,t,uYYC-095t,u,vIsariasp.SH-048s,t,uSH-053t,u,vBeauveriaspp.YYC-066k,l,m,nYYC-024i,j,k,l,mYYC-101p,q,r,s,tYYC-082e,f,g,hSH-001w,x,yYYC-022l,m,n,o,p,qSH-058q,r,s,t,uZHS-038c,d,eYYC-099u,vZSH-036d,e,f,gSH-063d,e,f,gSH-089h,i,j,k,lSH-008x,y,zYYC-021u,vZHS-123o,p,q,r,s,tLDS-162b,c,dSH-012e,f,g,h,iSH-136m,n,o,p,q,r,sYYC-087n,o,p,q,r,s,tYYC-80u,vLDS-007a,b,cLDS-050a,bSH-070i,j,k,l,mYYC-083f,g,h,i,j,kYYC-088a,b,cLDS-056l,m,n,o,p,qYXZ-018de,f,g,hSH-060j,k,l,mFungalpathogensisolatesYYC-164v,w,xYYC-157o,p,q,r,s,t,JZF-019n,o,p,q,r,s,t,SH-054a,bYYC-103p,q,r,s,t,uYYC-091a,b,cLDS-013d,e,fSH-003l,m,n,o,p,qSH-172l,m,n,o,p,q,rILT-01p,q,r,s,t,uIYYC-01r,s,t,uIYYC-003s,t,uIJZF-06y,zILDS-04u,v,wILDS-02y,zBYYC-07k,l,m,n,o,p,qBJZF-01zBSH-04b,c,d,eBJZF-02y,zBYYC-05k,l,m,n,oBSH-02g,h,i,j,k,lBJZF-07aBSH-03e,f,g,h,i,j图3-3不同种的昆虫病原真菌在虫体上的产孢量Fig.3-3invivoconidiationofdifferententomopathogenicfungi(EFs)species 第三章实验结果分析19注：记录的孢子数量是从被真菌感染并在饱和湿度下的环境室中培养18天后黄粉虫幼虫体表回收的。所呈现的值是从三个重复中随机选择的15个黄粉虫幼虫的孢子量平均值（±SE）。误差栏上方的字母表示差异性组（ANOVA,Tukey-KremerHSD检验,α=0.05）。Note:Numberofconidiarecoveredfrommycosedmealwormlarvae18daysafterdeathandincubationinanenvironmentalchamberundersaturationhumidity.Valuespresentedaremean(±SE)from15mealwormlarvaerandomlyselectedfromthreereplicates.Thelettersabovetheerrorbarindicatethegroupofsignificance(ANOVA,Tukey-KremerHSDtest,alpha=0.05).3.5MST与虫体产孢量的关系在自然界中，被侵染虫体的产孢量是真菌进行下一轮侵染的来源，为了能够寻找一种特异性的指标，用于强致病性菌株的筛选中，我们分析了MST与虫体产孢量的关系。利用皮尔逊相关系数分析可知，在显著性水平P=0.1299上，相关系数r=-0.2067。由于P>0.05，所以在统计学上，二者不存在显著性相关，即不能通过分离株在虫体上的产孢量多少来直接判断菌株的致病力大小。如ILT-01对黄粉虫的致病力最高，但是它的产孢量为6.63×107个分生孢子/昆虫，比最高产孢量低了约0.6倍。白僵菌分离株BJZF-07（B.bassiana；16.37×107个分生孢子/昆虫）的分生孢子产量最高，但是对黄粉虫的致病力却不是最高。不过即使存在例外，但是通过相关系数分析（图3-4），也可以看出二者之间有微弱的负相关性，即致病性越高，产孢量相应较高。所以综上所述，产孢量指标仅可以在菌株筛选过程中作为一个参考，不足以作为判断菌株致病力的特异性指标。 2057株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究图3-4虫体产孢量与MST的关系Fig.3-4RelationshipbetweeninvivoconidiationandMST 第四章结论与讨论21第四章结论与讨论4.1结论本研究通过对分离保存的包括白僵菌、绿僵菌和棒束孢在内的57株昆虫病原真菌对黄粉虫幼虫的致病力进行评估发现，供试的虫生真菌分离株对黄粉虫幼虫都有很强的致病力。其中约84.2%的分离株对黄粉虫幼虫的致死率在90%-100%之间，且致死率为100%菌株约占总数的42.1%。比较18天后供试幼虫的平均生存时间（MST），初步筛选出对黄粉虫幼虫具有高致病性的菌株ILT-01和SH-060，该菌株对应的MST分别为5.67d和5.91d。除此以外，YYC-082、BYYC-05、ILDS-04、SH-089、BYYC-07、SH-054也同样表现出高致病性。通过毒力测定实验，带菌饲料中的孢子会通过黄粉虫幼虫的体壁感染虫体，并且在虫体表面会产生分生孢子。将感染的虫体经过18天的保湿培养后，经观察体表均长出了孢子层。通过对真菌在感病虫体上的产孢量测定，我们发现尽管在定量的接种浓度下，各菌株的产孢量依然表现出显著性的差异，其中BJZF-07的产孢量最大。同样的LDS-007、YYC-088、SH-054、YYC-091和BJZF-07也具有高产孢量，所以它们更容易被生产加工，可以更好的被运用于大生产中。综合毒力测定与产孢量评估的结果，SH-054在致病力和产孢量均有出色的表现，具有较高的开发应用价值。对于ILT-01和SH-060，虽然产孢量不高，但是具有较高的毒力，可以后期通过优化培养条件，增加它们的产孢量，更好的为生产实践服务。所以SH-054、ILT-01和SH-060均值得被关注，具有很大的开发潜力。此外，为了寻找一种快捷的检测手段来够区别菌株毒力，我们从统计学的角度上分析了MST与虫体产孢量之间的关系。首先各菌株在侵染寄主后的产孢量彼此存有显著性差异，这说明侵染宿主后的产孢能力是病原菌菌株本身的特性，但是对于产孢量和致病力的关系，在本实验条件下，通过对MST与产孢量之间关系的分析，我们知道在显著性水平P=0.1299的条件下，相关系数r=-0.2067。P>0.05，即在统计学上，本实验条件下测得，二者不存在显著性相关关系，不能通过分离株的产孢量来直接判断菌株的致病力。不过尽管有例外，但是通过相关系数也可以获知二者间也存有微弱的负相关性，即致病性越高，产孢量相应较高。因而虫体产孢量指标仅可以在菌株筛选过程当中作为一个参考，还不足以作为一个强致病菌株筛选的特异性的评价指标。4.2讨论开发利用微生物资源杀虫剂已成为当前我国植保发展的重要方向，而我国有得天独 2257株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究厚且丰富多样的土壤资源，它又是供昆虫病原真菌繁育的天然培养基，所以还有很多已发掘和亟待发掘的致病真菌，在众多被分离的菌株中挑选出更符合生产要求的菌株显得尤为重要，其中首要是评价菌株的毒力(何越超等2017)。以往关于绿僵菌等昆虫致病真菌的毒力鉴定多采用浸渍法(Ebrahimietal.2016;李保国等2016)，而本试验则采用了更贴近实际的测定方式，将确定浓度的孢悬液按比例与饲料混合，使试虫在自由活动及取食中被感染致死。但除了杀虫效果外，产孢量是开发真菌杀虫剂需要考虑的必要因素之一，若菌株产孢量小，即使杀虫效果十分好，也不能很好地用于大规模生产。胡本进等(2013)基于菌株产孢量结合对玉米螟的毒力测定，筛选出的优势菌株，经田间防效试验测得，该菌株能显著削减三代玉米螟的越冬数量；代晓彦等(2016)，经过对5个白僵菌菌株的产孢量和室内毒力测定的综合分析，也成功筛选出两个对防治柑橘木虱有开发潜力的菌株；本实验选择通过结合菌株毒力和僵虫体上产孢量的测定，从而初步筛选出3株具备开发价值的菌株，可以为杀虫剂选择提供参考。在整个实验中，我们通过活体生测的筛选可以得到致病性强的菌株，但这是在人为设置的培养环境下获得的结果，所以若要更好为生产服务，仍需更进一步筛选测定并开展田间药效试验，而且在生产实践中，由于防治对象不同，温度，湿度等环境因子的影响，菌株的致病性也存在不稳定性。目前已有相关人员在此基础上进行田间蝗虫防治探究，在此就不多赘述了。因此在实践上应用前，还需要综合考虑，进行合理筛选，以发挥菌株最佳药效，达到最好的防治效果。目前，很少有人研究过虫体产孢量与菌株致病性间的关系，但是对于在人工培养基上的产孢量与其毒力之间的关系却常被关注研究。韩燕峰(2007)曾通过几组简单的比较分析，说明供试菌株在PDA培养基上的产孢量和其对小菜蛾的致病力之间存在正相关的关系；徐阿妹(2013)也证明了蝗绿绿僵菌Mf82在固体培养基上的产孢量与毒力之间存在明显相关性；王成等人(2017)也通过对比玫烟色棒束孢在培养基上的产孢量和对二斑叶螨的致病力，分析得到，两者之间有一定正相关性。但是也有经室内毒力试验证明，球孢白僵菌产孢多少和各菌株对松毛虫的毒性大小间无显著相关性(樊美珍等1994)；林华峰等(1999)也证明了白僵菌的菌落产孢量与菌株对松毛虫的致病力无明显相关性。由此可见，产孢量测定值难以作为筛选高致病性菌株的一个特异性标准，而且在此过程中也比较容易产生人为误差。但是毕竟通过孢子侵染是昆虫病原真菌侵染宿主的主要手段，张慧等(2016)研究发现，产孢量能够作为同一菌株致病性评判的指标。而且根据Johny等(2012)的研究证明，在利用真菌接种时，分生孢子的产生和扩散作用在各影响因素中占主导地位的，所以在保证菌株高致病力前提下，为了能更好发挥虫生真菌的药效，更好的应用于生产中，其产孢量还是应该越多越好，因此应该完善菌株培养条件，增加其产孢量。 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2857株昆虫病原真菌致病力和虫体产孢量研究致谢两年的研究生生活即将结束，这期间我有过困惑，有过焦虑，有过崩溃，但是更多的是开心。因此在即将结束我学生身份的时候，有很多不舍，也有很多要感谢的人。首先谢谢我的老师—王敦教授对我的栽培，从实验设计到论文撰写都给予了我很大的帮助与支持。他平易近人，强调实践，信任学生。也正是由于对我们的信任，他不会做到事无巨细,但是教会了我们自主，自立，自律。其次谢谢Abolfazl始终对我保持无限的耐心，实验过程中对我不厌其烦的指导和一如既往的鼓励，感谢许建师兄与李凤娇师姐为我答疑解惑，对我有求必应，感谢刘龙师兄，任泽苇师姐和赵亚琦师姐在生活上和学习上的关心与照顾，感谢裴晓亚同学陪我一起成长，感谢我的师弟们—唐鱼，余肖，王亚杰和郑吉阳带给我很多欢乐，感谢实验室的Nilakshi、Mandira、Upendra、Mutamad、Saif等留学生带给我的友好。总之，很感谢实验室每个人的真诚相待,很幸运能够与你们一起学习工作，遇见你们很幸福。最后，特别感谢我的家人，做我最坚实的后盾，感谢他们对我毫无保留的付出，义无反顾的支持，给予我无限的宽容与理解。在此,希望你们所有人都健康快乐，好运常伴，也衷心祝愿植保院越来越好，西农越来越好，我国的农业越来越好！本研究受国家自然科学基金（31670659）、杨凌示范区产学研用协同创新重大项目（2017CXY-12）和林业公益性行业科研专项（201404403-09）支持，特此鸣谢！赵梦西北农林科技大学2018年5月 作者简介29作者简介赵梦，女，1994年1月出生于河北邯郸。2012年9月—2016年7月于河北农业大学植物保护学院动植物检疫专业学习，获得理学学士学位；2016年9月至今于西北农林科技大学植物保护学院植物保护专业学习，攻读王敦教授的硕士研究生。
