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分类号：S851.38单位代码：10193密级：公开学号：20160834专业硕士学位论文吉林地区猪的四种重要传染病血清流行病学调查SerologicalinvestigationoffourimportantDiseasesinPigsinJilinProvince作者姓名：郑洲阳学位类别：农学硕士专业名称：兽医硕士研究方向：兽医指导教师：赵权教授所在学院：动物科学技术学院2018年5月 I 摘要戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus,HEV）是一种经粪-口途径传播的一种急性人畜共患传染病。HEV已成为一种全球性疾病，而发展中国家是主要高发地区。猪作为HEV重要的储存宿主及感染源，造成HEV在猪和人类中广泛传播，严重危害人畜健康的成长。副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS)是一种主要以呼吸道感染和关节炎为主要临床特征的接触性细菌传染病。HPS影响着猪生长发育的各个环节，是一种常见但易忽略的重要细菌病，广泛存在世界各国养殖场。猪传染性胸膜肺炎(Porcinecontagiouspleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)感染而引起的严重急性可致死性呼吸道传染病。PCP至今蔓延至全世界各个猪场，并常与多种疾病混合感染，严重损害养猪业的健康发展。衣原体(Chlamydophila)是可感染多种动物和人的一种专性细胞寄生的细菌性传染病。衣原体可通过途径传播并引起猪产生多种不同的临床症候群，一旦感染难以净化的人畜共患传染病。为了探究吉林省HEV、HPS、PCP和衣原体的流行态势和风险因素，本研究从吉林省8个地区共采集946份猪血清。分别应用商品标准化的ELISA和IHA试剂盒进行检测，结果显示：HEV总体阳性率为34.99%，不同地区、年龄和季节差异极显著（P<0.0001），且怀孕母猪阳性率为50.72%显著高于其他年龄。风险因素分析显示地区、年龄和季节考虑为HEV的风险因素；HPS阳性率为21.04%（199/946），不同地区和年龄差异极显著（P<0.0001），数据分析显示地区和年龄考虑为HPS的风险因素；PCP感染的阳性率为26.32%（252/946），地区差异极显著（P<0.01），不同地区和季节统计分析显示为PCP感染的风险因素；衣原体总体阳性率为26.11%（247/946），地区差异极显著（P<0.0001），地区因素考虑为衣原体感染的主要风险因素。本研究首次对吉林省部分地区HEV、HPS、PCP和衣原体流行态势开展调查研究，为养猪业潜在危害病原在我省猪场流行情况提供基础数据，极具公共卫生学意义。关键词：戊型肝炎病毒；副猪嗜血杆菌；猪传染性胸膜肺炎；衣原体；流行病学调查II AbstractHepatitisEvirus(HEV)isanacutezoonosispathogenstransmittedviathefecal-oralroute.HEVhasbecomeaglobaldisease,whiledevelopingcountriesarethemajorareasofhighincidence.PigasanimportantHEVstoragehostandsourceofinfection,resultinginthewidespreadtransmissionofHEVinpigsandhumans,aseriousthreattohumanandanimalhealth。Haemophilusparasuis(HPS)isacontagiousbacterialinfectionthatispredominantlycharacterizedbyrespiratorytractinfectionsandarthritis.HPSaffectsallaspectsofpiggrowthanddevelopment,isacommonbuteasilyoverlookedimportantbacterialdisease,widespreadinallcountriesfarms.Porcinecontagiouspleuropneumonia(PCP)isasevereacutefatalrespiratorydiseasecausedbytheinfectionofActinobacilluspleuropneumoniae(APP).PCPhasspreadtoallfarmsthroughouttheworld,andoftenmixedwithavarietyofdiseases,seriouslyunderminingthehealthydevelopmentofthepigindustry.Chlamydophilaisanobligatelycellularparasiticbacterialinfectionthatinfectsavarietyofanimalsandhumans.Chlamydiacanbetransmittedthroughthepathwaysandcausepigstoproduceavarietyofdifferentclinicalsyndromes,onceinfectedwithdifficulttopurifyzoonoticdiseases.ToexploretheepidemiologicalandriskfactorsofHEV,HPS,PCPandchlamydiainJilinProvince,946swineserawerecollectedfrom8districtsofJilinProvince.TheproductsweretestedbyELISAandIHAkitrespectively,TheresultsshowedthattheoverallpositiverateofHEVwas34.99%,withsignificantdifferenceindifferentregions,ageandseason(P<0.0001),andthepositiverateofpregnantsowswas50.72%Significantlyhigherthanotherages.Theanalysisofriskfactorsshowedthattheregional,ageandseasonswereconsideredasriskfactorsofHEV.ThepositiverateofHPSwas21.04%(199/946),withsignificantdifference(P<0.0001)betweendifferentregionsandage.ThedataanalysisshowedthattheregionalandagewereconsideredasHPS.ThepositiverateofPCPinfectionwas26.32%(252/946),andtheregionaldifferencewassignificant(P<0.01).ThestatisticsofdifferentregionsandseasonsshowedthattheriskofPCPinfectionwaspositive.TheoverallpositiverateofChlamydialwas26.11%(247/946).Theregionaldifferencesweresignificant(P<0.0001).RegionalfactorswereconsideredasthemainriskfactorsforChlamydialinfection.wefirststudyinvestigatedtheprevalenceofHEV,HPS,PCPandchlamydiainIII someareasofJilinProvinceandprovidedthebasicdatafortheepidemicsituationofpigspotentiallyhazardousinpigbreedingindustryinourprovince,whichisofgreatpublichealthsignificance.Keywords:HepatitisEvirus,Haemophilusparasuis,Porcineinfectiouspleuropneumonia,Chlamydia,EpidemiologicalsurveyIV 目录摘要.......................................................................................................................IAbstract......................................................................................................................III前言.......................................................................................................................1第一篇文献综述.........................................................................................................21.1戊型肝炎病毒...................................................................................................21.2副猪嗜血杆菌..................................................................................................41.3猪传染性胸膜肺炎...........................................................................................61.4衣原体..............................................................................................................71.5研究目的及意义...............................................................................................9第二篇研究内容.......................................................................................................10第一章戊型肝炎病毒血清学调查...........................................................................101.1实验材料.........................................................................................................101.2实验方法........................................................................................................101.3结果分析........................................................................................................111.4讨论................................................................................................................131.5小结................................................................................................................14第二章副猪嗜血杆菌的血清学调查.......................................................................152.1实验材料.........................................................................................................152.2实验方法........................................................................................................152.3结果分析........................................................................................................152.4讨论................................................................................................................172.5小结................................................................................................................18第三章胸膜肺炎放线杆菌血清学检测...................................................................193.1实验材料.........................................................................................................193.2实验方法........................................................................................................193.3结果分析........................................................................................................193.4讨论................................................................................................................213.5小结................................................................................................................22第四章衣原体血清学检测.......................................................................................234.1实验材料.........................................................................................................234.2实验方法........................................................................................................234.3结果分析........................................................................................................234.4讨论................................................................................................................254.5小结................................................................................................................26结论.....................................................................................................................27参考文献.....................................................................................................................28作者简介.....................................................................................................................34致谢.....................................................................................................................35 前言戊型肝炎（HepatitisE）是由戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus,HEV）引起以黄疸为主要临床特征的人畜共患传染病。该病毒可引起妊娠妇女和患病孕妇达25%的致死率，其病死率远高于其他型肝炎的感染。据统计分析全球每年都有上千万人感染该病，其中大约有330万人出现HEV感染的临床症状，而有5.66万人因该病致死。猪作为该病毒重要的传播载体，不仅可导致人群感染该病，而且还严重威胁着养猪业的健康发展。时至今日，该病已流行于亚洲、非洲和美洲等多数发展中国家。我国多个省市也是HEV的高发地区，每年造成上千万头猪感染，给养猪业造成巨大经济损失，同时严重影响公共卫生安全。副猪嗜血杆菌（Haempohliusparasuis,HPS）又称格拉泽氏病（Glӓsser'sDisease）是重要的呼吸道疾病，常可导致断奶仔猪和保育猪出现纤维素性浆膜炎、心包炎、脑膜炎和多发性关节炎。该病一年四季均可发生，广泛流行于猪群并可引发多种疾病混合感染，是30-50日龄猪高发细菌性疾病，初次感染小猪致死率较高，严重威胁着猪群的健康成长。猪传染性胸膜肺炎(Porcinecontagiouspleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的急性呼吸道传染病。该病主要感染育肥猪群，一年四季均可发生感染，除冬季其他季节都是该病的高发期。当前，APP流行60年现已经分布于全世界，我国也随着养殖规模不断的扩大，陆续在各个省市发现该病的存在。由于APP血清型众多，导致不同地区血清型差异显著且造成的致病力也不同，因此给我国猪群的免疫防控造成巨大压力，严重阻碍养猪业的发展。衣原体(Chlamydiaceae)为专性细胞寄生性一种微小生物，其大小介于立克次氏体与病毒之间。衣原体广泛的存在于多种野生动物及哺乳动物，并且是一种人畜共患传染病。其感染猪常可引起较多的炎症反应如心包炎、肠炎、胸膜炎、关节炎、结膜炎和流产等，严重危害各种年龄段猪群的发育成长，成为养猪场潜在的致病微生物。本研究应用高效准确的检测方法，针对戊型肝炎病毒、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌和衣原体病原进行血清学流行病学调查。通过对数据统计分析，掌握吉林部分地区以上四种潜在危害性疾病流行态势，并通过预判风险因素，制定吉林地区针对这四种疾病的预防措施。为吉林地区养猪场预防及防治计划，提供直观具体的数据及理论支持。1 第一篇文献综述1.1戊型肝炎病毒1.1.1病原概述戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus,HEV）属于戊型肝炎病毒科，戊型肝炎病毒属[1]。HEV无囊膜，单股正链的RNA病毒，直径为27-34nm的不规则球形病毒颗粒。其有两种不同的内部形态，一种是蔗糖梯度离心沉降系数185S的密集型病毒颗粒，另一种是沉降系数为165S有基因缺失的不完整病毒粒子。其在蔗糖溶液中的浮力密度为130mg/cm3,在酒石酸钾中为118mg/cm3。HEV对多种化学试剂较为敏感，如氯仿、高盐和氯化铯都可使其活力下降。有研究表明HEV对温度敏感性较高，4℃可使病毒裂解，60℃至煮沸就可使其灭活失去感染能力[2]。HEV进化史表明该病毒已存在数百年，现分为4种基因型：主要有流行在亚洲、非洲和美洲的人源特异性基因1型和2型，基因3型和4型作为动物源病毒常可传染给人类，其中基因3型广泛流行于猪群中[3-4]。HEV基因组全长约为7.2kb，基因组5’端有帽子结构(cap)，3’端Poly(A)尾结构，共计编码3个相互重叠的开放阅读框ORF1、ORF2和ORF3。ORF1是由约5kb核酸编码1693aa组成的非结构蛋白，该非结构多聚蛋白与病毒的复制和蛋白修饰密切相关[5]。该结构域形成了RNA解旋酶、RNA依赖性RNA聚合酶、木瓜样半胱氨酸蛋白酶和甲基转移酶，而且该阅读框中还有X结构域和Y结构域的功能仍然值得探索[6-8]。ORF1是HEV中基因突变最高的区域，不同毒株的高变区（HVR）的变异也不尽相同[9]。ORF2由2000nt编码660aa组成病毒的衣壳蛋白，ORF2是HEV的重要结构蛋白，主要负责及参与包裹病毒RNA基因组、病毒的装配、诱导中和抗体产生与靶细胞受体互作等。通过脉冲追踪研究和微粒体膜使用表明ORF2蛋白含有可将蛋白质转移到内质网（EB）中N-端信号序列，使蛋白质获得N-端糖基化的修饰[10]。ORF3与ORF1和ORF2都有部分重叠，是最小的开放阅读框，由369nt编码123aa。有研究表明ORF3作为HEV的辅助蛋白，影响着宿主感染应答[11]。ORF3蛋白与富含脯氨酸的蛋白同源性较高，但是通过对ORF3序列分析显示其与任何其他蛋白或其他典型特征的蛋白都没有同源性。该蛋白由2个大的N端疏水结构域D1（7-23aa）和D2（28-53aa），2个富含脯氨酸的结构域P1（66-77aa）和P2(95-111aa)共同组成。有研究表明ORF3蛋白参与调控信号通路MAPK中Erk通路，从而促进细胞的存活及增殖[12]。ORF3蛋白中的P2结构域可与SH3结构进行互作反应，这一发现被认为很可能是ORF3蛋白可与细胞内多种蛋白的结合反应调控细胞环境，从而利于病毒的感染和复制[13]。2 1.1.2临床症状及病理变化戊型肝炎是广泛存在于全世界的人畜共患传染病，主要引起急性黄疸等症状。戊型肝炎也是一种自限性疾病，临床特征性症状较少，且因HEV引起的症状是非特异性并在很短的时间内消失，多数病例呈现无症状过程[14]。人感染该病的潜伏期平均40天左右，青壮年和老年人是易感人群，临床常出现发热、呕吐、食欲减退、全身无力并且伴有腹痛等症状，严重患者尿液、皮肤和眼睛等会出现较严重的发黄。该病致死率较低，但是孕妇感染病死率可达20%，并出现流产和死胎等，严重影响生育率[15]。HEV感染常导致肝脏肿大等病理特征，在慢性感染患者中，对肝脏活检发现肝细胞胞质疏松、变性细胞增多，并出现细胞间隙增宽及微绒毛大量增长等病理变化[16]。HEV也可感染多种动物，但是HEV在大部分动物中感染不会出现明显的临床症状，只是呈现亚临床感染状态。猪作为HEV重要的传播载体，当猪感染HEV时，患猪体温比正常猪高1℃左右，并出现厌食、呼吸困难、咳嗽等症状，严重病例可出现腹痛、呕吐、腹泻和眼膜等可视粘膜黄染现象。剖检可观察到病猪肝脏有明显的出血点、肝门淋巴结和肠系膜淋巴结肿大等特征。病理学分析显示，大量肝细胞变性坏死，肝细胞溶解坏死，门静脉周围并伴有单核和淋巴细胞浸润等病理变化[17]。1.1.3流行病学研究HEV作为一种重要的人畜共患传染病，其不仅可以感染人，而且也是猪、啮齿类、灵长类、禽类、兔和其他动物的重要的致病源。HEV流行于全世界，主要在南亚（印度、尼泊尔、不丹和巴基斯坦等国家）、东南亚（缅甸、泰国和越南等国家）、中亚（哈萨克斯坦等）、北非（苏丹等）、西非（尼日利亚等）、东非（布隆迪）和中美洲等发展中国家成为该病的主要流行区域[18]。HEV近些年来在欧洲发达国家（德国、英国和法国等）平均每年只有将近100例病例被报道，而实际中真实感染发病的病例比血清学检测的阳性数据更低[19-20]。在发达国家中该病只呈散发流行的状态，因为发达国家具有完整的医疗公共卫生体系[21-22]。1956年HEV在印度发生第一次大流行，感染人数一度达到约2.9万人，随后该病相继在我国、尼泊尔、索马里和乌干达等国家爆发。1986年HE在我国新疆等地爆发，约有十多万余人感染至今为止成为全球最大的一次爆发，死亡病例达700人[23-25]。近些年，我国也是HE感染的重灾区，据报道在北京、广东、福建、河北和长春等20多个省市地区均有该病的报道[26-29]。而且，从2003年起HE患病率不断升高，2009年数据统计发现我国HE占急性病毒性肝炎的感染率已经达到31.62%[30]。HEV严重危害人类生活健康，然而猪又作为HEV重要的天然贮存宿主和我国人群多喜欢猪肉作为食品的情况，造成戊型肝炎病毒在我国广泛流行，严重威胁人类生活健康。有研究发现，2011年在法国猪场随机抽取的186个猪场，有65%的猪场都有至少一例血清抗体阳性动物[31]。同样的调查研究对西班牙和挪威猪场血清学调查显示抗HEVIgG的阳性猪分别为98%（204/208）和90%（137/153）[32-33]。彭大平等学者从东莞市15个镇3 （街）屠宰场共收集225份血清，结果显示屠宰场HEV的阳性率高达61.33%[34]。据报道，有学者从新疆阿克苏地区的8县1市采集1660份猪血清，血清IgG检测表明抗体阳性率达53.25%[35]。有学者对上海市郊区4个养猪场收集1798份血清样品，检测HEV阳性率为89.38%[36]。邵洪伟对长春市多种动物和人开展HEV血清学流行调查，共采集猪血清820份、牛血清506份、羊血清273份和农村猪饲养员血清182份、农村非养猪人102份和城镇人群血清546份，对HEV抗原抗体检测结果显示猪群阳性率高达72.8%、牛11.86%、羊20.26%，饲养人群阳性率为20.88%、非饲养人群15.38%和城镇人群4.58%，暗示猪群是HEV主要的感染源，而人群与猪接触越多的工作者感染的机会也越来越高[37]。HEV阳性率久高不下的原因很有可能与发展中国家落后的公共卫生环境有关，然而更重要的一点是猪群是HEV最主要的天然贮存宿主，这也是猪群HEV具有较高的直接原因，因此对猪群HEV的防控刻不容缓。1.1.4防控研究对于当前HEV高流行率，多基因型的复杂流行态势，开展针对戊型肝炎有效积极的防控对公共卫生学安全意义重大。HEV曾由于缺少利于其稳定复制增长的细胞系，而未能成功开发传统的灭活疫苗和减毒疫苗[38-39]。经过多年的研究，我国在2012年成功上市全球首个HEV-293疫苗，该疫苗以1型HEV研制，但可以交叉保护4型HEV的感染[40]。该疫苗在Ⅲ期临床试验阶段对招募者的试验中，即表现出良好的安全性和100%免疫保护效果。然而，针对猪群还没有商品化的疫苗，因此研发一种针对猪群的疫苗，可从传染源切断HEV的传播。猪群作为HEV重要的动物宿主也是人源戊型肝炎的传染源，因此通过加强管理对养猪场饲养环境的改变和饲养人员进行疫苗免疫。通过对养猪场污水进行洁净化处理、粪便和病死猪等无害化安全化处理，减少HEV的传播途径。日常生活中，人们禁止食用未煮熟和病死猪的肉及内脏，可有效的防止病从口入，降低HEV在人类和动物中的传播途径。1.2副猪嗜血杆菌1.2.1病原概述副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS)是巴斯德氏菌科，无芽孢，无鞭毛，兼性厌氧的革兰氏阴性菌。其形态多样，多为球杆状，也有形态为长杆状或细丝状[41-42]。HPS可引起30-50日龄仔猪多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎等全身性疾病的一种急性接触性细菌病[43-44]。副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏(Glӓsser'sDisease)病，因其在1910年首次报道了一种可定殖于鼻腔并引起病猪纤维素性浆膜炎和关节炎等一系列炎症的细小短杆菌而被认知。HPS在1922年由Schermer和Ehrlich成功分离培养，该菌喜欢低氧环境且其生长需要严格的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）即V因子[45]。HPS较难分离培养，因为其酶分泌系统较不完整必须在含有V因子的厌氧条件才4 可生长良好。当HPS与金黄色葡萄球菌在鲜血琼脂培养基上垂直划线一同共培养，置于37℃5%CO2培养箱30h左右，即可观察到其呈现良好的“卫星生长”现象且无溶血，因为金黄色葡萄球菌在生长时可分泌V因子，所以越靠近葡萄球菌的HPS生长良好菌落略大，而偏远的菌落长势略差[46]。HPS血清型较多，当前多使用KRG琼脂扩散血清学实验作为HPS血清分型的重要依据，当前检测到HPS有15个不同的血清型，但仍然有至少20%的菌株血清型不能被鉴别[47]。当前研究显示，1、5、10、12、13和14型为强毒株，2、4和15为中等毒力毒株，8型毒株为弱毒株，其余血清型为无毒株[48]。我国主要以毒株4、5和13血清型为当今养猪场的主要流行株[49]。HPS生化特性为可发酵葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，触酶试验阳性，脲酶和氧化酶试验均为阴性，相对其他细菌较不活泼。1.2.2临床症状及病理变化副猪嗜血杆菌常感染2-8周龄小猪，出现呼吸道发炎及关节炎等炎症。病猪主要分为急性和慢性感染。急性感染病例病猪体温突然升高，厌食、精神沉郁和皮肤有红斑并表现呼吸困难，鼻腔伴有浆液性或粘液性分泌物。有的病猪表现关节肿胀、关节积液、步态僵硬及跛行等症状，数天之内病猪抽搐或颤抖多以死亡转归[50]。慢性感染多出现发烧、厌食、精神萎靡、进行性消瘦，皮肤苍白发紫、皮毛暗淡无光、毛发粗乱。如不及时治疗，病猪可突然发病死亡或成为僵猪并继发链球菌、巴氏杆菌、蓝耳病毒和圆环病毒等感染，最终由于多种迸发症而死亡。对病死猪解剖检查常可见，胸腔粘连，腹腔粘连并有大量淡黄色积液存于胸腹腔。心包可见干酪样或豆腐渣样渗出物，并可见绒毛心症状，心肌有大量出血点[51]。肺脏与胸腔壁有大量纤维素性粘连，且部分肺脏出现肉样变呈间质性肺炎。脾脏边缘梗死、全身淋巴结肿大且呈暗红色样，关节肿大，关节腔内存有浆液性的渗出液[52-53]。1.2.3流行病学研究HPS感染广泛存在于全球大多数国家，同时也是我国二类动物疫病。其血清型较多且致病力不同，常与多种重要传染病混合感染的一种败血性细菌病。带菌猪及慢性感染猪是HPS主要的传染源，该病只感染猪，发病率在10%-15%之间，病猪混合感染的时候致死率可达50%以上[54]。有研究在2003-2004年对全国17个省HPS与其他细菌性疾病感染情况进行流行病学调查，调查结果显示在183例HPS阳性猪中，HPS单独感染的比例仅占34.4%，而与至少两种细菌病原体的感染占65.6%，其中链球菌是与HPS主要共感染的病原占30.6%[55]。车勇良等从福建省8个市23个养猪场共收集到378份猪血清，应用ELISA抗体检测方法对HPS抗体水平进行检测，结果表明23个养猪场HPS均呈阳性，猪群阳性率为36.78%，而52株HPS分离株中以血清13型居多[56]。据报道，马超峰从河南信阳市113家养猪场采集3589份血清进行HPS流行病学调查，结果表明HPS阳性猪场有71个，猪群阳性率为21%[57]。2010年，有学者对河南、广东、浙江和上海等21个省市的发病猪群的6124份病料进行检测，结果分离到4086个病原毒株，其中HPS分离5 到1161株，占比28.4%，而其中HPS发病率较高的省市阳性率可达30.8%[58]。张岩等学者在2012年对新疆石河子垦区开展HPS流行病学调查研究，对105份疑似HPS病料进行检测，结果显示HPS阳性率为27.62%[59]。以上流行病学调查研究显示当前我国养猪场普遍困扰与HPS感染，虽然HPS致死率并不高，但是其引起的多重混合感染给养猪场造成了不可预料的损失。1.2.4防控研究当前针对HPS的防治主要以抗生素治疗及疫苗免疫为主，但是这两种防治方法收效甚微，只能暂时缓解疾病。首先，对HPS的治疗主要集中在抗生素的应用，常用的HPS敏感药物有阿莫西林、替米考星、四环素和青霉素等。但是，由于不同地区不同的治疗方案抗生素的使用频率也不同，所以当前不同地区的HPS有不同的耐药菌株和耐药谱系[60]。魏光河对重庆渝东地区分离的3株HPS进行药敏试验发现，头孢类和粘杆菌素类高度敏感，而对四环素类、喹诺酮类和青霉素类已经明显耐药[61]。目前国内多使用HPS灭活疫苗进行免疫预防，商品化的灭活疫苗也因HPS血清型众多且各血清型交叉保护较差，因此多选择自家苗和当地流行株制备的疫苗，才能获得较好的免疫效果。1.3猪传染性胸膜肺炎1.3.1病原概述猪传染性胸膜肺炎（PorcineContagiousPleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的世界性高度接触性传染性疾病。常引起病猪出现急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维性坏死性胸膜肺炎，并可迅速致死的呼吸道传染病[62-63]。胸膜肺炎放线杆菌为巴氏杆菌科（Pasteurellaceaee）放线杆菌属（Actinobacillus），革兰氏阴性多形态的短小球杆菌，有菌毛和荚膜、有鞭毛、无芽孢的兼性厌氧菌[64-65]。APP需要严格的营养要求和生长环境，根据对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的生长依赖性将其分为生物Ⅰ型（BiovarⅠ）和不依赖型的生物Ⅱ型（BiovarⅡ）。NAD依赖型的APP在生长时需要在培养基中添加V因子，其也可与金黄色葡萄球菌在血琼脂培养基上共生长，形成有溶血的“卫星现象”。依据APP表面荚膜和和脂多糖抗原性的差异分为15个血清型[66]。APP可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖等多种糖类，VP、MR和靛基质试验都为阴性[67]。1.3.2临床症状及病理变化猪传染性胸膜肺炎可分为最急性型、急性、亚急性和慢性4种类型，不同类型其表现的临床症状也不尽相同，但是其对病猪的呼吸系统影响是不可逆转的。最急性型PCP可使猪群突然发病，体温可高达41.5℃，食欲废绝，精神萎顿且出现呼吸困难，有时嘴和鼻腔流出大量泡沫样分泌物。病猪有时无明显症状，一头或多头发病在36小时内突然死亡，一旦发病疫情传播迅速。而急性型病例皮肤发红、精神萎靡、食欲较差，表现气喘、6 咳嗽及严重的呼吸困难等临床症状。发病猪常在2-4天内死亡，耐过猪可转为亚急性和慢性病例。亚急性和慢性病例多为急性型病例转化而来，症状较轻且不明显，只有间歇性的咳嗽，体温略升高。但是由于其病程较长，免疫力明显降低造成其他多种病原微生物的感染，也可能出现死亡[68-69]。剖检观察及主要病变集中在呼吸道及肺内，常表现为双侧性的肺炎，在肺的心叶、隔叶和尖叶出现肉样变且界线清晰。气管、支气管等组织有出血点伴有泡沫状血性粘液，随着病情的发展表现不同程度的肺炎和胸膜炎，最终弥漫性的纤维素性渗出物与胸壁粘连等病理变化[70]。1.3.3流行病学研究猪传染性胸膜肺炎自1957年被发现以来，已蔓延全世界猪场，严重危害猪群的健康成长。由于地区的差异及血清型较多的原因，APP的各地区的流行态势趋于复杂化。我国首次发现该病在1987年，主要以1、2、3、5、7型作为主要流行毒株，各地区的血清型差异也较为显著[71]。据报道，2007年对河南周口市开展PCP流行病学调查，共采集猪血清844份，进行APP抗体检查，结果显示周口市APP血清抗体阳性率达到28.2%[68]。夏新萌等从我国四川、广东、湖南、湖北和福建等省的24个不同规模的养猪场的收集1464份猪血清，并分别应用琼脂扩散试验和猪传染性胸膜肺炎ELISA抗体检测试剂盒进行检测，结果显示琼脂扩散PCP的阳性率为31.84%（378/1187），ELISA抗体试剂盒检测的阳性率为59.21%（164/277），且发现7型是我国主要流行型[72]。谢艳霞等在2014年采集安徽省8个大型和2个中型种猪场共采集血样272份，结果显示有88份感染过APP，阳性率为32.4%[73]。1.3.4防控研究当前，PCP常呈散发状态且隐性感染、带菌与其他病原微生物混合感染。一直是养猪场潜在的危害病原，一旦猪场出现APP感染病例，应及时选择敏感药物并配合做好隔离消毒等疾病控制措施。目前，大量抗生素的应用不仅产生耐药菌株也造成过高的药物残留。另外，因APP毒力因子复杂，血清型众多且交叉保护较差，疫苗免疫预防较为困难。因此，本病多为着手于早发现早治疗，利用实验技术检测猪群的病原，加强饲养管理及环境优化等措施净化病原，对发病猪早隔离及根据药敏试验结果早日开展针对性治疗[74]。1.4衣原体1.4.1病原概述衣原体(Chlamydophila)是一种介于病毒与立克次氏体之间的一种专性寄生在细胞内的微生物。其可通过细胞滤膜呈球状或堆状的革兰氏阴性菌，同时含有DNA和RNA两种核酸，以二分裂方式增殖。衣原体属从9种衣原体更新为12种，其中可感染猪的衣原体有猪衣原体（Chlamydiasuis）、鹦鹉热衣原体（Chlamydiapsittaci）、兽类衣原体7 （Chlamydiapecorum）和流产衣原体（Chlamydiaabortus）[75-78]。有些衣原体也可感染人，当前衣原体有广泛的宿主范围，已知其可感染18个目29科190多余种鸟类、哺乳动物和野生动物等，对人类和动物的健康构成巨大威胁[79,80]。猪作为猪衣原体重要宿主自从1955年被报道以来，常引起猪出现结膜炎、胸膜炎、肠炎、关节炎、心包炎、流产、子宫感染及公猪睾丸炎等。衣原体作为我国二类传染病一旦感染病原难以清除，虽然其广泛传播感染，但是其不是疾病常规检测的病原而被忽视，使猪群一直不能健康生长，损害养猪业的经济效益。1.4.2临床症状及病理变化该病常可诱发多种复杂的临床症状，因其致病力、动物个体差异和管理水平等使病猪状况不同。病猪多表现明显的精神沉郁、体温升高、颤抖及有呼吸急促和干咳等症状。不同炎症类型症状也不尽相同，肠炎型常表现腹泻、呕吐最终脱水类似全身中毒等症状，一旦混合其他病原，病死概率明显增加。关节炎型可见关节肿胀，疼痛跛行，妊娠母猪可致流产、早产、胎衣不下、木乃伊胎和死胎等。公猪会出现睾丸炎、附睾炎和尿道炎等[81]。剖检可见致病的靶器官如心脏、肺脏、胃肠道和关节等均会出现明显的病变，肠道出现急性或卡他性炎症、出血、回肠水肿、小肠浆膜面覆盖白色浆液性纤维素分泌物，脾肿大、肺淤血等[82]。衣原体引起的病理变化与多数疾病症状相同，很难从病理手段确诊，应以病原分离等实验室检查为主。1.4.3流行病学研究衣原体作为一种可引起人畜鸟共患的接触性传染病，常导致严重的繁殖障碍和呼吸系统的损害。该病一年四季流行，各年龄段猪群均可感染，且呈地方散发流行。该病在世界大部分国家普遍流行，德国、意大利和瑞典等国家相继报道，该病的阳性率在33%-95.83%之间[83-85]。由于我国没有商品化的疫苗且该病常被检测所忽略，因此该病常潜藏在养猪场。李云龙等对云南楚雄州的9县1市开展衣原体流行病学调查，对采集的233份的猪血清检测发现衣原体阳性率为18.88%[86]。江海海从江西省11个地区的规模化猪场采集980份猪血清，检测结果显示有539份阳性血清，阳性率达58.59%，且各个地区阳性率在33.33%-90.91%，证实衣原体在江西省流行较严重[87]。有研究在北京郊区5个规模化猪场采集猪血清507份及猪拭子和饲养人拭子分别为183份和17份，显示抗体平均阳性率为14.8%，饲养人员为23.5%[88]。以上调查发现，我国大部分猪场都有衣原体的存在且饲养人员也为带菌者。1.4.4防控研究衣原体感染较难治疗且康复猪也发育不良，猪群一旦发病尽快隔离饲养，病情严重应无害化处理。该病可垂直传播，因此作好种猪的疫苗免疫，是预防感染的重要方式。对于价值较高的病猪，可采用抗生素治疗如四环素、红霉素和土霉素等对衣原体感染有一定作用，最好根据药敏试验结果制定用药方案。配合其他提高免疫力及防控混合感染的药物积8 极治疗。应对圈舍和产房进行严格的消毒计划，对病死胎和胎衣及时处理和消毒减少衣原体的传播途径。有条件猪场最好制定有效的免疫计划，才能从源头控制该病的感染。1.5研究目的及意义众所周知吉林省是全国重要的产粮基地，同时也是生猪养殖大省，2016年吉林省肉猪出栏量即达到1619.3万头，存栏量948.1万头，占全国2.13%并以5%的增速增长。随着环境保护法的严格执行，吉林省成为当前养猪场重要的转移区域。因此，随着养殖产业不断的规模化集约化，养猪场频繁困扰于多种重要但容易被忽视的传染病。本研究对戊型肝炎病毒、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和衣原体这四种重要的猪传染病进行流行病学调查分析，他们不仅影响养猪业的健康发展同时也是重要的人畜共患传染病。因此，通过对当前吉林省部分地区养猪场采集血清样品，利用当前公认的检测方法进行检测分析。分析这四种传染病在吉林省的流行态势，并通过数据统计分析预判风险因素，为这四种病原的防控制定早期预防计划。9 第二篇研究内容第一章戊型肝炎病毒血清学调查戊型肝炎病毒自从被发现以来，广泛流行于全世界大部分国家。HEV是一种严重的人畜共患传染病，早些年在印度和我国新疆地区大规模爆发共计约有15万人被感染，一度成为发展中国家的高危致病源。猪作为HEV的重要传播载体，而且也是其重要的储存宿主，广泛流行于我国养猪场。吉林省是我国重要的养猪基地之一，而HEV在我省猪场报道的相对较少，本研究利用标准的商品化ELISA检测试剂盒对我省HEV开展流行病学调查，了解当前我省HEV的流行态势，丰富流行病学数据并为猪场的免疫防控提供数据支持。1.1实验材料1.1.1血清样品试验所用的猪血采集自吉林省长春市、德惠市、吉林市、延边、白城、四平、通化、辽源地区共采集946份，并详细记录年龄、季节、性别等信息于统计表。1.1.2主要仪器本研究主要使用仪器如下表：表1-1主要仪器Table1-1.Experimentaldevices机器名称型号机器厂家酶标仪1510ThermoFisherUSA高速冷冻离心机5415R德国Eppendorf恒温培养箱3111ThermoFisherUSA洗板机WellwashThermoFisherUSA微量移液器10/200/1000μL德国Eppendorf振荡器VM-03U江苏金坛市金城国盛仪器1.1.3试剂盒HEV抗体检测试剂盒(PrioCHECK®HEV-AbporcinePrionicsAG，Switzerland)1.2实验方法1.2.1血清的采集与处理30kg小猪采血：由助手将猪侧卧保定，两人分别将猪腿部向两边按在地上，使猪保10 持直立躺卧露出肋骨与胸骨结合处的凹陷小窝，用酒精棉消毒此处，垂直进针采血，做好标记，4℃保存。中大型猪采血：首先将保定绳套在猪上颌骨，将猪头部尽量吊的高起，使猪的头颈与水平面呈35℃以上角度，并使猪一条直线，猪呈后退姿势。随后取酒精棉擦拭胸腔凹陷处采血，将血液做好标记，4℃保存。对采集的血液放置于4℃冰箱过夜，第二天3600rpm离心8min后收集上清液，并每100μL分装于离心管内，置于-80℃保存备用。1.2.2样品检测将PrioCHECK®HEV-Abporcine试剂盒从冰箱放置室温15min，按照检测试剂盒说明书操作，步骤如下：（1）分别取10μL阳性对照、阴性对照、临界值对照和血清样品加入抗原包被孔中且每个对照设置两个孔。（2）随后迅速取90μL稀释液加入每个包被孔中，并使用微型振荡器往复振荡3min。（3）小心仔细的的新的密封膜粘在测试板上，置37℃温箱孵育60min。（4）温箱取出包被板，置入洗板机用300μL1×洗液（10×稀释）清洗4次，并在厚纸巾上敲出残留的液体。（5）取100μL1×二抗（100×稀释）加入包被板孔中，并贴上新的密封膜。（6）置于37℃温箱孵育30min，随后再次置入洗板机300μL1×洗液（10×稀释）清洗4次。（7）在包被板内加入100μL显色液（TMB），22℃避光孵育30min。（8）取出加入100μL终止液，并在振荡器中速震动1min。（9）在酶标仪450nm波长读取并记录OD值。（10）试验的有效标准：阳性对照平均OD450减去临界对照OD450值必须大于等于0.3，临界对照平均OD450值减去阴性对照OD450值必须大于0.05，阴性对照OD450平均值必须小于0.15。如果以上结果不满足检测结果无效或重新检测。（11）结果判定标准:临界值=临界对照平均OD450×1.2；检测结果大于或等于临界值的结果判为阳性；检测结果小于临界值判为阴性；如若临界对照平均OD450值和临界值有疑问，需要对样品进行重新检测。1.2.3数据统计分析应用数据统计分析软件SPSS19.0对检测数据统计分析。1.3结果分析1.3.1HEV血清学检测结果11 本研究利用商品标准化ELISA检测试剂盒，对吉林省长春市、德惠市、吉林市、延边、白城、四平、通化、辽源地区的HEV抗体进行检测，共计检测946份血清，阳性样本数为331，HEV总体阳性率为34.99%。其中长春阳性率为34.09%（45/132），吉林市阳性率为42.86%（51/119），德惠阳性率为61.59%（93/151），辽源阳性率27.78%（35/126），通化阳性率30.77%（24/78），四平阳性率为29.93%（41/137），白城阳性率14.17%（18/127），延边阳性率31.58%（24/76），以上结果显示地区之间差异极显著（P<0.0001）。不同年龄段HEV的阳性率在26.47%-50.72%之间，表明不同年龄段之间差异极显著（P<0.01）。然而，对于性别和季节阳性率分别显示差异不显著和差异显著。不同地区、不同季节和不同年龄和性别的具体感染情况见表（1-2）。表1-2吉林不同地区、不同性别、不同年龄和不同季节猪HEV感染情况Table1-2.SeroprevalenceofHEVinfectioninpigsinJilinprovinceaccordingtogeographicallocation,sex,ageandsamplingseason因素类别样品数阳性数阳性率P-value地区长春1324534.09%吉林市1195142.86%德惠1519361.59%辽源1263527.78%<0.0001通化782430.77%四平1374129.93%白城1271814.17%延边762431.58%性别公37411831.55%0.073母57221337.24%年龄<1月龄35110630.20%1-6月龄2175826.73%<0.0001怀孕母猪27614050.72%种公猪1022726.47%季节春2717628.04%夏35615443.26%0.0002秋1153126.96%冬2047034.31%总计94633134.99%1.3.2风险因素分析本研究利用统计软件进行数据分析，对阳性率不同的分组进行风险因素分析。分别对差异极显著的地区、年龄和季节进行风险因素分析，具体参数见表1-3。12 表1-3HEV血清学阳性率不同分组中风险因素分析Table1-3.AnalysisofriskfactorsofHEVseroprevalenceindifferentsubgroups变量样品数阳性数阳性率P-valueOR(95%CI）地区长春1324534.09%3.132(1.693-5.793)吉林市1195142.86%4.542(2.451-8.416)德惠1519361.59%9.71(5.346-17.64)辽源1263527.78%2.329(1.237-4.386）<0.0001通化782430.77%2.691(1.346-5.38)四平1374129.93%2.586(1.394-4.8)白城1271814.17%Reference延边762431.58%2.795(1.395-5.598)年龄<1月龄35110630.20%1.202(0.732-1.972)1-6月龄2175826.73%1.013(0.595-1.726)<0.0001怀孕母猪27614050.72%2.859(1.736-4.711)种公猪1022726.47%Reference季节春2717628.04%1.056(0.647-1.724)夏35615443.26%2.066(1.301-3.280)0.0002秋1153126.96%Reference冬2047034.31%1.416(0.856-2.341)1.4讨论戊型肝炎病毒是一种重要的人畜共患病原，肆虐着广大热带和亚热带发展中国家。我国也是HEV流行的重灾区，先后在新疆等地发生大规模流行[23]。HEV宿主广泛，猪是其主要的带毒动物，严重影响猪群的健康生长。病毒可经过粪便在猪场中粪池大量积累，严重污染了养殖环境，是其广泛传播的主要原因之一。近几年，随着我国养猪业的快速发展，该病在我国又呈上升趋势[16]。自从1978年该病在印度被发现，随后在多数国家也证实其在人群中感染的事实[14]。1995年在尼泊尔家猪中首次检测到HEV的存在，猪源HEV是第一例被发现的动物源HEV[89]。HEV感染可引起严重的病毒血症，自限性急性肝炎和肝衰竭并可能引起多种并发症[90]。当前，HE是一种重大的全球性疾病，至少有30%的人群抗体呈阳性。如此大规模的感染，主要因国家卫生体系发展程度不同和食用带毒动物源肉类引起。猪是HEV的主要动物传播源，而我国不仅是养猪大国且是猪肉消费大国，因此开展HEV的流行病学调查势在必行。伏丽萍在2005年对我国10个省区的34个养猪场1158份血清进行HEV检测，结果显示猪群总体阳性率为57.5%，而这其中有17个猪场阳性率在60%以上[91]。李进涛对昆明地区不同年龄的猪群开展HEV血清学调查，研究发现分为3个年龄段的猪13 群阳性率分别为46.85%（1-2月龄）、57.06%（2-6月龄）和65.42%（6月龄以上），证实了随着日龄的增长阳性率也随之升高[16]。2009-2011年对采自广东省猪场484份血清样品，利用建立的双抗原夹心ELISA方法检测发现猪HEV阳性率为79.1%[92]。本研究结合当前吉林省养猪情况，对我省部分地区开展HEV血清学调查。共采集946份血清样品，利用瑞士进口试剂盒对其进行抗体检测，总体阳性率为34.99%，地区间阳性率为14.17%-61.59%且不同地区间差异极显著（P<0.0001），因为样本采集时发现在长春、吉林、德惠和四平等地区养殖规模较大，集约化程度较高，但是在德惠和吉林中散养户较多而且农户之间密集度较高，有的地区甚至整个村庄每家都以养猪为生，而且饲养环境较差，同时这些地区都缺少化粪池，圈舍附近粪便常年堆积，严重影响了饲养环境。其中怀孕母猪的阳性率为50.72%，高于其他年龄段猪群，与文献报道一致[16]。不同季节HEV感染差异极显著（P=0.0002），其中夏季阳性率较高为43.26%，秋季最低为26.96%。风险因素分析发现地区是主要的风险因素，以白城地区为参考，德惠地区最高是其9.71倍（OR=9.71，95%CI=5.346-17.64），辽源地区最低是其2.329倍（OR=2.329，95%CI=1.237-4.386）。年龄分析以种公猪为参考，其中怀孕母猪较高为2.859倍(OR=2.859，95%CI=1.736-4.711)。以秋季为参考分析显示夏季是秋季的2.066倍(OR=2.066，95%CI=1.301-3.280)。综合分析发现，HEV在吉林省地区呈散发流行状态，地区差异明显，德惠地区阳性率略高，其饲养密度及饲养环境相对较差。因此德惠是HEV感染高危地区，猪群免疫刻不容缓，兽医及饲养人员也要做好防护措施，且对该地区的猪肉应严格检疫，不食用未熟猪肉，避免HEV在我省大规模流行，危害人畜健康。HEV在吉林省地区虽然未有大规模流行，但其呈现较高的阳性率，为了防患于未然应提高饲养环境，勤消毒和及时清理粪便，将感染风险降到最低。1.5小结1.5.1本研究通过对吉林部分地区HEV血清学调查发现，HEV总体阳性率为34.99%，德惠地区HEV阳性率最高为61.59%，白城地区最低为14.17%。1.5.2数据统计分析发现除性别外，地区、年龄和季节差异极显著，而地区是HEV感染的最大风险因素。14 第二章副猪嗜血杆菌的血清学调查副猪嗜血杆菌可引起病猪以发热、呼吸困难、关节炎、多发性浆膜炎等临床症状的一种接触性传染病。主要感染仔猪和青年猪，一年四季均可感染，但尤以春、秋、冬较为严重，发病率为15%左右。一旦发病常可与多种细菌和病毒病混合感染，引起多种并发症直至死亡，给养猪场造成巨大经济损失。本文从吉林省部分地区采集血清，利用商品化ELISA抗体检测试剂盒进行检测，统计分析吉林地区的副猪嗜血杆菌的流行态势，为吉林省副猪嗜血杆菌的防控提供基础数据。2.1实验材料2.1.1血清样品同研究内容第一章中1.1.1所采集的样品。2.1.2主要仪器同研究内容第一章中1.1.2所使用的仪器。2.1.3试剂盒副猪嗜血杆菌（HPS-OppA）抗体检测试剂盒（BiocheckHaemophilusparasuisAntibodytestkit，Netherlands）。2.2实验方法2.2.1血清的采集与处理同研究内容第一章中1.2.1已处理好的血清样品。2.2.2样品检测参照BiocheckHaemophilusparasuisAntibodytestkit说明书。2.2.3数据统计分析应用数据统计分析软件SPSS19.0对检测数据统计分析。2.3结果分析2.3.1HPS血清学检测结果通过对吉林省养猪业密集的地区，采集猪血清样品并以不同地区、年龄、性别和季节进行统计分析。本研究使用商品化HPS抗体ELISA检测试剂盒对采集的946份样品进行抗体检测，结果表明吉林省HPS总体阳性率为21.04%，不同地区的阳性率在8.73%-30.66%之间。其中地区和年龄差异极显著（P<0.0001）,性别与季节差异不显著，如表1-4所示。15 表1-4吉林不同地区、不同性别、不同年龄和不同季节猪HPS感染情况Table1-4.SeroprevalenceofHPSinfectioninpigsinJilinprovinceaccordingtogeographicallocation,sex,ageandsamplingseason因素类别样品数阳性数阳性率P-value地区长春1323627.27%吉林市1192722.69%德惠1514328.48%辽源126118.73%<0.0001通化781417.95%四平1374230.66%白城1271713.39%延边76911.84%性别公3748522.73%0.302母57211419.93%年龄<1月龄35111532.76%1-6月龄2175324.42%<0.0001怀孕母猪276238.33%种公猪10287.84%季节春2716523.99%夏3566417.98%0.3097秋1152521.74%冬2044522.06%总计94619921.04%2.3.2风险因素分析本试验对946份猪血清样品进行HPS检测，并对数据统计分析。结果显示地区和年龄是HPS的主要风险因素，其中以辽源地区为参考，四平地区最高是辽源地区的4.622倍(OR=4.622,95%CI=2.256-9.470)，以种公猪为参考，1月龄小猪最高是其5.726倍(OR=5.726,95%CI=5.7262.690-12.190)，见表1-5。16 表1-5HPS血清学阳性率不同分组中风险因素分析Table1-5.AnalysisofriskfactorsofHPSseroprevalenceindifferentsubgroups变量样品数阳性数阳性率P-valueOR(95%CI)地区长春1323627.27%3.92(1.894-8.116)吉林市1192722.69%3.068（1.445-6.513）德惠1514328.48%4.162(2.041-8.487)辽源126118.73%Reference<0.0001通化781417.95%2.287(0.981-5.334)四平1374230.66%4.622(2.256-9.470)白城1271713.39%1.616(0.724-3.604)延边76911.84%1.404(0.554-3.563)年龄<1月龄35111532.76%5.726(2.690-12.190)1-6月龄2175324.42%3.797(1.731-8.329)<0.0001怀孕母猪276238.33%1.068(0.462-2.471)种公猪10287.84%Reference总数94619921.04%-2.4讨论当前副猪嗜血杆菌仍是养猪业重要的呼吸系统疾病，广泛流行于世界养猪国家。HPS可引起病猪出现严重的呼吸道和关节炎等症状，侵害病猪固有免疫系统，导致出现与多种病毒或细菌病混合感染，最终使病猪死亡的一种严重细菌病[93]。HPS自从发现至今流行将近百年的历史，一直困扰着我国养猪业的发展。该病常呈隐性感染状态，病猪临床症状不明显，随着长期隐性带菌致使免疫力不断下降，因此HPS常与圆环、蓝耳和链球菌等混合感染。近些年我国各省市HPS报道逐渐增多，马琳等从2006-2010的四年间对从广西采集的305份病料进行检测分析，发现HPS在广西的阳性率为4.59%[94]。2010年周玉龙对43份来自黑龙江病料进行检测，结果显示阳性率为18.60%并且发现病猪与多种病毒混合感染情况[95]。据报道有研究对广东地区的372份病料进行检测，共计检测到15个阳性猪场，平均阳性率为40.54%[96]。本研究从吉林省8个地区的养猪场共采集946份地区、性别、年龄和季节信息标注明确的猪血清样品，并应用检测可靠的商品化ELISA抗体检测试剂盒进行检测。结果显示有199份HPS阳性样品，吉林地区HPS总体阳性率为21.04%，各地区之间阳性率在8.73%-30.66%，其中四平地区最高达到30.66%，地区间阳性率差异极显著（P<0.0001）。地区统计分析发现HPS虽未在吉林地区出现大面积爆发，但是其阳性率普遍较高，严重威胁着猪群的健康生长。吉林地区多数猪场还是从传统养殖模式走向规模化的初步阶段，很少有针对该病进行免疫预防。其中1月龄以下仔猪阳性率较高为32.76%，而育肥猪也是该病主要的感染对象，各年龄之间阳性率差异极显著（P<0.0001）。对差异极显著分组17 进行风险因素分析发现1月龄以下仔猪是猪群感染的主要风险因素，不同的地区也是HPS传播感染的主要风险因素。吉林地区HPS血清学调查发现，抗体阳性率不高，但是该病存在部分混合感染病例，其中胸膜肺炎放线杆菌和链球菌是主要细菌病原，其他病毒未做检测分析。一旦发病应及时根据药敏试验结果用药并对症治疗，对该病的治疗和防控应多考虑混合感染等情况，抗菌药物选择常用药，避免形成耐药菌株。吉林地区应对HPS感染应尽早制定免疫计划，选择血清型一致疫苗积极治疗并排除其他病原的混合感染，可有效治疗HPS感染及造成的并发症。2.5小结HPS吉林地区血清学检测表明，HPS总体阳性率为21.04%，各地区之间阳性率在8.73%-30.66%之间差异极显著（P<0.0001），显示HPS在吉林地区广泛存在。2.5.2数据统计分析发现地区和年龄差异极显著，因此考虑地区和年龄是HPS感染的最大风险因素。18 第三章胸膜肺炎放线杆菌血清学检测猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种以急性出血性纤维素性肺炎和慢性坏死性纤维素性肺炎为特征的高度致死性呼吸道传染病。胸膜肺炎放线杆菌致病力强，血清型众多且传播速度快，一直是养猪场潜在的病原菌。本文利用商品化ELISA检测试剂盒对吉林省地区开展APP流行病学调查，探究吉林省APP流行状况，为积极免疫防控提供基础资料。3.1实验材料3.1.1血清样品同研究内容第一章中1.1.1所采集的样品。3.1.2主要仪器同研究内容第一章中1.1.2所使用的仪器。3.1.3试剂盒猪胸膜肺炎放线菌ApxIVA抗体检测试剂盒（酶联免疫法）购于北京百奥莱博科技有限公司。3.2实验方法3.2.1血清的采集与处理同研究内容第一章中1.2.1已处理好的血清样品。3.2.2样品检测操作步骤参照猪胸膜肺炎放线菌ApxIVA抗体检测试剂盒说明书。3.2.3数据统计分析应用数据统计分析软件SPSS19.0对检测数据统计分析。3.3结果分析3.3.1APP血清学检测结果本研究针对吉林省养猪密集地区开展猪胸膜肺炎放线杆菌流行病学调查，共计采集946份信息准确的猪血清样品，应用ELISA检测试剂盒进行检测。检测结果表明吉林地区HPS总体阳性率为26.32%，各地区猪场都存在不同情况的APP感染，四平地区阳性率最高为37.96%，地区之间阳性率差异极显著（P=0.0033）。数据分析结果显示不同性别、年龄和季节APP阳性率差异不显著，如表1-6所示。19 表1-6吉林不同地区、不同性别、不同年龄和不同季节猪APP感染情况Table1-6.SeroprevalenceofAPPinfectioninpigsinJilinprovinceaccordingtogeographicallocation,sex,ageandsamplingseason因素类别样品数阳性数阳性率P-value地区长春1323728.03%吉林市1192521.01%德惠1514932.45%辽源1262116.67%0.0033通化781721.79%四平1375237.96%白城1273124.41%延边762026.32%性别公3749625.67%0.5853母57215627.27%年龄<1月龄35110830.77%1-6月龄2175826.73%0.0887怀孕母猪2766021.74%种公猪1022625.49%季节春2717527.68%夏3567821.91%0.0306秋1153126.96%冬2046833.33%总计94625226.32%3.3.2风险因素分析通过对946份猪血清检测，对其检测结果进行数据分析，评价APP感染风险因素。分析发现地区和季节构成显著关系，与辽源地区做比较发现其他各地区更易感染APP，其中四平地区是辽源地区的3.059倍（OR=3.059，95%CI=1.709-5.473)。以季节作为风险因素分析，与夏季做比较，冬季是夏季的1.782倍(OR=1.782，95%CI=1.213-2.618)，具体见表1-7。20 表1-7APP血清学阳性率不同分组中风险因素分析Table1-7.AnalysisofriskfactorsofAPPseroprevalenceindifferentsubgroups变量样品数阳性数阳性率P-valueOR(95%CI)地区长春1323728.03%1.947(1.065-3.56)吉林市1192521.01%1.33(0.699-2.531）德惠1514932.45%2.402(1.346-4.28)辽源1262116.67%Reference0.0033通化781721.79%1.393(0.683-2.843)四平1375237.96%3.059(1.709-5.473)白城1273124.41%1.615(0.869-2.999)延边762026.32%1.786(0.893-3.571)季节春2717527.68%1.364(0.946-1.966)夏3567821.91%Reference0.0306秋1153126.96%1.315(0.812-2.131)冬2046833.33%1.782(1.213-2.618)总数-3.4讨论猪传染性胸膜肺炎是一种严重的呼吸道传染病，该病可引起较高的发病率及死亡率[97]。胸膜肺炎放线杆菌（APP）是其致病源，革兰氏阴性杆菌，共有15个血清型。APP是一种主要寄生在猪呼吸道并有严格的宿主特异性细菌，APP感染病猪可使其在短时间内死亡，康复猪也成为带菌猪，严重影响猪的生长。本病各年龄段猪均易感，主要通过接触性传播并不能垂直传播。因此，带菌猪的转群及混合饲养对健康猪具有很大的危险性，而对该病流行态势调查是预防该病的重要手段之一。1957年APP在英国首次被发现，随后遍及世界各养猪国家。我国于1987年第一次发现该病，而今该病在我国养猪省市广泛流行，我国不同地区的血清型差异较大[71]。华中农业大学动物诊断中心在2010-2012年之间对我国广东、山西、湖南和浙江等共计21个省市24668份病料进行检测，发现胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和致病大肠杆菌成为当今我国猪场的主要细菌致病源[98]。逯忠新对陕西、宁夏和甘肃等7个地区1470份猪血清应用IHA试验进行检测，结果显示总体平均阳性率在20%，地区之间阳性率0-60%不等，且主要血清型为1、3和7型[99]。为了研究河南省PCP的流行病学规律，石冬梅等对未免疫过PCP疫苗1169头的送检猪进行随机采血并检测，结果发现APP平均阳性率为21.55%，同时也发现PCP阳性猪同时与猪瘟、伪狂犬和圆环等病毒性、细菌性疾病混合感染状况[100]。21 本研究应用可检测所有血清型的PCPApxⅣELISA检测方法，针对吉林地区PCP进行检测。结果显示吉林地区PCP252份阳性样品，总体阳性率26.32%，其中德惠阳性率最高为32.45%，各地区之间阳性率差异极显著（P=0.0033）。然而，性别、年龄和季节对APP的感染影响并不十分显著，差异不显著（P>0.05）。PCP在我省猪群阳性率较高，由于当前我省各地区的养殖规模、饲养环境和养殖理念差异较大，造成饲养水平参差补齐，给病原菌的感染可乘之机。试验表明PCP也与副猪嗜血杆菌和圆环等病毒病常混合感染，使病猪死亡率大大增高。吉林省PCP抗体阳性率相对较低，未给本省养殖场造成重大经济损失，但是可通过引种选择、饲料质控和循环消毒等方案减少该病的流行。针对发病猪应及时选用合理有效的抗生素，对症治疗并加强管理水平，可有效治疗并缓解病情。希望通过本次对吉林地区的PCP的流行病学调查，引起人们对APP感染的重视，提高饲养水平减少对养猪场不必要的经济损失。3.5小结3.5.1吉林地区PCP血清学检测表明，APP阳性样品252份，总体阳性率为26.32%，各地区之间阳性率在16.67%-32.45%之间差异极显著（P<0.01），显示PCP在吉林地区广泛存在。3.5.2数据统计分析发现地区和季节差异极显著，因此考虑地区和季节是PCP感染的最大风险因素。22 第四章衣原体血清学检测衣原体是一种微小的细胞内专性寄生的革兰氏阴性菌，可引起多种疾病的人畜共患传染病。猪衣原体只感染猪，可感染任何年龄猪，常造成猪群出现一系列症状，猪群一旦感染就难以净化，尽管治愈也是带菌猪，给养猪业带来不可估量的损失。衣原体在吉林省报道相对较少，一直被养猪场忽略的疾病。本文利用IHA检测方法对吉林省部分地区开展猪衣原体的流行病学调查，了解衣原体在吉林省的流行情况，丰富衣原体流行病学数据。4.1实验材料4.1.1血清样品同研究内容第一章中1.1.1所采集的样品。4.1.2主要仪器同研究内容第一章中1.1.2所使用的仪器。4.1.3试剂盒衣原体病间接血凝（IHA）抗体检测试剂盒（中国农业科学院兰州兽医研究所）。4.2实验方法4.2.1血清的采集与处理同研究内容第一章中1.2.1已处理好的血清样品。4.2.2样品检测参照衣原体病间接血凝（IHA）抗体检测试剂盒说明书操作。4.2.3数据统计分析应用数据统计分析软件SPSS19.0对检测数据统计分析。4.3结果分析4.3.1衣原体血清检测结果本试验从吉林8个地区采集946份猪血清样品，应用IHA试验对处理好的样品进行检测，结果显示247份为阳性，总体阳性率为26.11%。各地区阳性率在10.26%-46.97%之间，差异极显著（P<0.01），性别、年龄和季节各阳性率之间差异不显著（P>0.05），具体数据见表1-8。23 表1-8吉林不同地区、不同性别、不同年龄和不同季节猪衣原体感染情况Table1-8.SeroprevalenceofChlamydiainfectioninpigsinJilinprovinceaccordingtogeographicallocation,sex,ageandsamplingseason因素类别样品数阳性数阳性率P-value地区长春1326246.97%吉林市1193831.93%德惠1514932.45%辽源1262822.22%<0.0001通化78810.26%四平1373525.55%白城1271612.60%延边761114.47%性别公3749224.60%0.3922母57215527.10%年龄<1月龄3518423.93%1-6月龄2175123.50%0.2511怀孕母猪2768129.35%种公猪1023130.39%季节春2717929.15%夏3568523.88%0.409秋1153328.70%冬2045024.51%总计94624726.11%4.3.2风险因素分析对IHA试验检测结果进行统计学分析显示，地区差异极显著并进行风险因素分析。风险因素分析发现其它7个地区相比通化地区衣原体感染明显偏高，其中长春地区最高是通化地区的7.75倍（OR=7.75，95%CI=3.457-17.38)，最低的白城地区也是其1.261倍（OR=1.261，95%CI=0.513-3.10)，见表1-9。24 表1-9衣原体血清学阳性率不同分组中风险因素分析Table1-9.AnalysisofriskfactorsofChlamydiaseroprevalenceindifferentsubgroups变量样品数阳性数阳性率P-valueOR(95%CI)地区长春1326246.97%7.75(3.457-17.38)吉林市1193831.93%4.105(1.796-9.384)德惠1514932.45%4.203(1.876-9.42)辽源1262822.22%2.5(1.076-5.811)<0.0001通化78810.26%Reference四平1373525.55%3.102(1.314-6.859)白城1271612.60%1.261(0.513-3.10)延边761114.47%1.481(0.561-3.911)总计-4.4讨论猪衣原体是一种主要由鹦鹉热衣原体引起的多种症候群的人畜共患传染病。1955年衣原体造成猪感染的现象首次在美国被报道，随后在俄国和东欧发现有流产和支气管肺炎的病猪怀疑为衣原体感染。20世纪90年代发现衣原体可引起关节炎、肺炎、结膜炎、心包炎、流产、木乃伊胎和睾丸炎等一系列症状，给养猪业带来巨大的经济损失[101]。但是衣原体感染同时临床诊断和实验室诊断忽略的检测病原，因此造成了猪衣原体在我国养猪场大范围流行的现状。近年来，我国多个省市也开展了多次衣原体的血清学调查报道。毕骏龙等对云南省部分地区的猪衣原体感染情况开展流行病学调查，从8个地区的37个规模猪场和126家散养户采集1257份猪血清检测，结果显示有232份阳性样品，总体阳性率为18.5%且各个地区均存在不同程度衣原体的感染[102]。蒋法成对江苏省淮安市淮安区的15个乡镇采集900份猪血清，利用ELISA法检测发现该地区衣原体平均阳性率为5.44%[103]。郎利敏等对来自河南、安徽和山西等省送检的938份病猪血清进行检测，阳性率为54.1%[104]。以上研究都证明了衣原体存在大多数猪场，而且因其症状与多数病例感染相似常容易造成误诊。本研究对吉林地区养猪场采集的946份血清进行检测分析，结果表明吉林地区衣原体总体阳性率为26.11%，8个地区之间阳性率在10.26%-46.97%之间，长春地区阳性率高达46.97%，地区之间差异性极显著（P<0.0001）。预示我省也是衣原体感染的主要地区，相比其他地区我省衣原体低于江西省等地区，但也较其他省份普遍偏高[87]。在样品采集过程中发现我省养猪场对衣原体的防护基本是空白，衣原体较高的阳性率很可能也是因较差的饲养环境。风险因素分析发现只有地区是衣原体的风险因素，性别、年龄和季节不考虑25 为风险因素。猪肉是我国主要的食用肉，然而猪衣原体也是人感染重要的传播途径。因此，对衣原体的检测、诊断和防控极具公共卫生学意义。我省衣原体流行病学调查结果显示猪衣原体感染在我省广泛存在，且对其引起的感染未能进行有效检测而常被忽略。猪群一旦检测发现衣原体感染，立即选择合理的抗生素治疗，病情严重者应积极捕杀，隔离病猪，熏蒸消毒净化养殖场所，并对健康猪群制定免疫接种计划。当前吉林省衣原体感染潜在的风险较高，开展衣原体的检测和疫苗免疫刻不容缓，使衣原体流行风险降至最低。4.5小结4.5.1吉林地区衣原体血清学调查表明，衣原体247份阳性样品，总体阳性率为26.11%，各地区之间阳性率在10.26%-46.97%之间差异极显著（P<0.0001），显示衣原体在吉林地区广泛存在。4.5.2数据统计分析发现地区差异极显著，因此考虑地区是衣原体感染的最大风险因素。26 结论1、吉林地区HEV血清学调查表明，阳性样品331份，总体阳性率为34.99%（331/946），风险因素分析表明地区、年龄和季节是HEV感染的主要风险因素。2、HPS吉林地区流行病学检测结果显示，总体阳性率21.04%（199/946），地区和年龄是HPS感染的风险因素。3、PCP检测抗体阳性率为26.32%（252/946），不同地区和季节阳性率差异极显著（P<0.0001），地区和季节考虑为PCP的风险因素。4、衣原体检测阳性率为26.11%（247/946），不同地区极显著（P<0.0001）考虑为风险因素，性别、年龄和季节阳性率之间差异不显著（P>0.05）。5、各病原血清学阳性率在不同地区的差异均较显著，应对阳性率高的地区加强疾病的防控。27 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作者简介姓名郑洲阳性别男民族汉籍贯内蒙赤峰政治面貌团员入学时间2016年申请学位类专业型硕论文答辩日2018年5月29日授予学位年月别士期就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2016年-2018年吉林农业大学专业：兽医学硕士研究生攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息发表学术论文署署名单发表情况题目刊物名称（级别）名位(刊出时间/录用)署名称成果级别署名单位发表情况获名奖项目及专利34 致谢六月，总是阳光灿烂。六月，总要曲终人散。六月，我们拒绝伤感。花儿谢了芬芳，迎来硕果飘香。毕业带来别离，我们走向辉煌。在论文完稿之际，谨对在本论文的撰写过程中，给予我帮忙的导师和亲爱的同学，表示深深的感谢!感谢我的导师赵权老师。无论是为人还是治学，他都是我学习的榜样，值得信赖的良师益友。在承担繁重的教学和工作任务的状况下，他主动关心我的学习和科研。从论文的选题、开题报告的撰写、资料的查找，到结构的完善，都给予悉心指导，使我顺利成文。郑洲阳2018年3月26日35
