脑源性神经营养因子对糖尿病视网膜Müller细胞的影响

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１０１８７单位代码：６０分类号Ｒ５．１２０１５２００６２学号：？碎叫蜃科太ｆ硕士学位论文题目：脑源性神经营养因子对糖尿病视网膜Ｍｉüｌｌｅｒ细胞的影响－ｈＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｂｒａｉｎｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒｏｎｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎａｌＭüｌｌｅｒｃｅｌｌ研究生：梁汇珉导师：刘学政学科专业：人体解剖学与组织胚胎学２０—２０１６年８月１７论文课题起止时间：年１２月论文完成时间：２０１８年３月 锦州医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包一含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处一，本人承担切相关责任。论文作者签名：漱匚截日期：嫌〇锦州医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解锦州医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属锦州医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为锦州医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为锦州医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅（。学校可以公布学位论文的全部或部分内容保密）、内容除外，以采用影印缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：敎件指导教师签名＾ 目录一、摘要............................................................................................................1中文论著摘要..............................................................................................1英文论著摘要..............................................................................................3二、英文缩略语表..............................................................................................6三、论文............................................................................................................7前言............................................................................................................7实验材料和方法...........................................................................................8实验结果...................................................................................................14讨论..........................................................................................................21结论..........................................................................................................24四、本研究创新性的自我评价..........................................................................25五、参考文献...................................................................................................26六、附录..........................................................................................................30综述..........................................................................................................30在学期间科研成绩………………………………………………………………43致谢………………………………………………………………………………44个人简介…………………………………………………………………………45 ·中文论著摘要·脑源性神经营养因子对糖尿病视网膜Müller细胞的影响目的探讨脑源性神经营养因子（Brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）对糖尿病视网膜病变Müller细胞作用的影响。方法健康雄性SD大鼠，腹腔一次性注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）55mg/kg建立糖尿病模型。利用含0.1g/LBSA的磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersaline，PBS）制备BDNF注射液。实验随机分为三组：对照组、糖尿病组、BDNF组。BDNF组于糖尿病模型建成4周后开始进行BDNF玻璃体腔内注射，对照组和糖尿病组玻璃体腔内分别注射等剂量的PBS平衡盐溶液。糖尿病模型建模成功8周后，采用可见分光光度计法以及使用谷氨酸含量测定试剂盒和脂质氧化（MDA）检测试剂盒检测视网膜中谷氨酸的浓度变化和视网膜中MDA的含量；免疫荧光检测视网膜中胶质细胞谷氨酸转运体（L-glutamate/L-aspartatetransporter，GLAST）、谷氨酰胺合成酶（Glutaminesynthetase，GS）及突触囊泡膜蛋白-突触素（Synaptophysin，SYN）的表达量；Westernblot检测视网GLAST、GS、SYN以及caspase-3蛋白表达量。结果视网膜谷氨酸测定结果显示，与对照组相比，糖尿病组大鼠视网膜中谷氨酸浓度明显升高（P<0.01），而BDNF组与对照组相比无明显变化（P>0.05）；与糖尿病组相比，BDNF组视网膜中谷氨酸浓度显著减少（P<0.01）。各组大鼠视网膜中MDA含量检测结果显示，与对照组相比，糖尿病组视网膜内MDA含量显1 著增加（P<0.01），BDNF组与对照组相比无显著差异（P>0.05）；与糖尿病组相比，BDNF组视网膜MDA含量明显减少（P<0.01）。免疫荧光检测结果显示，与对照组相比，糖尿病组视网膜Müller细胞中GLAST、GS及视网膜SYN蛋白表达显著下降（P<0.01），BDNF组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；与糖尿病相比，BDNF组大鼠视网膜中GLAST、GS及SYN蛋白表达明显升高（P<0.01）。Westernblot检测结合蛋白灰度值分析结果显示，与对照组相比，糖尿病组视网膜GLAST、GS以及SYN蛋白表达显著降低，而caspase-3表达显著增加（P<0.01）；BDNF组与对照组相比无明显差异（P>0.05）。与糖尿病组相比，BDNF组视网膜中GLAST、GS及SYN蛋白表达明显升高，caspase-3蛋白表达显著减少（P<0.01）。结论DR早期给予外源性BDNF能减少视网膜MDA含量和视网膜caspase-3表达进而发挥抗氧化作用，提高视网膜Müller细胞中GLAST、GS的蛋白表达，降低视网膜内的谷氨酸浓度，间接提高视网膜突触素SYN的表达，保护RGC。但BDNF改善SYN表达的具体作用机制还不明确，仍待我们进一步研究和探讨。关键词脑源性神经营养因子；糖尿病视网膜病变；Müller细胞；氧化应激；L-谷氨酸/L-天冬氨酸转运体2 ·英文论著摘要·Theeffectofbrain-derivedneurotrophicfactorondiabeticretinalMüllercellObjectiveToinvestigatetheeffectofBrainderivedneurotrophicfactor(BDNF)onretinalMüllercellindiabeticretinopathy.MethodsHealthymaleSDrats,diabeticmodelwasestablishedbyintraperitonealone-timeinjectionofstreptozotocin(55mg/kg),preparationofBDNFinjectionwithPBSbalancedsaltsolutioncontaining0.1%BSA.Theexperimentwasrandomlydividedintocontrolgroup,diabeticgroup,BDNFgroup.Fourweeksafterthediabetesmodelwasestablished,thenBDNFgroupwasinjectedBDNFinjection.ThecontrolgroupanddiabeticgroupwereinjectedwithequaldoseofPBSbalancedsaltsolution.Aftereightweeksandthesuccessofthediabetesmodel,thedeterminationofglutamateconcentrationintheretinaandthecontentofMDAintheretinaweredetectedbyvisiblespectrophotometryandtheuseofglutamatecontentdeterminationkitandlipidoxidation(MDA)detectionkit.Theexpressionofglialglutamatetransporter(L-glutamate/L-aspartatetransporter,GLAST),glutaminesynthetase(Glutaminesynthetase,GS)andsynapticvesicularmembraneprotein(synaptophysin，SYN)weredetectedbyImmunofluorescence.TheexpressionofGLAST、GSandcaspase-3proteinweredetectedbyimmunoblotting.ResultsResultsofretinalglutamatedeterminationshowthatcomparedwiththe3 controlgroup,glutamateconcentrationofratretinaincreasedsignificantlyindiabeticgroup(P<0.01),therewasnosignificantchangebetweenBDNFgroupandcontrolgroup(P>0.05).Comparedwiththediabeticgroup,glutamateconcentrationintheretinawasdecreasedsignificantlyinBDNFgroup(P<0.01).Meanwhile,comparedwiththecontrolgroup,thecontentofMDAincreasedsignificantlyindiabeticgroup(P<0.01),therewasnoobviousdifferencebetweenBDNFgroupandcontrolgroup(P>0.05);Comparedwiththediabeticgroup,thecontentofMDAofretinawassignificantlydecreasedinBDNFgroup(P<0.01).Theresultsofimmunofluorescencedetectionshowthatcomparedwiththecontrolgroup,theexpressionofGLAST,GSandSYNproteindecreasedsignificantlyinthediabeticgroup(P<0.01),comparedwiththecontrolgroup,therewasnostatisticallysignificantbetweenBDNFgroupandcontrolgroup(P>0.05);Comparedwiththediabeticgroup,theexpressionofGLAST,GSandSYNproteiningroupBDNFwassignificantlyelevated(P<0.01).TheresultsofWesternblotdetectioncombinedwithproteingrayvalueanalysisareshowthatcomparedwiththecontrolgroup,theexpressionofGLAST,GSandSYNproteindecreasedsignificantlyindiabeticgroup,whiletheexpressionofcaspase-3increasedsignificantly(P<0.01).,therewasnoobviousdifferencebetweenBDNFgroupandcontrolgroup(P>0.05);Comparedwiththediabeticgroup,theexpressionofGLAST,GSandSYNproteininBDNFgroupwassignificantlyincreased,theexpressionofcaspase-3decreasedsignificantly(P<0.01).ConclusionIntheearlystageofdiabetes,BDNFcanreducethecontentofMDAandcaspase-3inretina,playanantioxidantroleandimprovetheexpressionofGLASTandGSinretinalMüllercell,anddecreasetheglutamateconcentrationinreuna,meanwhileItcanalsoimprovetheexpressionofSYNandprotectretinalganglioncells.However,itisnotclearhowBDNFcan4 improveSYNexpression,Westillneedfurtherstudyanddiscussion.KeywordsBrainderivedneurotrophicfactor；Diabeticretinopathy；Müllercell；L-glutamate/L-aspartatetransporter；Retinalganglioncells5 ·英文缩略语表·英文缩写英文全称中文译名DRdiabeticretinopathy糖尿病视网膜病变BDNFbrainderivedneurotrophicfactor脑源性神经营养因子RGCRetinalganglioncells视网膜神经节细胞GLASTL-glutamate/L-aspartatetransporter谷氨酸转运体GSglutaminesynthetase谷氨酰胺合成酶SYNsynaptophysin突触素PBSPhosphatebuffersolution磷酸盐缓冲溶液BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白STZstreptozotocin链脲佐菌素TBSTTris-bufferedsaline-Tween杂交膜清洗液PVDFPolyvinylidenedifluoride聚偏氟乙烯ROSReactiveoxygenspecies活性氧自由基TrkBTyrosinekinasereceptorB酪氨酸蛋白激酶受体BGCLganglioncelllayer神经节细胞层INLinnernuclearlayer内核层IPLInnerplexiformlayer内丛状层OPLOuterplexiformlayer外丛状层ONLOuternuclearlayer外核层OSOxidativestress氧化应激6 ·论文·脑源性神经营养因子对糖尿病视网膜Müller细胞的影响前言糖尿病视网膜病变（Diabeticretinopathy，DR）是糖尿病最常见且较为严重的眼部并发症，是导致成年人致盲的主要原因之一。据统计糖尿病患病人数将从2011年3.66亿人增加到2030年的5.52亿人，随着糖尿病患病率的不断上升，患有DR的人数也逐渐增加，超过三分之一的糖尿病患者有DR的发病迹象[1]。DR严重影响患者的视力和生活质量，但目前DR的发病机制还不十分清楚。据报道，DR早期在出现视网膜微血管异常之前就已经存在视网膜神经退行性变，出现神经营养因子的缺失、Müller细胞谷氨酸代谢平衡破坏、视网膜神经细胞死亡等[2]。糖尿病引起的氧化应激（Oxidativestress，OS）是引发视网膜损伤级联反应的中心因素，被认为是影响视网膜神经变性的主要机制之一，氧化应激时产生的各种代谢产物如自由基等能导致视网膜神经细胞和血管组织损害，进一步加重视网膜神经退行性病变，患者视力不可逆性损害，严重者可失明[3-4]。Müller细胞是视网膜中数量最多的神经胶质细胞，维持视网膜正常生理代谢所需的谷氨酸代谢平衡以及局部物质代谢、维持神经元的正常结构和功能以及提供神经元营养物质及维持血-视网膜屏障完整性等起重要作用[5]。在某些氧化应激条件下（如缺血再灌注损伤，眼部炎症和DR等），Müller细胞中内向整流钾通道Kir4.1受损，细胞膜发生异常去极化，导致GLAST的功能障碍[6]，使GLAST转运谷氨酸的活性下降，视网膜细胞内外谷氨酸平衡破坏，Müller细胞清除视网膜谷氨酸能力下降，过多的谷氨酸会产生细胞毒性，损伤RGC，最终患者视力受损。另有报道显示，高糖诱导的氧化应激也能抑制视网膜GS和突触囊泡蛋白的表达[7]，也进一步加重视网膜谷氨酸堆积和RGC损害。7 BDNF是一种蛋白质，是神经生长因子家族的成员之一，目前对其研究较多的是其参与调节神经元的功能和存活以及神经轴突的再生，在中枢神经系统突触功能的调节、细胞增殖和分化以及神经元保护等作用中起关键作用[8-9]。BDNF与靶细胞上的高亲和力TrkB受体结合后，激活下游信号通路，促进细胞存活作用[10]。另外BDNF能够增强原代大鼠大脑皮层神经细胞中sestrin2表达来对抗3-NP（3-硝基丙酸）引起的氧化应激损害，发挥抗氧化作用[11]。另外LiuYu等人研究表明，在缺血和缺氧条件下BDNF能够抑制氧化应激诱导的视网膜神经细胞死亡，并抑制DR早期阶段大鼠RGC凋亡[12]。但BDNF在氧化应激引起的视网膜病变如DR中，是否具有抗氧化作用及其机制还不清楚。而在本实验中我们通过建立大鼠糖尿病模型，玻璃体腔注射给予外源性BDNF，探讨BDNF对氧化应激时糖尿病视网膜Müller细胞中GLAST以及GS表达的影响，为进一步了解DR的病理变化和发病机制以及为DR的临床治疗策略提供可靠的理论依据。实验材料和方法一、实验材料（一）实验动物健康清洁雄性SD大鼠60只，体质量均为230-250g（锦州医科大学实验中心提供，标准号为清洁级，编号：0000445）。（二）主要药品和试剂试剂名称试剂公司STZ美国Sigma公司BDNF美国Sigma公司GLAST、GS、SYN、caspase-3一抗英国Abcam公司Westernblot和免疫荧光二抗美国ProteintechGroup公司谷氨酸（Glu）含量测定试剂盒北京索莱宝科技有限公司脂质氧化（MDA）检测试剂盒碧云天生物技术有限公司BCA蛋白含量检测试剂盒江苏凯基生物技术股份有限公司8 10×PBS缓冲液武汉博士德生物工程有限公司ECL化学发光显影液美国伯乐BIO-BRD公司Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)博士德生物工程有限公司Tween-20北京索莱宝科技有限公司DAPI染色液英国Abcam公司WesternblotMarker美国ProteintechGroup公司（三）主要仪器设备仪器名称型号产地冰冻切片机HM525NX美国Thermo荧光倒置显微镜CX31日本Olympus公司酶标仪MultiskanFC美国赛默飞公司Westernblot凝胶成像系统AZUREC400美国AzureBiosystems垂直电泳仪Bio-RadA101439美国伯乐BIO-BRD公司微量进样器刻度：0.5ul-5ul上海高鸽工贸有限公司可见分光光度计Evolution201美国赛默飞公司解剖显微镜SZX16日本Olympus公司二、实验方法（一）糖尿病动物模型的制备根据每只SD大鼠体重称取所需要的总STZ粉末用量，然后溶于无菌新鲜配置的浓度为0.1mmol/L，PH4.3-4.5的柠檬酸盐缓冲液中，使用前配置，配置好的溶液置于4℃冰上并且避光保存。雄性SD大鼠适应性饲养3天，然后禁食水12h,一次性腹腔注射浓度为55mg/kg的STZ溶液诱导建立大鼠糖尿病模型。72h后，用注射器刺破鼠尾取适量尾静脉血检测血糖，随后的一周内随机采集3次尾静脉血并记录血糖值，其中血糖浓度的平均值大于16.7mmol/L的大鼠即为建模9 成功，血糖不达标者予以去除。动物每天给予清洁级饲料喂养，室温环境饲养，自由饮食水，保证大鼠足够的饲料和水。通风良好，12h光照昼夜循环。（二）实验动物的分组以及药物（BDNF）玻璃体腔内注射健康雄性SD大鼠60只，实验随机分为对照组、糖尿病组、BDNF组，每组各18只，剔除未成模的6只大鼠，分别为造模未成未功6只，2天之内死亡3只，血糖恢复正常值1只。各组大鼠均给予普通饲料喂养，保证各组充足的饮食水。BDNF冻干粉溶于含0.1g/LBSA的无菌PBS溶液。BDNF组大鼠从糖尿病模型建成后第4周开始，每3天进行一次玻璃体腔内注射，每次剂量为0.5ug/uL，具体操作参照文献[13]。BDNF组大鼠腹腔注射水合氯醛全身麻醉，利多卡因眼球表面麻醉，选取玻璃体注射的大鼠眼球并做好记录，在解剖显微镜下固定好大鼠后，用总体积刻度为5ul的微量进样器抽取3ulBDNF注射液于角膜缘后1mm处一次性缓慢注入大鼠玻璃体腔内，去除玻璃体腔内有出血或出现眼球萎缩的大鼠。对照组和糖尿病组玻璃体腔内注射等剂量的含0.1g/LBSA的无菌PBS平衡盐溶液。糖尿病模型建立成功8周后，根据实验需要取材进行各项指标检测。（三）实验动物灌流及视网膜冰冻切片制备配置接近动物致死量的浓度为0.3ml/100g的10%水合氯醛溶液。8周后每组各取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液全身深度麻醉大鼠，从剑突处打开胸腔充分暴露心脏，从左心室插入灌注针头至升主动脉内，用止血钳固定心脏和升主动脉，动作轻柔不要刺破升主动脉，剪开右心耳，快速灌注PBS缓冲液（室温）150-250ml，待大鼠体内血液冲洗干净后（大鼠肝脏变黄白）后，立即换4%多聚甲醛（4℃冰箱放置备用）大约350-500ml，继续灌注，不要有气泡，先快后慢，时间约1-2h，待多聚甲醛充分进入大鼠视网膜组织停止灌注。灌注结束后快速取双侧眼球，剪除眼球表面连接的肌肉和筋膜，放入浓度分别为10%、20%、30%的蔗糖溶液梯度脱水过夜。取彻底脱水后的眼球进行OCT包埋，置于冰冻切片机中20min后切片，切至眼前大约1/3处，用注射器针头去除晶状体，然后继续用OCT包埋填满眼球晶状体空隙，冷冻后继续切片，将切好的视网膜切片组织贴于明胶包被的载玻片上，切片厚度为15um，制备好的切片用于免疫荧光染色。10 （四）不同组大鼠视网膜谷氨酸浓度测定从造模成功开始至8周后，各组大鼠于10%水合氯醛深度麻醉下快速取双侧眼球，眼球置于冰上，在解剖显微镜下剪开眼角膜，用镊子拨开玻璃体、晶状体等眼球内组织快速取出视网膜组织，按照组织质量（g）：试剂体积（ml）为1：5-10的比例加入视网膜谷氨酸提取液，进行冰上研磨制成匀浆，然后在常温离心机上8000g，离心时间为10min，取匀浆液的上清，快速放冰上静置20min。测定谷氨酸浓度之前，将可见分光光度计先预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调至零刻度。最后在视网膜组织提取液中加入显色剂，90℃水浴下放置20min，流水冷却。用调整好测定条件的可见分光光度计在570nm下测定谷氨酸浓度，严格按照谷氨酸测定试剂盒的说明书操作。（五）检测大鼠视网膜MDA含量1、如上述实验方法（四）准备好视网膜组织，按组织重量占匀浆液10%比例4℃冰上对组织进行裂解或匀浆，紧接着在4℃离心机下，1600g离心10min，取上清用于后续的测定。2、视网膜匀浆液制备完毕后，用BCA蛋白浓度测定法检测蛋白浓度，记录浓度数值，用于紧接着计算单位重量组织内MDA含量。3、按照说明书要求配置TBA储备液和MDA检测工作液，避光保存，现用。4、制作标准曲线。5、样品测定：第一个1.5mlEP管中加入0.1ml的PBS缓冲液作为空白对照组，另一个1.5ml离心管加入0.1ml上述不同浓度标准品用于制作待用的标准曲线，第三个EP管加入0.1ml样品用于测定MDA含量，最后依次在三个EP管中加入0.2mlMDA检测工作液，混匀。检测反应体系如下：空白对照标准品样品PBS0.1ml--标准品-0.1ml-待测样品--0.1ml11 MDA检测工作液0.2ml0.2ml0.2ml6、上述液体混匀后，100℃加热15min；然后流水冷却至室温，1000g室温离心10min，使用酶标仪在532nm下测定吸光度，结合标注曲线计算视网膜MDA的浓度，最后根据单位重量的组织含量计算样品中的MDA含量（单位：umol/mg）。（六）采用免疫荧光染色检测视网膜GLAST、GS及SYN表达1、将已经制备好的视网膜冰冻切片置于PBS中轻轻洗涤3次，每次5min;2、封闭：新鲜配置的10%胎牛血清+0.5%Triton-100，室温孵育2h-3h；3、一抗：甩去多余的封闭液，分别滴加适当比例稀释的一抗（GLAST,1：300兔抗大鼠；GS，1：300小鼠抗大鼠；SYN，1：300小鼠抗大鼠），切片放入湿盒中4℃冰箱孵育过夜；4、PBS轻轻洗涤3次，每次5min；5、二抗：PBS洗涤之后依次分别滴加荧光素标记的二抗（A594标记驴抗兔，1：800；A488标记羊抗小鼠，1：800），并做好标记，室温避光孵育2h；6、PBS轻轻洗涤3次，每次5min；7、核复染：即用型DAPI溶液滴于视网膜切片，室温孵育5min；8、PBS轻轻洗涤3次，每次5min；9、最后滴加少量抗荧光封片剂封片，避免产生气泡，倒置显微镜下观察结果，拍照。（七）Westernblot检测视网膜GLAST、GS、SYN及caspase-3蛋白表达1、实验处理结束后，3组分别各取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉，快速断头处死大鼠取双侧眼球，PBS冲洗眼球；2、在解剖显微镜下用眼科剪轻轻沿着角膜缘剪开，去掉视网膜内的晶状体和玻璃体，最后用无齿镊快速钝性分离视网膜组织；3、已经制备好的视网膜组织中，按照每20mg组织加入150-250ul蛋白裂解液比例加入适当裂解液，置于冰上剪碎后再用超声波裂解仪进一步裂解组织；12 4、裂解后的组织冰上静置30min，4℃离心，12000r/min，25min，取上清；5、用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，制样，-80℃冷冻保存备用；6、安装制胶装置，配置12%分离胶和5%浓缩胶，每孔加入15ul的蛋白样品上样，Marker加入5ul，电压90V稳定电泳30min后，改换120V电压，溴酚蓝刚跑出后关闭电源，停止电泳；7、SDS-聚丙烯凝胶电泳结束后，半干转法将蛋白转入PVDF膜上，30min后，将PVDF膜放入新鲜配置的1%BSA封闭液中封闭2h；8、弃去封闭液，PVDF膜放入稀释好的含一抗的杂交袋中，一抗（GLAST，1：3000兔抗大鼠；GS，1：3000小鼠抗大鼠；SYN，1：4000小鼠抗大鼠；caspase-3，1：5000兔抗大鼠；β-Tubulin，1：3000小鼠抗大鼠；β-actin，1:3000小鼠抗大鼠），放入摇床上4℃孵育16h；9、TBST洗膜液洗涤3次，每次5min；10、PVDF膜放入含二抗的杂交袋中，二抗（生物素标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠，1：3000），室温摇床孵育2h；11.TBST洗膜液洗涤3次，每次5min；12、最后在孵育好抗体的PVDF膜上滴加ECL发光液，凝胶成像使用化学发光法显影，以内参蛋白β-Tubulin和β-actin为标准进行校正，计算视网膜内目的蛋白GLAST、GS、SYN以及caspase-3的蛋白相对表达量。三、统计学分析实验数据均用均数±标准差表示，使用SPSS22.0统计软件分析实验所得的数据，采用单因素方差分析对各分组之间进行比较，如果方差齐可以采用SNK-q检验进行各组间的比较，当方差不齐的时候即采用Games-Howell法，当P<0.01时，表示差异有统计学意义。13 实验结果一、各组大鼠视网膜内谷氨酸浓度和MDA含量测定结果分光光度法检测各组视网膜内谷氨酸浓度如（图1，表1）所示，统计学分析结果显示各组数值之间比较差异有统计学意义（F=272.88，P<0.01）。与对照组相比，糖尿病组视网膜内谷氨酸浓度显著升高（P<0.01），而BDNF组与对照组相比无明显变化（P>0.05）；与糖尿病组相比，BDNF组视网膜谷氨酸浓度明显减少（P<0.01）。脂质氧化检测试剂盒测定视网膜内MDA含量结果显示（表1，图1，），三组之间相比有统计学意义（F=128.75，P<0.01）。与对照组相比，糖尿病组视网膜内MDA含量明显增加（P<0.01），BDNF组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；与糖尿病组相比，BDNF组视网膜MDA含量减少（P<0.01）。表1各组大鼠视网膜中谷氨酸浓度和MDA含量（x±s）组别n谷氨酸浓度（ug/ml）MDA含量（umol/mg）对照组1874.47±1.138.08±0.39糖尿病组18125.43±0.77**14.07±0.84**BDNF组1890.99±1.03##12.13±0.67##注：*与对照组相比，P<0.01；#与糖尿病组相比，P<0.01图1各组大鼠视网膜谷氨酸和MDA检测结果注：*与对照组相比，P<0.01；#与糖尿病组相比，P<0.0114 二、免疫荧光检测各组大鼠视网膜GLAST及GS蛋白表达结果图2中红色荧光为视网膜GLAST染色结果，正常对照组GLAST表达在视网膜内膜层，主要是在内核层和视网膜神经节细胞层，本实验中我们还发现GLAST表达在内丛状层和外核层。而在糖尿病组GLAST在神经节细胞层、内核层、内丛状层及外核层的表达均显著减少，给予BDNF治疗后GLAST表达有所增加。利用Image-ProPlus分析GLAST光密度值结果显示，各组之间比较差异有统计学意义（F=344.52，P<0.01）。与对照组相比，糖尿病组GLAST蛋白表达显著减少(P<0.01)；BNDF组与对照组相比无明显差异，在统计学上无意义(P>0.05)；BDNF组与糖尿病组两者相比，BDNF组中视网膜GLAST蛋白表达明显增加(P<0.01)（见图2，表2，图5）。GS是由视网膜内核层发出的连续性细丝状结构的谷氨酰胺合成酶。图3绿色荧光为GS染色结果。对照组GS主要表达于视网膜神经节细胞层、内核层、内丛状层及外丛状层。与对照组相比，糖尿病组中GS空间分布差异明显且表达显著减少，与糖尿病组相比BDNF组GS在视网膜节细胞层，内核层、内丛层和外丛状层表达增加。IPP软件分析光密度值结果显示，三组之间比较差异有统计学意义（F=336.76，P<0.01）。与对照组相比，糖尿病组GS蛋白表达明显下降（P<0.01），对照组与BDNF组比较则无明显变化（P>0.05）；与糖尿病组相比，BDNF组GS表达显著增加(P<0.01)（见图3，表2，图5）。15 图2大鼠视网膜Müller细胞GLAST表达（红色，×200）注：GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；INL：内核层；ONL：外核层表2各组大鼠视网膜中GLAST、GS及SYN免疫荧光检测结果（x±s）组别nGLASTGSSYN对照组18106.98±2.9889.85±2.2764.63±1.65糖尿病组1862.32±2.36**57.78±2.08**35.19±1.58**BDNF组1885.97±2.70##70.55±1.46##49.95±1.39##注：*与对照组相比，P<0.01；#与糖尿病组相比，P<0.0116 图3大鼠视网膜Müller细胞GS表达（绿色，×200）注：GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；INL：内核层；OPL：外丛状层三、免疫荧光检测各组大鼠视网膜SYN蛋白表达结果图4中绿色荧光染色结果显示SYN主要表达在内丛状层和外丛状层。光密度值结果分析显示，各分组间比较差异有统计学意义（F=454.69，P<0.01），与对照组相比，糖尿病组SYN在内丛状层和外丛状层表达明显减少（P<0.01），BDNF组较对照组无明显变化（P>0.05）；而与糖尿病组相比，BDNF组视网膜突触素SYN在内丛状层和外丛状层表达有所增加（P<0.01）（见图4，表2，图5）。17 图4大鼠视网膜Müller细胞SYN表达（绿色，×200）注：GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；OPL：外丛状层图5各组大鼠免疫荧光对比图注：*与对照组相比，P<0.01；#与糖尿病组相比，P<0.0118 四、Westernblot检测各组大鼠视网膜GLAST、GS、SYN以及caspase-3蛋白表达结果Westernblot检测ECL化学发光曝光显影后显示，分别在Marker蛋白60KDa、43KDa、38KDa以及55KDa水平处检测到目的蛋白GLAST、GS、SYN以及内参蛋白β-Tubulin的表达。ImageJ软件分析目的蛋白与内参蛋白灰度值比值结果显示，各组中GLAST、GS、SYN的蛋白表达量之间比较差异有统计学意义（P<0.01，F值见表3）。与对照组比较，糖尿病组中视网膜GLAST、GS、SYN蛋白相对表达量均显著下降（P<0.01），BDNF组与对照组相比表达无显著变化（P>0.05）；与糖尿病组相比，BDNF组中GLAST、GS、SYN三者的蛋白相对表达显著增加（P<0.01）（见图6，表3）。caspase-3是细胞凋亡标志物之一，图7所示视网膜内的caspase-3目的蛋白在32kDa水平检测到，内参蛋白β-actin在43KDa水平处检测到。通过计算目的蛋白与内参灰度值的比值显示，三组中caspase-3的蛋白相对表达量比较有统计学意义（F=668.47，P<0.01）。与对照组相比，糖尿病组视网膜中caspase-3的表达显著增加，对照组与BDNF组比较则无显著差异（P>0.05）；同时，与糖尿病组相比，BDNF组caspase-3的蛋白相对表达量有所减少（P<0.01）（见表4）。图6GLAST、GS、SYN蛋白相对表达量A：对照组；B：糖尿病组；C：BDNF组注：*与对照组相比，P<0.01；#与糖尿病组相比，P<0.0119 表3Westernblot检测视网膜GLAST、GS及SYN蛋白相对表达量（%）（x±s）组别nGLASTGSSYN对照组1829.37±2.2931.72±1.5854.54±1.18糖尿病组1815.20±0.8716.92±1.09**27.23±0.77**BDNF组1823.21±1.6122.16±1.53##37.31±1.70##F87.86139.04586.87注：*与对照组相比，P<0.01；#与糖尿病组相比，P<0.01图7caspase-3蛋白相对表达量A：对照组；B：糖尿病组；C：BDNF组注：*与对照组相比，P<0.01；#与糖尿病组相比，P<0.01表4各组视网膜caspase-3蛋白相对表达量（x±s）组别ncaspase-3对照组1823.73±1.14糖尿病组1850.30±1.19**BDNF组1842.47±1.20##注：*与对照组相比，P<0.01；#与糖尿病组相比，P<0.0120 讨论糖尿病是一种慢性代谢性疾病，也是世界范围内发展较快的慢性病之一，包括I型糖尿病（胰岛素绝对缺乏型）和II型糖尿病（胰岛素抵抗型），已成为21世纪的流行病之一[14-15]。糖尿病的常见慢性微血管并发症之一DR也随着糖尿病患者人数的增加而逐年升高。据初步统计，在2010年DR患者的数量达1.26亿，，到2030年DR患者的数量将增长到1.91亿[16]，DR会引起患者视力损害甚至失明。DR一直被认为是视网膜微循环疾病，新的证据表明在视网膜微血管异常发生之前就已经存在视网膜神经退行性病变，包括视网膜电图色觉和对比度下降，视网膜细胞凋亡，胶质细胞激活，谷氨酸代谢障碍等[17-18]，大量实验性啮齿类动物和糖尿病患者的研究表明，糖尿病发病后不久神经细胞就会受损，这可能将进一步导致血管损伤[19]。氧化应激被认为是DR发病机制中的一个关键因素，慢性持续高糖刺激使异常代谢物如羟基和超氧自由基等自由基大量产生，视网膜中蓄积过量ROS，使抗氧化物质损耗过多，氧化和抗氧化防御系统失衡，视网膜遭受氧化应激损伤，引起视网膜细胞功能障碍甚至死亡[20-21]。另外，氧化应激可直接或间接诱导炎症介质参与视网膜细胞损伤，进一步导致DR形成[22]。视网膜Müller细胞被认为在与氧化应激相关的视网膜病变如DR中发挥关键作用，因为视网膜中相关的致病刺激物激活了细胞，出现胶质细胞增生和功能受损等改变[23]。据报道在氧化应激条件下，如缺血再灌注损伤、眼部炎症、局部缺血缺氧以及DR，视网膜Müller细胞中GLAST和GS的结构和功能发生改变，据推测，其可能的机制可能涉及到在病理状态下视网膜Müller细胞中内向整流钾通道Kir4.1受损，导致细胞膜发生异常去极化，从而降低了GLAST对谷氨酸的摄取效率[24]，同时DonaldGPuro等人发现GLAST潜在的主要特征是氧化还原敏感元件的存在，通过巯基氧化还原转换来完成这种调节功能[25-26]，后来在原代培养的Müller细胞中发现GLAST上有一个氧化还原位点，也可以解释使这种转运容易受到糖尿病氧化应激引起的功能障碍[26]。另外，谷氨酸的兴奋毒性进而可能通过激活与NMDA受体及caspase途径依赖的相关机制，损害视网膜神经细胞，导致视力不可逆性损害[27]。高糖导致硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXINP）高表达，通过TXNIP启动21 子上的糖反应元件结合蛋白(ChREBP)激活导致过量ROS产生，诱导氧化应激抑制视网膜GS表达，过量的ROS也降低广泛表达于视网膜的神经递质释放突触囊泡蛋白的水平[28]。BDNF与高亲和力受体TrkB结合，激活其下游一系列信号而诱发各种促进细胞存活相关的基因转录[29-30]。研究表明，BDNF也能通过激活CREB（cAMP反应元件结合蛋白）增加抗凋亡因子转录，并且抑制抗氧化酶下调，减少氧化应激诱导的细胞凋亡[31]。BDNF还能够减轻损伤的视网膜Müller细胞的渗透性肿胀、保护视网膜光感受器（视锥细胞和视杆细胞）免受光毒性损伤，并且刺激Müller细胞分泌各种神经营养因子，如神经生长因子和BNDF等[32]，BDNF在各种视网膜Müller细胞损害中的神经保护作用也越来越受到关注。GLAST是视网膜Müller细胞中的主要转运体，主要表达在Müller细胞的胞体和突起上，能清除细胞突触间隙过多的谷氨酸，终止有害的谷氨酸神经信号传递和保护神经元免受谷氨酸的神经毒性损害。正常视网膜中，Müller细胞GLAST表达在视网膜内膜层，主要是在内核层（innernuclearlayer，INL）和视网膜神经节细胞层（ganglioncelllayer，GCL），尤其在外丛状层鞘感光的终端处。在本实验中我们观察到，糖尿病组较对照组相比，大鼠视网膜中GLAST转运体的表达显著下降，玻璃体腔注射给予外源性BDNF后GLAST表达增加，在一定程度上恢复了GLAST的空间表达。丙二醛MDA，是氧化应激的一个标志，是脂质过氧化的产物，涉及多不饱和脂肪酸的氧化转化，是与生物学有关的自由基反应中研究最多的一种产物，caspase-3是一种凋亡执行酶，氧化应激时产生的过量的ROS通过激活该酶诱导细胞DNA损伤和凋亡[33-34]。在本实验中我们发现与对照组相比糖尿病组中视网膜谷氨酸浓度、MDA含量和caspase-3蛋白表达显著升高，而给予BDNF治疗后视网膜中谷氨酸浓度、MDA含量和caspase-3蛋白表达较糖尿病组显著减少，提示BDNF能够减轻视网膜氧化应激损害，提高视网膜Müller细胞GLAST表达，减少视网膜谷氨酸含量，改善视网膜Müller细胞摄取谷氨酸能力。GS是Müller细胞中特异性的谷氨酸代谢合成酶，从内界膜（ILM）延伸到外界膜（OLM）跨过视网膜各层。早期学者研究发现GS主要表达在视网膜Müller细胞的胞体、尾足和视网膜长轴细胞的突起上，在神经节细胞层（GCL）、神经22 纤维层（NFL）以及内核层（INL）等均有表达[35]。在正常视网膜中，谷氨酸由RGC神经突触释放，再被GLAST从细胞间隙转运至Müller细胞，很快被GS转换成谷氨酰胺，然后RGC再摄取谷氨酰胺作为神经递质进行神经信号的传导，完成谷氨酸-谷氨酰胺循环。因此，视网膜特异性酶GS的活性与Müller细胞维持谷氨酸的平衡息息相关。以前的报道发现GS在谷氨酸介导的氧化应激中起着重要作用，氧化应激导致视网膜Müller细胞中GS表达水平降低[36]，影响谷氨酸代谢和清除，间接导致RGC不可逆性损害。在本研究结果中发现，DR时GS表达显著减少，GS在Müller细胞中的形态和空间分布都改变，进而使GS酰胺化谷氨酸能力下降，推测DR可能导致视网膜Müller细胞结构和功能改变，视网膜谷氨酸过度堆积损害RGC。而给予外源性BDNF后GS表达活性增加，推测BDNF能够减轻氧化应激对视网膜Müller细胞中GS的抑制作用，改善Müller细胞的结构和功能，进而减轻过多的谷氨酸对RGC的损害。另外，突触素SYN又称为突触囊泡蛋白或称突触生长素，是一种钙结合蛋白，参与突触的形成和突触可塑性的构建，是神经元发育、再生和损伤的标记物之一[37]。SYN主要表达在正常视网膜的内丛状层和外丛状层，这些部位是突触形成和视觉信号传导的关键部位。本实验中还发现糖尿病组视网膜突触素SYN蛋白表达下降，而BDNF组视网膜SYN较糖尿病组表达有所增加，但BDNF是通过减少视网膜谷氨酸堆积，间接提高SYN表达还是直接作用于视网膜SYN，目前我们的实验研究还不能充分说明，值得我们进一步研究分析和讨论。23 结论1、BDNF能够通过发挥抗氧化作用显著减少糖尿病视网膜谷氨酸浓度，提高Müller细胞中GLAST以及GS的表达活性。2、BDNF能够减少糖尿病视网膜MDA含量以及抑制细胞凋亡执行酶caspase-3的表达，减轻视网膜氧化应激损害。3、推测BDNF通过减轻谷氨酸兴奋性毒性损害，进而间接提高SYN的表达，保护RGC，但其作用机制还不清楚，需要我们对其进一步研究。24 ·本研究创新性的自我评价·本研究我们通过建立糖尿病模型，模拟体内DR病理条件，玻璃体腔注射BDNF后，我们发现BDNF能显著减少视网膜内谷氨酸浓度、MDA含量以及凋亡执行蛋白caspase-3表达，减轻视网膜氧化应激损害，提高视网膜GLAST、GS以及SYN表达活性，间接保护RGC。在此实验的研究基础上为DR的临床治疗和病理机制的研究提供了一定的理论基础。但是目前DR的发病机制非常复杂，是多因素、多水平、多分子基础的，同时对于BDNF及其下游信号通路是如何改善GLAST及GS活性发挥抗氧化作用还不十分清楚。另外BDNF提高视网膜SYN表达是通过减少谷氨酸堆积间接保护SYN还是直接作用于SYN还不明确，都值得我们进一步研究和探索。25 ·参考文献·1.WhitingDR,GuariguataL,WeilC,etal.IDFdiabetesatlas:globalestimatesoftheprevalenceofdiabetesfor2011and2030.[J].DiabetesResearch&ClinicalPractice,2011,94(3):311-321.2.VillarroelM,CiudinA,HernándezC,etal.Neurodegeneration:Anearlyeventofdiabeticretinopathy[J].WorldJournalofDiabetes,2010,1(2):57-64.3.BarberAJ,GardnerTW,AbcouwerSF.Thesignificanceofvascularandneuralapoptosistothepathologyofdiabeticretinopathy.[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience,2011,52(2):1156-1163.4.OlaMS,NawazMI,SiddiqueiMM,etal.Recentadvancesinunderstandingthebiochemicalandmolecularmechanismofdiabeticretinopathy[J].JDiabetesComplications,2012,26(1):56-64.5.ReichenbachA,BringmannA.NewfunctionsofMullercells.[J].Glia,2013,61(5):651–678.6.XieB,JiaoQ,ChengY,etal.Effectofpigmentepithelium-derivedfactoronglutamateuptakeinretinalMullercellsunderhigh-glucoseconditions[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience,2012,53(2):1023-1032.7.MohammadG,SiddiqueiMM,AbuEl-AsrarAM.Poly(ADP-ribose)polymerasemediatesdiabetes-inducedretinalneuropathy[J].MediatorsofInflammation,2013,2013(2):510451.8.NumakawaT,MatsumotoT,NumakawaY,etal.ProtectiveActionofNeurotrophicFactorsandEstrogenagainstOxidativeStress-MediatedNeurodegeneration.[J].JournalofToxicology,2011,(2011-05-31),2011,2011(1):405194.9.HuM,ZouW,WangCY,etal.HydrogenSulfideProtectsagainstChronicUnpredictableMildStress-InducedOxidativeStressinHippocampusbyUpregulationofBDNF-TrkBPathway[J].OxidativeMedicineandCellularLongevity,2016,(2016-7-25),2016,2016(225):2153745.10.WangN,WuL,CaoY,etal.Theprotectiveactivityofimperatorininculturedneural26 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·附录·一、文献综述视网膜Müller细胞在氧化应激诱导的糖尿病视网膜病变中的研究进展糖尿病是一种慢性疾病，其并发症是严重的累积多系统的，其中包括微血管功能障碍，如DR，糖尿病肾病和糖尿病周围神经病变等。近几十年来，糖尿病的患病率不断上升，不仅影响不同年龄段人群的社会经济负担，也是当前卫生保健面临的重大挑战[1]。DR是糖尿病患者进展缓慢、多因素导致的的并发症，同时也是由糖尿病患者体内长期血糖升高引起的一种致盲性眼病，是世界范围内糖尿病发展到晚期最常见的并发症之一[2]。长期高血糖会削弱和损害视网膜内的小血管，这可能会导致糖尿病黄斑水肿、玻璃体积血、视网膜脱离和新生血管形成性青光眼[3]。如果不及时治疗，糖尿病患者的视网膜病变会影响患者视力并导致失明。尽管目前对慢性糖尿病并发症的认识有了很大进展，但DR仍然是一个重要的临床问题，部分原因是缺乏有效的预防的治疗干预。目前的治疗主要是防止疾病的进展，但不能有效地恢复患者逐渐丧失的视力。因此，详细地了解DR的分子和细胞机制，并提出诊断和治疗措施是十分必要的。（一）DR概述1、DR的微血管病变视网膜是糖尿病损伤的组织之一，也是研究早期糖尿病微血管并发症的“窗口”之一，如DR是临床观察到一种糖尿病并发症,是导致成年人失明的主要原因。视网膜血管约100-300μm,可以很容易地评估和检测早期的视网膜微脉管系统的变化，视网膜摄影技术和计算机软件能够客观和精确测量视网膜血管改变,如小动脉和小静脉的口径以及视网膜血管弯曲度[4]。也有技术能够检测和量化视网膜微30 动脉瘤，测量疾病早期DR血管的活动和动态变化[5-6]，更好的了解DR时微循环系统改变的病理变化和机制。高血糖环境下血管细胞的变化最早的病理反应，如暴露在高血糖下的内皮细胞。特别是具有调节血压、提供营养输送等作用的微血管系统，对高血糖损伤反应最为敏感，表现为微血管舒缩（在许多微血管床中观察到的小血管自发收缩和舒张），这主要是适应局部代谢需要所产生的肌源性反应[7]。DR被认为是以血管渗透性增加，微血管瘤形成以及新生血管生成导致失明为特征的微循环异常的血管疾病，早期DR微循环紊乱的病理变化主要是内皮细胞基底膜增厚，周细胞凋亡，血-视网膜屏障完整性损伤，视网膜微血管瘤形成等[8-9]，同时随着糖尿病视网膜环境下缺血缺氧的进一步发展，使刺激新生血管生成的主要因子，即血管内皮生长因子上调，最终导致内皮细胞增殖和新生血管生成。2、DR的视网膜神经退行性病变DR的发病机制是个复杂的病理过程，是多阶段、多因素、多分子作用的结果。以前报道认为，糖尿病主要损害视网膜微血管组织，因此但目前越来越多的研究发现，在DR微血管病变之前，就已存在视网膜神经组织病变，临床表现为视网膜电图ERG的a,b波检查结果异常、视野及暗适应改变、对比敏感度和色觉下降、视网膜神经纤维层变薄、视网膜神经细胞死亡以及神经胶质细胞激活和反应性增生等[10-11]，可见糖尿病视网膜神经退行性疾病是DR发病机制中的一个早期事件，甚至参与微血管异常的发展。早期的研究发现DR视网膜神经退行性病变除了糖尿病诱导的神经节细胞轴突变性、轴浆运输机械性受阻、Müller细胞神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加、炎症及神经营养因子代偿性增加之外，还发现DR时谷氨酸代谢改变导致视网膜慢性毒性，这些视网膜异常导致变化都得到了很好的理论研究，并且其异常变化常常先于临床DR[12]。DR神经退行性病变可能参与的机制包括氧化应激损伤、慢性炎症或代谢紊乱、视网膜神经细胞AGE积累、线粒体毒物兴奋效应以及神经营养因子失衡等[13]。在很早研究中用检眼镜检查发现，视网膜神经细胞和神经胶质细胞在DR发生后出现各种改变，因此也成为视网膜神经病变，这一术语可以很好的区分视网膜血管损害，包括视网膜内屏障完整性缺失、视网膜微血管阻塞和渗漏以及视网膜局部缺血性改变[14]。31 （二）DR与氧化应激一直以来氧化应激及其发生的相关机制与各种疾病的病理发生有关。氧化应激被定义为高活性分子（自由基）的产生是通过机体自身系统中的抗氧化剂来中和消除其有害影响来达到二者的平衡[15]。自由基是高活性分子，参与重要的信号传导和细胞内稳态，这是许多生理功能所必需的，也是第二信使。氧化应激产生的生物大分子氧化剂，包括蛋白质的，脂类，碳水化合物等在细胞内的平衡状态被打破，并与其他分子反应，造成进一步的细胞损害[16]。视网膜是富含多不饱和脂肪酸的组织，其特点是具有高能量需求且常常暴露于光下，这些条件共同促成了视网膜组织易于经受氧化应激，导致视网膜经受不同程度的损害，氧化应激参与了DR的发病机制，在DR患者中发现视网膜组织中含有高水平的活性氧物质[17]。越来越多的证据支持糖尿病高糖环境诱发的视网膜氧化应激在DR的发病机制中起至关重要的作用，乙二醛和甲基促进形成晚期糖基化终产物（AGEs）产生导致氧化应激形成[18]。另外，多元醇通路和蛋白激酶C（PKC）的激活、氧类自由基过量产生等等一系列病理生理活动都能够增加氧化应激发生，并且进一步导致促血管生成因子激活和炎症发生[19-21]。氧自由基包括过氧阴离子自由基和羟基自由基，是整个活性氧物质（ROS）的一部分。在氧化磷酸化反应中，电子传递链作为非酶一氧反应的产物，在线粒体中产生过氧阴离子自由基。然而过氧化物阴离子自由基不能穿过细胞膜，仍存在于膜内且由过氧化物酶释放[22-23]。ROS在许多细胞正常生理活动和代谢中发挥重要作用，通过不同的机制改变细胞的反应，包括参与内膜信号转导通路、维持信号传递、调节代谢物等[24]。慢性持续高糖刺激使视网膜产生过量活性氧物质，而抗氧化物质损耗过多，导致氧化和抗氧化失衡，视网膜遭受氧化应激损伤，视网膜因其高能量代谢的需求对ROS较为敏感，过量的ROS与多种细胞成分（蛋白质、脂类和核酸）相互作用，使细胞膜脂质过氧化，细胞膜通透性增加，线粒体DNA氧化受损，最终视网膜血管和细胞功能障碍甚至死亡[25-26]。在高血糖条件下，ROS增加血管通透性和诱导视网膜缺血，导致视网膜微循环灌注不足，这些都是导致DR的发生和发展的共同途径[27]。氧化应激间接或直接的影响视网膜神经元变性和视网膜神经胶质细胞激活，并且导致视网膜细胞凋亡和启动炎症通路，32 最终导致新生血管生成和视网膜神经组织的破坏，视网膜神经细胞变性进一步促进视网膜更多的细胞凋亡和炎症反应[28]，氧化应激干扰视网膜细胞内钙离子稳态，使视网膜组织引起毒性损害，进一步使视网膜内源性和外源性细胞防御机制破坏[29]。另外，过多的ROS激活多聚ADP核糖聚合酶（PARP）通路，降低3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的活性，从而导致多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）通路以及己糖胺通路激活，产生过多的晚期糖基化终产物（AGEs）[30]。另外，高血糖环境诱导慢性氧化应激条件下，SIRT1和SIRT6下调导致内皮细胞衰老和丢失，使视网膜微循环障碍[31-32]。(三)视网膜Müller细胞与DR1、视网膜Müller细胞概述Müller细胞最早由德国人Muller(1851)研究发现，描述其形态特点和功能，最终用他的名字命名为Müller细胞。视网膜Müller胶质细胞能够产生多潜能祖细胞，即视网膜干细胞，但其产生途径研究很少，如Notch途径、Rax途径以及JAK信号转导途径[33]。Müller细胞是视网膜中最主要的神经胶质细胞，占有比例为90%左右，细胞的形态多为不规则形，呈细长型或者放射状生长。视网膜Müller细胞的胞体存在视网膜内核层，与邻近神经元接触并有助于外界膜和内界膜形成，视网膜Müller细胞这种特异性地形态更好的监测视网膜内稳态，并有助于维持视网膜的结构和功能[34]。视网膜Müller细胞在视网膜组织中形成纵向网状结构，在维持视网膜离子和水平衡、清除代谢废物和维持谷氨酸代谢平衡以及维持血-视网膜屏障的完整性等起重要作用，并且与视网膜神经元和视网膜血管有密切的关系，维持视网膜神经元的结构和代谢[35]。视网膜Müller细胞在视网膜神经退行性疾病的发生和发展过程中起重要作用。Müller细胞在应对外界损害和有害刺激时导致胶质细胞增生，通过改变自身的形态、生物化学反应过程以及生理机能改变[36]。DR时视网膜Müller胶质细胞激活，产生胶质细胞激活反应，其变化特点是是细胞肥大，伴随着中间纤维蛋白（IF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白上调[37]。增生反应性胶质视网膜Müller细胞可增殖并产生所谓的僵硬的胶质瘢痕，代替损伤和坏死的的视网膜细胞，阻碍哺乳动物中枢神经系统中再生神经元的生33 长和视网膜内细胞的迁移和分化，使视网膜局部缺血缺氧和再灌注损伤[38]。2、视网膜内谷氨酸代谢在体内，谷氨酸以游离的形式作为神经系统的一种神经递质，参与各组织细胞内神经递质传递和调节。视网膜细胞突触间隙的谷氨酸浓度必须保持在较低水平，过量的细胞外谷氨酸会导致兴奋性毒性，因此，其浓度需要严格监控以避免产生兴奋性毒性导致神经元死亡。这种维持谷氨酸浓度的稳定调节是通过在视网膜细胞如神经元和神经胶质细胞中表达的一系列Na+依赖性转运体去除过多的谷氨酸来完成的[39]。在病理状态下谷氨酸产生的神经毒性主要由于细胞间隙的谷氨酸过多堆积，与其特异性受体结合，使离子渗透压和膜电位改变，细胞内Ca2+浓度增加，其他离子浓度也相继增加，使细胞内一些列效应酶激活或者活化，产生消化细胞膜的各种酶，最终导致神经细胞或者其他细胞内成分外流或细胞肿胀、营养代谢衰竭引起死亡[40]。3、与视网膜内谷氨酸转运和平衡代谢相关的转运体到目前为止，已被报道视网膜中存在5中转运体亚型（兴奋性氨基酸转运体EAAT1-EAAT5）。神经胶质细胞转运体EAAT-1即GLAST（Na+依赖性谷氨酸/天冬氨酸转运体）和EAAT-2（GLT-1）主要负责脑中90%谷氨酸的转运，尽管已经有报道在视网膜中有EAAT4表达，但位于视网膜视网膜Müller细胞上的GLAST是负责谷氨酸转运以及摄取再利用的最主要的谷氨酸转运体[41-42]。并且在Müller细胞上有选择性调节GLAST功能活性的膜微团结构。视网膜神经胶质Müller细胞围绕谷氨酸能突触，表达谷氨酸转运体（GLAST）和谷氨酸代谢酶即谷氨酰胺合成酶（GS）。细胞外的谷氨酸通过GLAST转运到视网膜Müller细胞中，再由GS将谷氨酸酰胺化成无毒的氨基酸即谷氨酰胺。视网膜Müller细胞释放谷氨酰胺，由视网膜神经元摄取，最终由谷氨酰胺酶水解成谷氨酸，这个过程称为谷氨酸-谷氨酰胺循环[43]。4、氧化应激与视网膜Müller细胞视网膜Müller细胞在维持视网膜正常的结构和功能以及脉管系统的完整性方面起着关键的作用。在视网膜疾病如视网膜缺血性病变、DR、视网膜缺氧等条件34 下，Müller细胞经受氧化反应诱导的损伤，表现为视网膜Müller细胞内中间反应丝蛋白，即胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）表达上调，另外血管损伤因子和炎症介质增加，包括细胞因子、趋化因子和粘附分子。有研究报道，依布硒啉通过减少ROS产生和增加抗氧化基因来调节氧化应激，改善缺血缺氧条件下视网膜Müller细胞的功能，进而减少胶质细胞增生、新生血管以及炎症介质的生成[44]。另外，有几项临床研究表明，糖尿病患者血清炎症标志物，包括细胞内的C-反应蛋白、调节免疫细胞增殖活化和炎症反应的白细胞介素6（IL-6）以及由巨噬细胞产生的应对感染或其他免疫源反应的肿瘤坏死因子-α（TNF-α），它们的水平均升高，表明炎症过程在DR的发病机制中起着相当重要的作用[45]。水通道蛋白-4（AQP4）是最丰富的渗透驱动的膜水通道，在维持正常视网膜液体和水稳态中是必不可少的。糖尿病条件下导致视网膜Müller细胞反应性胶质细胞增生，使AQP4重新分布，其表达改变最终导致视网膜水肿[46]。有研究发现，DR的早期病变涉及谷氨酸介导的氧化应激。高血糖会引起视网膜谷氨酸系统紊乱，导致谷氨酸浓度增加。并且ZhouJ等人发现GS在谷氨酸介导的氧化应激中起着重要作用，高糖条件下Müller细胞中GS水平降低。谷氨酸通过Müller细胞中的谷氨酸转运体和GS维持平衡，两者的功能紊乱都会导致视网膜谷氨酸代谢失衡，进一步导致Müller细胞功能紊乱，进而诱导RGC凋亡[47]。（四）DR治疗及临床应用控制血糖是对于减轻DR的发生和进展的重要措施，并且使糖化血红蛋白维持在7%左右能够更好的控制血糖值。早期治疗DR的研究数据表明，降低血脂也能降低DR患者视网膜的硬渗出液和视力丧失的风险。常用的手术方法有激光光凝治疗，用于增生期DR，可以破坏缺血区视网膜，减少需氧量，防止新生血管形成，并使已经形成的新生血管退化，阻止病变继续恶化，对于黄斑水肿和黄斑囊样水肿可行氪黄激光局灶或格栅光凝术，减轻水肿。但激光治疗的副作用和并发症并不少见。然而，在大多数情况下，激光治疗所带来的术后并发症较DR所带来的失明的风险相比是较轻的。对于晚期增生期DR形成出现的玻璃体积血长时间不吸收、牵拉性视网膜脱离、特别是即将或者新发生的黄斑部脱离，临床治疗应立即采取玻璃体切割术，若脱离严重手术中可以同时使用全视网膜光凝术，以35 免再出血；还可进行辅助治疗如全身使用改善微循环药物[48]。在近几年的研究中发现，炎症在DR的发生和进展中起着重要的作用，因此炎症调节也可能作为治疗DR的重要方法，其中皮质类固醇激素、非甾体抗炎药（NSAIDs）、抗VEGF药物和抗肿瘤坏死因子（TNF）制剂都已被证明可以改善DR的发生和进展，另外非甾体抗炎药还可以通过抑制TNF-α防止DR的进展。皮质类固醇激素常用的有曲安奈德、地塞米松、氢化可的松等，有研究报道，曲安奈德可用于治疗糖尿病黄斑水肿，应用治疗剂量为1mg-4mg的曲安奈德治疗方案与激光光凝治疗相比，在治疗后的2-3年随访中发现激光光凝治疗由于皮质类固醇激素的应用。鲁博斯塔（RBX）是一种口服制剂，是PKC的异构型选择性抑制剂，在改善DR模型以及改善糖尿病患者视网膜血流动力学异常中起治疗作用。近年采用玻璃体内注射抗VEGF药物治疗DR出现的黄斑水肿和眼内新生血管形成取得了较好的疗效。目前常用的抗VEGF药物有：兰尼单抗、贝伐单抗、哌加他尼钠以及阿柏西普。但是，目前只有兰尼单抗是FDA批准用于DR晚期糖尿病视网膜黄斑水肿此适应症，兰尼单抗只是贝伐单抗抗体得Fab片段。最近有研究显示，贝伐单抗或激光治疗的研究为长期使用贝伐单抗治疗晚期DR黄斑水肿提供理论支持[49]。36 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四、个人简介姓名：梁汇珉性别：女籍贯：山东省淄博市出生年月：1988年08月学习经历：2004～2007淄川第一中学2008～2011山东医学高等专科学校临床医学2012～2014泰山医学院临床医学2015～2018锦州医科大学人体解剖学与组织胚胎学45 厚德修身精术济世