家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究

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分类号：Q7密级：公开UDC：577编号：10299S1217021JIANGSUUNIVERSITY学术型硕士学位论文ThesisforAcademicMasterDegree硕士类别：理学硕士论文题目：家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究学科专业：生物化学与分子生物学作者姓名：徐五指导教师：姚勤研究员答辩日期： 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：年月日 学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布（包括刊登）授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密□。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究ExpressionandcytotoxicityanalysisofBombyxmoribidensovirusNS1protein专业名称生物化学与分子生物学指导教师姚勤研究员作者姓名徐五 江苏大学硕士学位论文摘要家蚕二分浓核病毒（Bombyxmoribidensovirus，BmBDV）是继BmNPV（家蚕核型多角体病毒，Bombyxmorinuclearpolyhydrosisvirus），BmCPV（家蚕质型多角体病毒，Bombyxmoricypovirus）之后又一种感染家蚕的特异性病毒。它是一种慢性病毒，感病家蚕7到12天死亡，其病症与浓核病毒感染相似。该病毒最初被命名为家蚕浓核病毒Ⅱ型，鉴于该病毒特异的基因组结构以及基因组中编码DNA聚合酶基因，2012年，国际病毒分类委员会新设立二分DNA病毒科，家蚕二分浓核病毒是该病毒科中的唯一代表种。BmBDV基因组可以表达多个非结构蛋白，其中NS1蛋白由BmBDVVD1基因组中ORF2阅读框编码，其长度为951nts(核苷酸，nucleotides)，含有316个氨基酸理论序列，分子量为36kDa，等电点为8.7。前期研究结果表明：NS1是一种多功能蛋白，不仅具有ATPase与解旋酶活性，而且还能结合特定核酸序列，且磷酸化修饰能调控NS1蛋白的生物活性。在本研究中，将NS1蛋白与GST标签融合构建原核表达载体，通过改变诱导表达条件和优化翻译起始区密码子，在大肠杆菌大量表达可溶性NS1蛋白，进而研究纯化的NS1蛋白对家蚕细胞和家蚕个体的毒性作用。另外，用pull-down实验对NS1蛋白与DNA聚合酶及家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142之间的相互作用进行分析。研究结果表明：在不同温度的诱导条件下，20℃诱导，可溶性的NS1蛋白表达量最高；而在ns1翻译起始区（translationalinitiationregion，TIR）引入4个同义突变，未见显著提高其原核表达量；纯化的NS1蛋白添加到BmN细胞培养基中，能明显抑制细胞增长，BmN细胞形态发生改变；NS1蛋白注射到家蚕血液中，会加速家蚕死亡。本研究为解析NS1蛋白的分子机制具有一定作用。具体研究内容如下：（1）NS1原核表达载体构建，通过一系列PCR、酶切与酶连，构建了NS1蛋白与GST标签融合的原核表达质粒pGEX-5X-3-ns1wt。其次，为了提高NS1蛋白在大肠杆菌表达量，在ns1基因的翻译起始区TIR区中引入4个翻译频率较高的同义突变，构建了GST标签融合的重组质粒pGEX-5X-3-ns1M。另外，构建了NS1蛋白与His标签融合的重组质粒pET30a-ns1C。（2）2种重组质粒在大肠杆菌BL21中的表达，用4种不同温度（16℃、20℃、28℃、37℃）诱导重组质粒表达，在20℃时，pGEX-5X-3-ns1wt可溶性I 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究NS1蛋白表达产量最高；在20℃和37℃两种温度诱导条件下，比较野生型重组质粒pGEX-5X-3-ns1wt和TIR的突变型重组质粒pGEX-5X-3-ns1M表达NS1蛋白，结果显示NS1翻译起始区的密码子同义突变并不能明显提高目的蛋白的表达量与可溶性。此外，对20℃诱导表达的目的蛋白进行纯化，经质谱分析表达产物是融合蛋白NS1。（3）NS1蛋白的毒性研究，在BmN细胞培养基中添加了不同浓度的NS1蛋白，观察NS1蛋白对家蚕培养细胞的作用。另外，用纯化NS1蛋白溶液给家蚕幼虫添食或皮下注射；观察NS1蛋白对家蚕个体的影响。结果表明：NS1蛋白能抑制BmN细胞的正常生长与增殖。添食NS1蛋白对家蚕没有毒性，而皮下注射NS1蛋白会致家蚕死亡；（4）NS1的互作蛋白研究，前研究结果报道：NS1蛋白能与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142和病毒VD1-ORF4编码的DNA聚合酶结合。为深入研究NS1蛋白与这两种蛋白哪个区域结合，本论文通过体外pull-down实验，将NS1蛋白与Bm-SP142蛋白、VD1-ORF4截短的3个原核表达产物互作分别进行了分析，结果都呈阴性，表明NS1蛋白与这些蛋白的相互作用较弱，或许它们结合还需要其它蛋白的介入等其它因素。关键词：家蚕二分浓核病毒，非结构蛋白1，突变，细胞毒性，蛋白互作II 江苏大学硕士学位论文AbstractBombyxmoribidensovirus(BmBDV)isachronicvirusanditcanspecificallyinfectBombyxmori.Silkwormwillsurviveabout7to12dayswhenitwasinfectedwiththevirus,ThesymptomsofBmBDV-infectedsilkwormaresimilartothatofsilkworminfectedwithBombyxmoridesovirus.BmBDVwasoriginallynamedtypeⅡBombyxmoridesovirus.Accordingtothespecificgenomeorganization,virusparticlesandDNApolymerasegenecodingregioncontainedinvialgenome,184membersoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofVirusesvotedtoagreewiththeproposalstocreateanewgenus,Bidensovirus,aswellasanewfamily,Bidnaviridae,andBombyxmoribidensoviruswasdesignatedasthetypespeciesoftheBidensovirusgenus,.BmBDVns1consistedof951nucleotidesencodingapredicted316-aminoacidprotein,whichwasidentifiedtobeaNon-structuralproteininvolvedinviralreplication.TherelativemolecularweightofBmBDVNS1is36kDaandisoelectricpointis8.7.PreviousstudyshowedthattheNS1proteinisamulti-functionalprotein,notonlypossessingATPaseandhelicaseactivity,butalsobindingwiththespecificDNAsequences.Additionally,phosphorylationcanregulateBmBDVNS1proteinbiologicalactivity.TofurtherstudytheeffectofBmBDVNS1onsilkwormdevelopment,silkwormwereorallyfedwithpurifiedBmBDVNS1orsubcutaneouslyinjectedwithBmBDVNS1inthisstudy,.RecombinatplasmidfortheexpressonofBmBDVNS1fusionwithGSTwasconstructed,andoptimizatingtranslationinitiationcodonandaseriesofvariedconditionsweredesignedtostudytheoptimalyieldoftargetprotein..ThepurifiedtargetproteinwassubjectedtoMALDI-TOF-MSanalysis,whichwasusedtoevaluatethetoxicityonBmNcellsandsilkworm.PurifiedBmBDVNS1wasfeeddirectlytosilkworms(306strains)andsubcutaneouslyinjectedintothesilkworms.Additionally,differentconcentrationsoftargetproteinwereaddedintotheculturemediumofBmNcells.TheresultsshowedthatthemutationsinTIRofBmBDVns1III 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究havenoeffectonimprovingtheefficiencyofexpressionofBmBDVns1,andBmBDVNS1proteinmaybecytotoxictocellsandinducesdeathofsilkworm.Additionally,BmBDVNS1couldreachitsthehighestyieldat20℃comparedwiththatoftargetproteinin16℃,28℃and37℃.Moreover,previousstudiesshowedthatinteractionsbetweenBmBDVNS1proteinandBmBDVDNApolymeraseaswellassilkwormserineproteaseBmSP142.Tofurtherdisclosethespecificinteractionsites,AseriesoftruncationswereexpressedinE.colipurifiedfromthelysates,whichwererespectivelyusedtoperformGST-pulldownexperimentsinvitro.TheresultsindicatedthattheinteractionsbetweenBmBDVNS1andthesetruncationsareweak.Itwasinferredthatthetruncationsmayaffecttheconformationoftargetproteinortheirinteractionsmaybemediatedbyotherproteins.Inconlusion,theseaboveresultsindicatedthatthelowtemperatureinductionat20℃canimprovetheyieldofBmBDVNS1insolubleform,andthetargetproteinwaspurifiedfromlysateofE.colisuccessfully,andthepurifiedBmBDVNS1caninducesilkwormdeathandinhibittheproliferationofBmNcells.Keywords:BmBDV,non-structuralprotein1,mutation,toxicity,proteininteractionIV 江苏大学硕士学位论文英文缩略词BmBDVBombyxmoribidensovirus家蚕二分浓核病毒BmNPVBombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus家蚕核型多角体病毒BmCPVBombyxmoricytoplasmicpolyhedrosisvirus家蚕质型多角体病毒DNVdensonucleosisvirus;densovirus浓核病毒BmDNVBombyxmoridensovirus家蚕浓核病毒AaDNVAedesaegyptidensovirus埃及伊蚊浓核病毒JcDNVJunoniacoeniadensovirus鹿眼蛱蝶浓核症病毒PfDNVPeriplanetafuliginosadensonucleosisvirus黑胸大蠊浓核病毒BmNBombyxmoriovariancell家蚕卵巢细胞ORFopenreadingframe开放阅读框ddH2Odoubledistilledwater双蒸水GSTGlutathioneS-transferase谷胱甘肽巯基转移酶TIRtranslationalinitiationregion翻译起始区PVDFPolyvinylidenefluoride聚偏氟乙烯膜ECLEnhancedchemiluminescence增强化学发光IPTGIsopropylβ-D-Thiogalactoside异丙基硫代半乳糖苷BSAAlbuminfrombovineserum牛血清白蛋白ntnucleotide核苷酸kDakilodalton千道尔顿Mmol/L每升摩尔数Papascal帕ggram克Lliter升mlmilliliter毫升μlmicrolitre微升rpmrevolution(s)perminute每分钟转速minminute分钟hhour小时V 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究目录第一章绪论.......................................................................................................................................11.1细小病毒科浓核病毒的研究进展......................................................................................11.2家蚕二分浓核病毒的研究...................................................................................................21.2.1家蚕二分浓核病毒概述...........................................................................................21.2.2家蚕二分浓核病毒的分子生物学研究...................................................................31.2.3病毒复制与拯救的研究...........................................................................................61.2.4家蚕对家蚕二分浓核病毒抗性的研究...................................................................71.3细小病毒与家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的研究.............................................................81.3.1细小病毒NS1蛋白功能的研究............................................................................81.3.2BmBDVNS1蛋白的相关研究................................................................................91.4研究的目的与意义.............................................................................................................101.5研究内容及技术路线.........................................................................................................111.5.1主要研究内容..........................................................................................................111.5.2技术路线..................................................................................................................12第二章BmBDVns1基因的克隆与原核表达载体构建................................................................132.1材料试剂............................................................................................................................132.1.1主要材料..................................................................................................................132.1.2主要试剂..................................................................................................................132.1.3配制试剂..................................................................................................................142.1.4实验仪器..................................................................................................................142.2实验方法.............................................................................................................................152.2.1引物设计..................................................................................................................152.2.2ns1片段的PCR......................................................................................................152.2.3将ns1片段与pMD-18T载体连接.......................................................................172.2.4转化以及验证..........................................................................................................172.2.5目的条带ns1与表达质粒的连接.........................................................................202.2.6再次转化和验证......................................................................................................232.2.7重组质粒转化E.coliBL21菌...............................................................................232.3结果与分析.........................................................................................................................242.3.1获得ns1序列.........................................................................................................242.3.2三种片段分别与表达载体连接的验证................................................................282.3.3重组质粒转化E.coliBL21菌...............................................................................282.4讨论.....................................................................................................................................29第三章BmBDVNS1蛋白的表达及纯化......................................................................................303.1材料试剂.............................................................................................................................303.1.1主要材料..................................................................................................................303.1.2主要试剂..................................................................................................................303.1.3配制试剂..................................................................................................................303.1.4实验仪器..................................................................................................................313.2实验方法.............................................................................................................................32VI 江苏大学硕士学位论文3.2.1寻找最佳诱导表达温度.........................................................................................323.2.2翻译起始区（TIR）内同义突变对表达的影响..................................................343.2.3蛋白的纯化...........................................................................................................353.2.4NS1蛋白的质谱分析.............................................................................................363.3实验结果.............................................................................................................................373.3.1最佳诱导表达温度..................................................................................................373.3.2翻译起始区（TIR）内同义突变对表达的影响...................................................393.3.3BmBDVNS1蛋白的纯化.......................................................................................413.3.4NS1蛋白的质谱分析.............................................................................................433.4讨论.....................................................................................................................................44第四章BmBDVNS1蛋白生物毒理性分析..................................................................................454.1材料试剂.............................................................................................................................454.1.1主要材料..................................................................................................................454.1.2主要试剂..................................................................................................................454.1.3配制试剂..................................................................................................................454.1.4实验仪器..................................................................................................................454.2实验方法.............................................................................................................................464.2.1NS1蛋白对BmN细胞的毒性...............................................................................464.2.2NS1蛋白在家蚕水平的毒性.................................................................................464.3实验结果.............................................................................................................................474.3.1NS1蛋白对BmN细胞的毒性...............................................................................484.3.2NS1蛋白对家蚕的毒性.........................................................................................484.4讨论.....................................................................................................................................49第五章BmBDVNS1蛋白与Bm-SP142及BmBDVDNA聚合酶的体外互作分析.................505.1材料试剂.............................................................................................................................505.1.1主要材料..................................................................................................................505.1.2主要试剂..................................................................................................................505.1.3配制试剂..................................................................................................................505.1.4实验仪器..................................................................................................................515.2实验方法.............................................................................................................................515.2.1带His标签的BmBDVNS1蛋白的表达..............................................................515.2.2NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142的pull-downassay..........................515.2.3NS1蛋白与VD1-ORF41093bp蛋白片段的pull-downassay............................525.2.4NS1蛋白与VD1-ORF4616bpA蛋白片段的pull-downassay...........................535.2.5NS1蛋白与VD1-ORF4616bpB蛋白片段的pull-downassay...........................535.3实验结果.............................................................................................................................535.3.1pET30a-ns1C/BL21菌的诱导表达........................................................................535.3.2NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142的体外互作.....................................545.3.3NS1蛋白与VD1-ORF41093bp蛋白片段的体外互作.......................................555.3.4NS1蛋白与VD1-ORF4616bpA蛋白片段的体外互作......................................575.3.5NS1蛋白与VD1-ORF4616bpB蛋白片段的体外互作......................................585.4讨论.....................................................................................................................................60第六章总结与展望.........................................................................................................................616.1主要工作总结.....................................................................................................................61VII 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究6.2展望.....................................................................................................................................62参考文献...........................................................................................................................................63在学期间发表论文及参与课题.......................................................................................................69致谢...................................................................................................................................................70VIII 江苏大学硕士学位论文第一章绪论1.1细小病毒科浓核病毒的研究进展家蚕二分浓核病毒（BombyxmoribidensovirusBmBDV）是2012年国际病毒分类委员会新设立二分DNA病毒科中的唯一代表种。2012年以前，家蚕二分浓核病毒（BmBDV）曾称作家蚕浓核病毒，被分类到细小病毒科(Parvoviridae)、浓核病毒亚科(Densovirinae)、浓核病毒属(Densovirus，现为Ambidensovirus)。BmBDV与浓核病毒有很高的相似性，因此，浓核病毒的研究对BmBDV有很高的参考意义。浓核病毒亚科最新分类为Ambidensovirus，Iteradensovirus，Penstyldensovirus，Hepandensovirus，Brevidensovirus五个属[1]。浓核病毒没有外层囊膜，病毒颗粒直径在18～24nm范围内，衣壳颗粒呈正二十面体，由60个亚单位组成，衣壳由两种或两种以上结构蛋白构成。浓核病毒的基因被分为两类，一类对应的是非结构蛋白（NS），另一类是结构蛋白（VP）。浓核病毒通常是经口感染鳞翅目昆虫。被感染后，从最初的减少食量，表皮变白，肌肉变软到停止进食，直至最后不能顺利完成蜕皮以及变态发育等必须的过程。家蚕被DNV感染后，桑叶取食量下降，躯体软化，有空头现象,在蚕框四周静止，解剖发现中肠没有桑叶，其中的消化液呈半透明黄色或绿色，整个消化管软化，显黄色[2]。黑胸大蠊、柑桔粉蚧等宿主被对应病毒感染后，其症状表现为：肌肉变软，不能正常运动。埃及伊蚊被短浓核病毒属对应病毒感染后，有幼虫会发生畸形变异，躯体麻痹，运动减缓，在水中下沉或浮于表面，受刺激会抽搐。虾被感染后，除了生长会变慢以外，暂时没有发现有其它影响。一些浓核病毒会让宿主的后肠道病变成肿瘤病灶，中肠的上皮组织增殖使肠腔堵塞。目前，还不清楚哪些分子在病毒侵染时起作用，大家普遍认为浓核病毒是依靠蛋白衣壳与宿主接触，然后通过内吞机制进入细胞内。大多数人认为是宿主具有与病毒对应的特异性受体蛋白。Pasharawipas等[3]推测C6/36细胞被登革热2病毒以及白纹伊蚊浓核病毒感染时的蛋白受体是同一种分子。浓核病毒在细胞水平对宿主的作用一般位于细胞核，病毒在细胞核内利用宿主在S阶段复制所需要1 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究元件来复制病毒DNA，生成蛋白，实现病毒复制扩增，这样会导致细胞核很快膨胀，被染色剂作用颜色会很深，用Feulgen检测[4]显阳性，这是产生细胞病变的最主要特征。首先被浓核病毒侵染的组织常常是脂肪体，大蜡螟被浓核病毒感染后，脂肪体首先病变，之后其它全部细胞内的细胞核都有生成相似的浓厚结构物质。家蟋以及黑胸大蠊等被感染后，脂肪体体积变大，腹部肿胀，在末期，脂肪体变为不正常的褐色。AaDNV感染埃及伊蚊后，前四天没有明显变化，第五天时脂肪体开始有病症，之后很多组织细胞核变大变浓[5]。JcDNV感染草地贪夜蛾后的现象和其它不同，它使气管肿胀增殖过度，导致堵塞，草地贪夜蛾会呼吸困难，最后无法存活下去。浓核病毒基因组长度不一致，大部分病毒基因组长度处于4-6kb之间，不同属的序列相似度差距很大。很多病毒都含有末端反向重复序列（invertedterminalrepeatITR），分别呈Y，U，J形发夹结构。浓核病毒的应用现在还在起始阶段，并没有完全成熟，至今所进行的尝试是利用它们作为基因转移和表达的载体，以及用于生物防治。在基因载体方面，浓核病毒基因组比较小，很方便克隆和用于转染，还可用重组质粒来进行病毒拯救。例如用PfDNV病毒重新生成的质转染黑胸粒大蠊，结果生成了PfDNV病毒颗粒[6]，Giraud[7]在JcDNV某个基因和基因启动子之间插入半乳糖苷酶基因，成功生成半乳糖苷酶。王衍海将一个内含子加到AaDNV构建的载体上，用载体作用于细胞系和宿主个体，证明插入的内含子有作用。此外，还有很多其它载体也已被制备[8]。在生物防治方面，浓核病毒均可引起对应昆虫的死亡且不感染脊椎动物[9]，与化学防治方法相比，虽然除虫周期可能要长一点，但是有没有污染，对人畜安全，防虫时间长，减缓害虫抗药性的上升等优势[10,11]。现在Buchatsky[12]已经用浓核病毒成功防治蚊子，我国也应用PfDNV开发了防治黑胸大蠊的生物制剂，美国则用浓核病毒来保护棕榈，以避免害虫对这类树的破坏。1.2家蚕二分浓核病毒的研究1.2.1家蚕二分浓核病毒概述家蚕二分浓核病毒（BmBDV）是一种家蚕慢性病毒，家蚕在感染后7到122 江苏大学硕士学位论文天死亡。它的发现和命名经历了一个复杂的过程。上世纪70年代，在日本伊那发现了一种感染家蚕的浓核病毒，被叫做日本伊那株。然后，在日本山梨县和中国镇江找到了另外2株也能感染家蚕的浓核病毒，依次被命名日本山梨株、中国镇江株[1]。这些病毒均可让家蚕感染，家蚕表现出来的病症相类似，可是经过血清学研究，染病组织病理研究和病毒基因分析，这些病毒株被分为2种类型：一种被叫做家蚕浓核病毒1型BmDNV-1，遗传物质是一个DNA单链，其中有日本伊那株；另一种被叫做家蚕浓核病毒Ⅱ型BmDNV-2，遗传物质是2条单链DNA(分别是VD1、VD2),中国镇江和日本山梨发现的就属于这一类[9]。因家蚕浓核病毒Ⅱ型特异的基因组结构，2012年，国际病毒分类委员会，为它设立了新的病毒科，二分DNA病毒科，家蚕浓核病毒Ⅱ型被正式命名为家蚕二分浓核病毒（BmBDV）[13]。家蚕感染BmBDV后，被感染的宿主细胞会肿大，里面的细胞核也会由于病毒扩增而膨胀变大，在感染的最后阶段，细胞核的大小可以超过正常普通细胞核的2.5倍，细胞核的大部分结构会变得均一浓稠，而且能发生孚尔根的强烈反应或可以用甲基绿染色，当pH小于7时，可以用吖啶橙生成红色或橙黄色。在末期，被感染圆柱形上皮细胞会退化，然后被释放到肠腔中。在个体水平，被感染家蚕的进食量逐渐下降，动作变慢，体型缓缓变小，最后停止进食桑叶，胸部变为半透明，在后期，排出的粪便中可以观察到成熟的颗粒状病毒，解剖发现，在前部肠腔没有桑叶。经试验发现，同BmNPV相似，家蚕在不同的发育阶段呈现出对病毒BmBDV的抵抗力的差异，在前3个龄期，家蚕很容易被感染，从第4龄开始，家蚕的感受性明显降低，5龄时，发病还会减少，蛹期和蛾期，病毒繁殖降低，病症也很少。1.2.2家蚕二分浓核病毒的分子生物学研究家蚕二分浓核病毒的遗传物质两条单链DNA（VD1和VD2），分别由两个病毒颗粒包裹。病毒颗粒和家蚕浓核病毒1型相似，是正二十面体，没有外层囊膜，直径在18～24nm范围内。2005年，家蚕二分浓核病毒中国镇江株基因组全长被测序,VD1与VD2全长分为6543nts与6022nts。研究至今，已确定VD1有4个开放阅读框，分别命名VD1-ORF1、VD1-ORF2、VD1-ORF3和VD1-ORF4，依次编码NS2和NS1（非结构蛋白），VP（主要结构蛋白），DNA聚合酶（前3 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究3个是正链编码，第4个由负链编码）；VD2有2个开放阅读框VD2-ORF1和VD2-ORF2，依次编码NS3（非结构蛋白），P133(次要结构蛋白)。(1)衣壳蛋白的研究衣壳蛋白主要由VD1-ORF3和VD2-ORF2编码。2007年到2010年之间，吕萌[14,15]用携带有VD1-ORF3阅读框的pMAL-c2x-vp质粒在E.coli中原核表达vp基因，免疫白兔，获得多克隆兔抗。通过梯度离心从蚕沙中获得病毒颗粒，并用Westernblot和质谱方法检测到VDl-ORF3编码的两个结构蛋白（当时被命名为P6和P5），VD2-ORF2对应的最大结构蛋白（当时被命名为P7）。此外在Sf9细胞（SpodopterafrugiperdaSf-9细胞）中通过杆状病毒成功表达vp基因，生成两条蛋白带。2011到2014年期间，潘晓利[16]检测了BmBDV中主要VP蛋白在家蚕中的表达状况，其中通过westernblot发现VD1-ORF3能在中肠中表达出VP1、VP1，和VP2三种结构蛋白。用杆状病毒表达系统表达了BmBDV-vpl和BmBDV-vp2，BmBDV-vpl在Sf9细胞中表达出VP1、VP1，和VP2三个蛋白，BmBDV-vp2在Sf9细胞中表达出VP2和37kD两个蛋白。2012到2015年，邢亚丽等人[17,18]用纯化获得的病毒粒子进行二维电泳，鉴定到了病毒的主要结构蛋白，然后在Sf9细胞中用转移载体pFBDM同时表达VP和SP的对应序列，结果获得了样病毒颗粒，最后通过突变表达vp，证明是通过漏扫描机制生成VPs蛋白。至今，已确认BmBDV有7种结构与蛋白，其中VD1-ORF3编码的是P5和P6，由VD2-ORF2编码的是P7（即P133），P1和P2是家蚕体内的脂肪酶，P3和P4的来源还不是很清楚。(2)其它蛋白的研究BmBDV编码衣壳蛋白之外，还编码一个DNA聚合酶，和NS1，NS2，NS3三个非结构蛋白。BmBDV是目前已知单链DNA病毒中唯一编码DNA聚合酶的病毒，根据分析该聚合酶由VD1-ORF4编码,VD1-ORF4由3318个核苷酸组成，编码1105个氨基酸，预测分子量为127kDa。它的C端含有DNA聚合酶B家族2特征氨基酸序列，该家族的聚合酶都是用蛋白作为引物。在VD1-ORF4中部依次含有外切酶结构域的基序和聚合结构的基序。4 江苏大学硕士学位论文图1.1BmBDVVD1-ORF4的部分表达片段Fig1.1PartialpeptidesfromBmBDVVD1-ORF42010年，郭旭丽[19]表达了VD1-ORF4N端326个氨基酸肽段以及其中的polmotif，并分别制备抗体，检测病毒颗粒中的蛋白以及VD1-ORF4的表达时相。2011年，李国辉等人[20]表达了VD1-ORF4上与DNA聚合酶同源的1077bp序列，并制备了鼠抗，用所制备的抗体检测了VD1-ORF4全长序列在BL21菌中表达出一条很特异的条带（如图1.1）。2013年前后，王鹏[21,22]原核表达了该阅读框上与1077bp有部分重合的2个600bp序列（如图1.1），也用表达产物制备了鼠抗，同时定制了VD1-ORF4上理论氨基酸的单克隆抗体，用这些抗体在被感染家蚕中肠中检测到了VD1-ORF4对应的多个蛋白，大小分别为127kDa，70kDa，53kDa和45kDa。同时，通过免疫荧光，发现VD1-ORF4在细胞核与质内均有表达。最近，他们用pMAL-c2X质粒和Ac－Bacmid载体连接VD1-ORF4全长序列后，分别在BL21菌和Sf-9细胞中表达，但是两种方法表达的SDS-PAGE图和Westernblot结果均显示被表达的融合蛋白只有约70kDa。WangF等[23]在2011年发表的文章显示，NS2蛋白由VDI-ORF1编码，长381nts，她们首先进行了His标签融合的原核表达并制备多抗，然后对感染后的家蚕进行RT-PCR以检测转录情况，最后融合荧光蛋白在BmN细胞中表达，荧光结果显示NS2定位在核膜上。2007年，尹慧娟[24]对BmBDVVD2-ORF1编码的NS3蛋白基因进行了研究。VD2-ORF1长度为669nts，用RT-PCR方法检测到NS3基因在2hpi时开始转录，在35-70hpi时转录水平非常高，根据基因组的复制时期的相关研究，她推测，NS3可能参与了病毒DNA复制以及病毒的组装[25]。此外，用pET30a-NS3在菌种进行了原核表达，并成功制备多抗；还用构建的rBac-EGFP-NS3病毒分别感染家蚕幼虫和细胞系BmN[26]，Westernblot显示，NS3在两者中都有表达；最后，他还构建了BmBacmid-NS3、rBac-NS3、5 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究AcBacmid-NS3以及pFastBacHTb-NS3等没有EGFP的载体。(3)启动子的研究2011年，朱守林等人[27]对BmBDV非结构蛋白1/2的P5启动子进行了研究，首先通过生物信息学分析，结果发现该序列有若干启动子特征序列，然后用双荧光素酶报告系统证明VD1和VD2的末端共有序列会减弱该启动子的活性，同时也证明该启动子在Hi5与BmN细胞中都保持较高活性，最后他还做了一系列截短序列，发现TATA-box并不是必须部分，而-236nt到-206nt部分序列却很重要。2012年，马瑛等[28]对BmBDVDNA聚合酶基因启动子进行了研究，首先对该该启动子DNA片段进行了克隆，用荧光素酶载体证明了它的活性，然后用含有NSl、NS2、VP蛋白基因的载体共转染，证明NSl、NS2抑制了启动子活性，VP能提高启动子活性，最后共转染家蚕的转录因子Bmtwis，结果显示，该因子没有作用。2014年前后，张清等[29]对病毒结构蛋白P133的启动子P89序列用相似的方法进行了研究。首先利用双荧光素酶分析系统对它的活性进行分析，结果表明：P89能在包括Hi5在内的多种细胞中均可帮助荧光素酶表达，而且在Hi5细胞系内活性最高；进而对P89进行了一系列的截断克隆，证明TATA-box[30]是维持P89功能必须的，-268nt--195nt内有一个沉默子原件，-195nt--143nt序列能加强启动能力。然后,还分别用NSl、NS2以及NS3蛋白表达质粒与pGL3-P89质粒（都含有荧光素酶质粒）共转染，证明NSl、NS2能反式作用启动子，分别让P89上升了15.5%与69.9%。最后她用pGL质粒克隆了若干其它启动子序列，对各启动子的活性高低进行了比较。1.2.3病毒复制与拯救的研究1997年，Hayakawa等[31]，参考细小病毒的复制机制，即“滚发夹”这种引发的复制方式，使用特异性引物，用PCR来检测可能的复制中间体，但是没有扩增到相应条带，所以否定了“滚发夹”这种复制方式。2007年，韩序[32]用特异性引物，采用荧光定量技术，对BmBDV的增殖进行检测，发现VD1与VD2的比例是1:1.28。在不同抗性品系的家蚕体内，两个DNA分子都是同步复制。而且感染指数期是12-36小时，12小时之前是隐蔽期，6 江苏大学硕士学位论文36小时之后是稳定期。而在抗性较强的个体体内一直保持微量复制。2013年，张苗苗[33]对该病毒在细胞水平进行了拯救。首先将VD1和VD2的全长序列克隆在载体上，然后让两者共转染细胞，结果检测到DNA的复制和蛋白的表达，而且用VP抗体确定大部分的VP蛋白都在细胞核上。她用传代的BmN细胞分别喂食菁松和306品系的家蚕，发现两种家蚕幼虫都能感病。同时，用共转染的Sf9喂食家蚕菁松，与前者不同的是家蚕并没有被感染。2015年，司亚运等[34]把egfp序列插入到VDl-ORF2末端，VDl-ORF3内部，VD2-ORF2内部，然后用分别含有这些插入片段的病毒线性化序列转染BmN细胞，然后检测是否有DNA的复制和蛋白的表达。结果是，三者都没有看到荧光，前两个没有DNA的复制和蛋白表达，最后一个有DNA的复制以及VP蛋白表达。最后，他们还尝试用带有egfp序列的线性化病毒质粒转染哺乳动物细胞，结果也没有发现病毒DNA的复制以及蛋白表达。1.2.4家蚕对家蚕二分浓核病毒抗性的研究2007年，包方[35]用不同抗性家蚕感染BmBDV，取不同时间段的中肠组织，然后用蛋白质组学的方法，进行双向电泳，取差异点进行质谱分析，最后发现了糖基转移酶等蛋白可能与抗性相关，与日本发现的抗BmDNV-2家蚕中细胞膜蛋白的糖基化改变相似。然后对家蚕糖基转移酶进行了生物信息学分析。2007年，日本KatsuhikoIto等人[36]用图位克隆的方法在多个感性和抗性品系家蚕中找到了一个有差异的氨基酸运输蛋白基因nsd-2，该蛋白在感性家蚕中有14个外显子，而在抗性家蚕中只有5个外显子，而且经推测该跨膜蛋白可能是中肠细胞上病毒的受体。最近他们进行了病毒与nsd-2基因的表达和定位分析，结果显示在中肠后部nsd-2基因的表达高低与病毒增殖量是一致，而中肠前部与中部的情况没有充分的解释，部分证明了nsd-2蛋白是受体这个可能。从2007到2010年，李晓刚[37]也对中国家蚕的nsd-2基因进行了研究，他对不同家蚕进行了同源基因的鉴定，基因功能域分析，发现BmBDV（镇江株）的抗性和无抗性品系cDNA中的nsd-2同源编码序列，和BmBDV（山梨株）是相同的。而且RT-PCR结果显示该基因在从一到五龄都有表达，但仅仅在中肠表达。之后他用pET质粒在Rosetta菌中表达了抗性家蚕该基因，用重组杆粒在Sf9细胞中成功7 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究表达了敏感性蚕基因。1.3细小病毒与家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的研究1.3.1细小病毒NS1蛋白功能的研究细小病毒的NS1蛋白已被证实具有多种功能，它的主要作用有如下几点：参与病毒在宿主细胞内的复制；调控宿主细胞的凋亡；调控一些基因的表达。大家对于产生这些作用的具体机制，有一些研究。例如，有研究者将蟑螂细小病毒的NS1蛋白进行K401E突变后，病毒的复制明显下降，推测这是因为该突变使蛋白失去了结合ATP的能力。另外，将阿留申水貂病毒的NS1蛋白进行D227E与D285E两个位点的突变，发现NS1无法进入细胞核，病毒复制无法进行，该现象证明这两个位点的氨基酸是NS1蛋白行使功能所必需的，作者认为：这两个位点所在的肽段能被半胱天冬蛋白酶识别并切断，然后暴露核定位序列。这些现象都表明NS1蛋白参与了病毒的复制。Jurg等[38]研究发现，A9细胞系的酪蛋白激酶催化亚单位CKIIα会与细小病毒NS1蛋白结合，停止细胞CKIIα相关反应；但A9成纤维细胞表达的CKIIα没有催化能力，细小病毒不能使该细胞产生病变，这说明NS1蛋白会改变细胞内环境，产生不利于细胞的反应，使细胞凋亡。细小病毒B19的NS1蛋白在一些细胞系中表达，会上调L6与TNF-a的表达，这两种细胞因子均与炎症相关，会导致自身免疫病的产生，对生物体是有害的。Gregory和Hsu等[39]认为，当细胞被B19感染后，NS1蛋白会让线粒体生成Bax与Bad这两种死亡相关蛋白，同时caspase-3与caspase-9也会提高活性，这些因素会让细胞凋亡。Poole等[40]也同意B19的NS1蛋白参与了caspase途径，而且影响了细胞凋亡。这些都表明NS1蛋白对细胞有毒，让细胞最后凋亡，虽然这不利于病毒的复制，但可以让病毒颗粒离开原有细胞，扩散出去。Nakashima[41]的研究表明B19的NS1蛋白可以结合SP1，能提高控制P21/WAF1基因的启动子，而P21/WAF1是一种细胞依赖激酶的抑制物；NS1蛋白与SP1的结合还可以影响很多其它因子表达量高低以及它们的活性状况，NS1还能起到反式因子的作用，和病毒以及宿主细胞的启动子接触，控制一些基因的转录，NS1蛋白对细胞蛋白表达各阶段的影响和与很多细胞因子的作用被认为和它的毒性相关。8 江苏大学硕士学位论文MVMNS1蛋白可以作用于病毒衣壳蛋白的P38启动子，上调衣壳蛋白的表达，同时，MVMNS1还可以影响P4启动子，让NS1蛋白更多的表达；Vanacker[42]的研究表明，NS1可以依靠相关的激素反应元件，反式作用宿主甲状腺激素受体α的启动子，让该受体的表达提高。此外，有报道称，NS1蛋白会降低若干蛋白的表达量，而这些蛋白可能是细胞生长所必须的，这会导致细胞最后死亡。在细胞核内对NS1进行磷酸化修饰可以影响该蛋白的活性，从而调控细胞与病毒的很多代谢途径，调节一些基因的表达。1.3.2BmBDVNS1蛋白的相关研究BmBDV的NS1是由VD1-ORF2编码的一个非结构蛋白，VD1-ORF2长951nts，编码316个氨基酸。根据生物信息学分析，BmBDV的NS1与细小病毒NS1有一定的同源性，具有ATP酶，结合特定DNA序列，DNA解旋酶等活性。至今，大家对BmBDVNS1蛋白有一些初步研究。2007年，余蔚[43]将BmBDV病毒口添5龄家蚕后，在不同时间取中肠的总RNA，对NS1蛋白基因进行RT-PCR半定量检测，结果发现NS1基因在6hpi就有转录，24-48hpi期间转录水平很高，到72hpi之前都有转录，这与病毒基因组的复制是一致的。然后，他用pET-30a载体在BL21中表达了NS1蛋白，并制备了兔多克隆抗体。最后构建了含有NS1序列的vBm-NSl-EGFP重组杆状病毒，分别作用家蚕和BmN细胞，检测结果显示，融合蛋白在家蚕和BmN细胞两者中均有表达。Sun等人在2009年通过在Sf-9细胞中表达并纯化NS1蛋白，然后用比色法检测无机磷酸盐的方法检测到NS1蛋白的ATP酶的活性，用放射性DNA探针检测到NS1蛋白具有结合特定DNA序列和DNA解旋酶活性。2012年，Bao等[44]用酵母双杂交的方法[45]，发现NS1蛋白能与家蚕的丝氨酸蛋白酶Bm-SP142以及嗅觉受体Olfactoryreceptor蛋白相结合。最近，有研究者又发现NS1蛋白能与BmBDVVD1-ORF4所对应的蛋白在细胞内发生相互作用。2014年，李等[46]将pFastBacI进行改造后连接ns1基因，然后转染BmN细胞，结果看到了融合的绿色荧光，经过Westernblot检测，证明NS1蛋白有表达，9 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究实现了通过荧光观察NS1蛋白。2015年，他们还用改造过的家蚕杆状病毒表达NS1蛋白，经比较，NS1蛋白的表达量是未改造病毒的3倍。2015年，张清等用含有ns1基因的pIB－V5/His载体转染BmN细胞，经过免疫荧光发现大部分的NS1蛋白都位于细胞核位置。1.4研究的目的与意义在我国，家蚕饲养是一个重要的产业，蚕蛹能加工成为食物，蚕丝不仅是一种重要的服装材料，而且还有多种特殊用途。而家蚕二分浓核病毒（BmBDV）在很多地区严重影响家蚕生产。同时BmBDV是二分DNA病毒科,二分浓核病毒属的唯一代表种，因此对BmBDV的研究具有重要意义。有数据证实，NS1蛋白不仅有解旋酶，ATPase酶活性，还能识别并结合特异性的DNA序列。此外，李芒芒等人对NS1蛋白的磷酸化位点进行了鉴定，证明磷酸化对蛋白活性以及病毒感染后的毒性均有影响，但是没有检测NS1蛋白单独对家蚕和细胞的毒性。Bao等用酵母双杂家的方法证明在体内NS1蛋白能与家蚕的丝氨酸蛋白酶Bm-SP142相结合。还有文章用荧光蛋白标签的方法证明NS1蛋白在细胞内能与BmBDVVD1-ORF4所对应蛋白相结合。但是没有数据证明NS1蛋白能否在体外直接与丝氨酸蛋白酶Bm-SP142结合，也没有进一步的实验说明VD1-ORF4上的哪个部分所对应蛋白片段能与NS1蛋白相结合。本研究用含有GST标签的原核表达载体表达NS1蛋白，纯化回收NS1融合蛋白。然后直接测试NS1蛋白对家蚕和细胞是否有毒性。最后在体外进行pull-downassay，验证NS1蛋白在体外是否能与家蚕的丝氨酸蛋白酶Bm-SP142及BmBDVVD1-ORF4的三种部分蛋白片段直接相互作用。10 江苏大学硕士学位论文1.5研究内容及技术路线1.5.1主要研究内容（1）ns1基因的克隆及原核表达载体构建构建NS1蛋白与GST标签融合的原核表达质粒pGEX-5X-3-ns1wt。其次，为了提高NS1蛋白在大肠杆菌表达量，在ns1基因的翻译起始区TIR区中引入翻译频率较高的密码子同义突变，构建GST标签融合的重组质粒pGEX-5X-3-ns1M。另外，构建了NS1蛋白与His标签融合的重组质粒pET30a-ns1C。（2）NS1蛋白的表达与纯化重组表达质粒转化大肠杆菌（BL21菌），在不同温度下诱导pGEX-5X-3-ns1wt/BL21表达，选择出最佳温度表达pGEX-5X-3-ns1wt/BL21并纯化蛋白，表达产物经质谱鉴定。在常用温度和最佳温度下表达pGEX-5X-3-ns1wt/BL21与pGEX-5X-3-ns1C/BL21菌，并对表达量与可溶性进行比较。（3）NS1蛋白的毒性研究用纯化的NS1蛋白溶液经口添和尾部皮下注射家蚕幼虫，观察对家蚕生长发育的影响，检测NS1蛋白对家蚕是否有毒性；在家蚕卵巢细胞系BmN细胞的培养基中也添加NS1蛋白溶液，观察是否影响BmN细胞的生长与增殖。（4）NS1蛋白与其它蛋白的互作用带有His标签的NS1融合蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142进行pull-downassay；用带有GST标签的NS1融合蛋白与VD1-ORF4上三种部分蛋白片段进行pull-downassay。验证NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142及VD1-ORF4上三种部分蛋白片段在体外是否能直接相结合。11 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究1.5.2技术路线12 江苏大学硕士学位论文第二章BmBDVns1基因的克隆与原核表达载体构建本实验室曾利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功表达并纯化到BmBDVNS1蛋白，但其程序繁琐、蛋白得率低以及生产成本非常高。鉴于这些方面的考虑，我们通过原核表达载体来尝试对该基因进行表达，从而加速该蛋白生化功能方面的研究。为了获得可溶性的NS1蛋白，通过引物对扩增BmBDVns1DNA片段（ns1wt野生型的序列），选用pGEX-5X-3载体，使目的序列与该载体中GST标签进行融合表达，从而提高目的蛋白的可溶性，获得大量的有活性的BmBDVNS1蛋白。其次，文献报道：优化翻译起始区（TIR）密码子能提高靶基因的表达效率，从而增加靶基因的表达产量[47,48]。本文通过在线软件www.gcua.de对BmBDVns1前30个密码子在大肠杆菌中的使用频率进行预测，使用频率较低的几个密码子进行同义突变，从而来研究突变对该基因表达的影响。2.1材料试剂2.1.1主要材料材料来源空的TG-1菌，BL21菌，含有NS1全长序列的TG-1实验室保存菌（模板），含有pGEX-5X-3质粒的TG-1菌，含有pET30a质粒的TG-1菌简易载体pMD18-Tvector套装购自大连TAKARA公司2.1.2主要试剂试剂公司PCR所用试剂，DNAMarker，多种核酸内切酶，DNA大连TAKARA公司T4连接酶，以及它们对应Buffer酵母提取粉，蛋白胨，琼脂粉，琼脂糖Invitrogen公司13 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究2.1.3配制试剂抗生素制备抗生素保存浓度mg/ml工作浓度μg/ml溶剂保存Ampicillin100100双蒸水-20℃Kanamycin5050双蒸水-20℃LB液体培养基：2.5gNaCl，1.25gYeastextract，2.5gTryptone，用单蒸水加水至250ml，在121℃，1×105Pa条件下灭菌20min，冷却后，5℃保存。Amp/Kan抗性平板：2.5gNaCl，1.25gYeastextract，2.5gTryptone，2.5g琼脂粉，用单蒸水加水至250ml，在121℃，1×105Pa条件下灭菌20min，灭菌后，冷却至50℃左右时，在超净台中加250μl保存浓度Amp抗生素溶液，混匀，倒于培养皿平板中，最后凝固即得Amp抗性的琼脂平板，5℃保存。0.1M的CaCl2溶液：0.56gCaCl2固体磨碎后，加50ml单蒸水，过滤，在121℃，1×105Pa条件下灭菌20min，5℃保存。50×TAE缓冲液：18.6gNaEDTA.2H20，121gTris，加400ml单蒸水，最后加28.6mlCH3COOH，定容到500ml，使用前稀释50倍，保存常温即可。1%EB(溴化乙锭)：用2ml单蒸水溶解0.02gEB后，置于试验室抽屉里保存（避光）。1%琼脂糖胶：取0.5g琼脂糖，加50ml1×TAE缓冲液，然后加热，直至溶液澄清时停止加热，当溶液降至50~60℃，加入一滴1%EB并混匀，然后按需要倒入有较宽或较细梳子（分别对应大孔胶和小孔胶）的琼脂糖胶槽中，冷却凝固后即可使用。2.1.4实验仪器GMD型高温高压灭菌锅，HGD426烘干箱，F40MB雪花自动制冰机，超净工作台，640-DYY电泳仪，GLM紫外扫描仪，PCR仪。14 江苏大学硕士学位论文2.2实验方法2.2.1引物设计根据我们的实验需要，一共设计了3条正向引物和2条反向引物，它们都是根据ns1序列设计的：引物PCR产物长度与命名ns1wt-F:CGGAATTCCATGGAATCGAAGTCAAATTT与ns11-R扩增一条950CCGTATACTATCA（EcoRI）bp左右的ns1wt片段ns1M-F:CGGAATTCCATGGAATCAAAATCAAATTTC与ns11-R扩增一条950CGTATCCTGTCA（EcoRI）bp左右的ns1M片段ns11-R:CCCTCGAGCTACCCATAATATTTATTATATACGTTTACAAAATT（XhoI）ns13-F:ATGGATCCATGGAATCGAAGTCAAATTT与ns13-R扩增一条950(BamHI)bp左右的ns1C片段ns13-R:AACTCGAGCTACCCATAATATTTATTATATACGT（XhoI）引物均由上海生工生物公司合成，按照说明书要求加入双蒸水后在-20℃条件下保存。2.2.2ns1片段的PCR(1)PCR模板（template）都是相同的，为含有NS1全长序列的TG-1菌。ns1wt片段的PrimerF与PrimerR分别为ns1wt-F与ns11-R；ns1M片段的PrimerF与PrimerR分别为ns1M-F与ns11-R;ns1C片段的PrimerF与PrimerR分别为ns13-F与ns13-R。15 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究PCR体系(20μl)为：PCR扩增各成分体积μl10×PCRBuffer22.5mMdNTP1.6PrimerF0.2PrimerR0.2Template1rTaqDNApolymerase0.5ddH2O:14.5PCR的程序：ns1wt片段与ns1M片段程序：1，94℃4min；2，94℃40s；3，56℃40s；4，721min；5，goto234次；6，72℃10min；7，12℃保存。ns1C片段程序:1，94℃4min；2，94℃40s；3，54℃40s；4，721min；5，goto234次；6，72℃10min；7，12℃保存。用常用的小EB管将3种片段的PCR体系分别配制2份，然后在PCR仪中按照对应的程序进行PCR反应。PCR反应结束后，再分别将反应产物全部在1%的琼脂糖大孔胶中进行电泳，电泳的电压为110V左右。在电泳30min后，用紫外光照射，采集图片并将3种片段的电泳DNA条带分别切胶。(2)将切下的含有DNA条带的琼脂糖胶用胶回收试剂盒进行回收，步骤按照说明书进行。回收后将3种片段的回收产物分别取3μl在1%的琼脂糖小孔胶中进行电泳验证，电泳的电压为110V左右，电泳30min后，用紫外光照射并采集图片。16 江苏大学硕士学位论文2.2.3将ns1片段与pMD-18T载体连接连接原理：我们PCR所使用的DNA聚合酶是TAKARA公司的rTaq酶。该，酶在合成结束时会在DNA链的3末端加上若干的碱基A，而pMD-18T载体的两个末端都有伸出的T碱基，这样刚好配对。在配套的溶液中，这两个片段会迅速的连接起来，成为一个环形片段。由于连接原理是通用的，在这里我们详细的解释ns1wt片段与pMD-18T载体的连接。其它两种片段的分析和操作步骤都是一样的。(1)根据片段回收后验证图片中DNA片段1与DNAmarker中大小相当条带（1000bp）亮度的比较（使用计算机上的相应软件进行计算），计算出每μl的ns1wt片段回收溶液中片段1的摩尔数。pMD-18T载体按照说明书取0.5μl，然后目的片段与pMD-18T载体片段数按照5~15:1的比例取适量含有ns1wt片段溶液，对应的其它溶液使用量按照说明书操作。条带ns1wt片段的连接体系（10μl）如下：连接各成分体积μlSolution15ns1wt片段溶液3ddH2O1.5pMD-18T载体0.5在小EB管中配制好10μl的连接混合液后，用10μl量程的移液枪将溶液混匀，然后将小EB管放入16℃的连接仪中过夜连接（连接时间为12h~24h）。(2)ns1M片段与ns1C片段分别和pMD-18T载体连接步骤同上。2.2.4转化以及验证17 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究将连接好的产物转化TG-1感受态大肠杆菌，然后取适量完成转化的TG-1大肠杆菌均匀涂于Amp抗性的平板，之后将平板置于37℃的培养箱中。12h到15h后取出平板，挑选合适的菌斑进行培养，培养4h左右后以菌液为模板进行PCR验证，挑选出能扩增到对应条带的菌液进行转接，提质粒，然后进行双酶切验证。三种连接产物的转化、涂板和验证原理是一样的，这里只讲述ns1wt片段与pMD-18T载体连接产物的转化和涂板，以及验证。(1)TG-1感受态大肠杆菌的制备：将获得的TG-1大肠杆菌进行转接活化，4小时后再转接一次，然后37℃过夜培养。第二天根据需要转接若干支，每支试管中加LB培养基3ml，TG-1大肠杆菌菌液40μl，在37℃的摇床中培养（如无特殊说明，摇床转速均为214rpm）。培养至菌液OD值为0.5~0.7之间时，将试管取出，将TG-1菌液分装于1.5ml规格的EB管中。每个EB管中分装1ml菌液，然后依次进行如下操作（1）将含有TG-1菌液的EB管在冰中冰浴30min，（2）以10000rpm离心1min，弃上清，（3）加200μl浓度为0.1M的CaCl2溶液悬浮TG-1菌体，冰浴15min，（4）以10000rpm离心1min，弃上清，（5）再用200μl浓度为0.1M的CaCl2溶液悬浮TG-1菌体，冰浴5min。即得感受态的TG-1大肠杆菌，感受态TG-1大肠杆菌现制现用。(2)将ns1wt片段和pMD-18T载体的连接产物（命名为pMD-18T-ns1wt）加入到制备好的感受态TG-1大肠杆菌中，混合均匀之后依次进行如下操作，（1）冰浴30min，（2）在42℃水中水浴热激90s，（3）冰浴5min，（4）在超净台中加800μl的LB培养基，在37℃的摇床中培养1h，（5）10000rpm离心1min，（6）在超净台中中吸走无菌的800μl上清培养基，将剩余的200μl上清与菌体沉淀混匀，取适量（40μl~80μl）悬浮液涂在Amp抗性的LB平板上，（7）将平板置于37℃培养箱中过夜培养（一般培养12h~15h）。(3)过夜培养长出白色菌斑后，在超净台里面挑4到8个菌斑在含有Amp抗生素（试管培养基里添加1‰体积工作浓度的Amp）的培养基（无特殊说明，试管培养基体积都为3ml）里进一步培养。在37℃的摇床里面培养4h左右后，取菌液进行PCR验证。PCR反应的体系和程序均对应ns1wt片段原来的体系与程18 江苏大学硕士学位论文序。将PCR结束后的产物分别取3μl，加DNALoadingBuffer后进行电泳和紫外照射。从中挑选能扩增出950bp左右大小条带即目的条带的若干菌进行转接。第二天用质粒提取试剂盒从转接的菌中分别提取质粒，具体操作按试剂盒说明书。将所有提取的质粒都取3μl进行电泳，确定有质粒后，取适量含有质粒的溶液用对应的两个内切酶进行双酶切验证。每个菌株都进行10μl酶切验证，酶切体系（10μl）如下：酶切各成分体积μlEcoRI0.5XhoI0.510×HBuffer1ddH2O4质粒（pMD-18T-ns1wt）4在小EB管中配好酶切反应溶液后混匀，在37℃水浴锅中反应4h，然后进行处理和电泳，电泳产生两个条带，一个为950bp左右，另一个为2800bp左右（pMD-18T载体的大小），即该质粒所在的菌株就是连上pMD-18T载体的目的菌株。(4)ns1M片段与pMD-18T载体连接产物（命名为pMD-18T-ns1M）的转化和涂板，以及验证的方法都同上，PCR验证时用ns1M的引物对。(5)ns1C片段与pMD-18T载体连接产物（命名为pMD-18T-ns1C）的转化和涂板，以及PCR验证的方法也都同上，PCR验证时用ns1C的引物对和该引物对所对应的程序，酶切验证时用的体系不同，19 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究pMD-18T-ns1C质粒的酶切验证使用体系(10μl)为：酶切各成分体积μlBamHI0.5XhoI0.510×HBuffer1ddH2O4质粒（pMD-18T-ns1C）4其它步骤的方法同ns1wt片段。2.2.5目的条带ns1与表达质粒的连接要将pMD-18T-ns1wt，pMD-18T-ns1M上的两种ns1片段用EcoRI和XhoI切下并分别回收（小片段，950bp左右），然后同样用EcoRI和XhoI酶双酶切它们所要连接的表达载体pGEX-5X-3并回收大片段（5000bp左右）。将酶切回收的两种950bp左右的片段分别连接上pGEX-5X-3酶切回收后的大片段。要将pMD-18T-ns1C上的ns1片段用BamHI和XhoI切下并将两个小片段（由于ns1基因有一个BamHI酶切位点，这样ns1C被分为680bp与270bp左右的两个片段，相加为950bp左右）回收到一起，然后同样用BamHI和XhoI酶双酶切要连接的表达载体pET30a并回收大片段（5400bp左右）。将酶切回收后的两个小片段一起连接上pET30a酶切回收后的大片段。(1)pMD-18T-ns1wt与pMD-18T-ns1M的操作一样，这里只描述pMD-18T-ns1wt的操作。将分别含有pMD-18T-ns1wt和pGEX-5X-3质粒的TG-1大肠杆菌充分活化后，各转接一支并在37℃过夜培养（培养15h左右），第二天分别提质粒并电泳验证是否有质粒，在验证后分别在小EB管里进行40μl体系的酶切。20 江苏大学硕士学位论文2个酶切体系（40μl）如下：酶切各成分体积μlEcoRI2XhoI210×HBuffer4ddH2O12质粒pMD-18T-ns1wt/质粒pGEX-5X-320在37℃水浴锅里反应4h，然后在大孔琼脂糖胶中进行电泳。电泳约30min后，紫外线照胶，采集图片并切胶，质粒pMD-18T-ns1wt体系中收集较小片段（950bp左右），质粒pGEX-5X-3体系中收集大片段（5000bp左右）。切胶后分别回收，回收按照所用试剂盒的说明书操作。回收后，分别取3μl，加DNALoadingBuffer后进行电泳，验证是否分别回收到两条目的条带以及估算条带回收的浓度。(2)在验证有目的条带后，按照估算的条带浓度，我们用10μl体系进行酶连反应。体系（10μl）如下：酶连各成分体积μlpGEX-5X-3片段2ns1wt片段410×T4DNAligaseBuffer1T4DNAligase0.8ddH2O2.221 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究配好溶液后，在16℃的连接仪上过夜连接（12h~24h之间）。(3)pMD-18T-ns1M质粒的处理与pMD-18T-ns1wt一样，也与酶切回收后的pGEX-5X-3片段连接。(4)将分别含有pMD-18T-ns1C和pET30a质粒的TG-1大肠杆菌充分活化后，也转接，分别提质粒，然后进行酶切。体系为：酶切各成分体积μlBamHI2XhoI210×HBuffer4ddH2O12质粒pMD-18T-ns1C/质粒pET30a20在37℃水浴锅里反应4h，然后跑大孔胶，回收pMD-18T-ns1C体系中的两个小片段（相加为950bp左右），回收pET30a体系中的大片段（5400bp左右）。将回收后的片段跑电泳，然后根据亮度估算出条带浓度，从而确定酶连各组分体积。酶连体系（10μl）为：酶连各成分体积μlpET30a片段2ns1C片段（两个小片段）410×T4DNAligaseBuffer1T4DNAligase0.8ddH2O2.2配好溶液后，也在16℃的连接仪上过夜连接（12h~24h之间）。22 江苏大学硕士学位论文2.2.6再次转化和验证连接反应进行到合适的时间后，分别将连接产物转化感受态的TG-1大肠杆菌。因为pGEX-5X-3质粒是Amp抗性载体，pET30a质粒是具有Kan抗性的载体，我将ns1wt和ns1M分别与pGEX-5X-3载体连接（连接产物分别命名为pGEX-5X-3-ns1wt与pGEX-5X-3-ns1M），转化TG-1大肠杆菌后涂在Amp抗性平板上，将ns1C与pET30a载体连接（连接产物命名为pET30a-ns1C），转化TG-1大肠杆菌后涂在Kan抗性平板上。然后将平板放置到37℃的培养箱中培养，培养到合适的时间后，进行挑斑培养，之后依次经过PCR验证和双酶切验证。转化，涂板以及后来的挑斑培养，PCR验证，双酶切验证的原理与2.2.4中的原理相同，PCR和酶切分别用各自对应的引物和限制性内切酶。具体步骤请参考2.2.4中的描述。2.2.7重组质粒转化E.coliBL21菌将经过PCR和双酶切验证通过的pGEX-5X-3-ns1wt和pGEX-5X-3-ns1M质粒以及空质粒pGEX-5X-3转化BL21表达菌，用以进行表达与GST标签融合的NS1蛋白。将同样通过验证的pET30a-ns1C质粒以及空质粒pET30a也转化BL21表达菌，为pull-downassay作准备。2.2.6中最后提取的质粒，每株都有有一部分用来进行双酶切验证，经过双酶切验证正确的质粒，用它们所对应的剩余完整的环形质粒pGEX-5X-3-ns1wt，pGEX-5X-3-ns1M和pET30a-ns1C以及2.3.5中完整的pGEX-5X-3和pET30a转化表达菌BL21的感受态菌。(1)BL21菌的感受态与TG1菌的感受态制备方法一样，只有菌不同。(2)转化方法与前面所介绍的转化克隆菌方法一样。pGEX-5X-3-ns1wt和pGEX-5X-3-ns1M质粒以及pGEX-5X-3质粒转化BL21完成后取适量菌液分别涂布在含有Amp抗生素的琼脂平板上。pET30a-ns1C质粒以及pET30a质粒转化BL21完成后取适量菌液分别涂布在含23 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究有Kan抗生素的琼脂平板上。转化，涂板后再37℃培养箱中培养13h左右以后，从上述五种质粒分别所对应的平板上各挑3个菌斑进行培养。因为所转化的质粒是从克隆菌中提取的没有进过酶切的完整质粒，效率很高，所以这一次的菌斑可以直接用于试验，无需再次验证。2.3结果与分析2.3.1获得ns1序列1BmBDVns1序列及ns1M的引物设计的分析BmBDVns1基因全长为951bp，编码一个序列为316个氨基酸的蛋白，其理论分子量为36.5kDa（图2.1）。利用在线软件Netphos2.0software(http://www.expasy.ch)对该蛋白序列进行磷酸化预测，结果表明BmBDVNS1氨基酸序列上有多个磷酸化修饰位点。利用在线软件SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对BmBDVNS1氨基酸序列进行入核信号肽预测，结果表明该序列中没有典型的入核信号，通过Editseq软件对BmBDVNS1前100个氨基酸进行分析，发现该区域富含碱性氨基酸，其等电点为9.97，推测与该蛋白入核活性有关。除此之外，BmBDVns1理论序列中还存一些特异DNA序列和目的蛋白相互作用的位点，这些位点对该蛋白的功能有何作用目前未知，还有待于对该蛋白的功能及其作用机制进行进一步研究。24 江苏大学硕士学位论文图2.1BmBDVns1的基因序列与对应氨基酸序列Fig2.1ThesequenceofBmBDVns1andthededucedaminoacidsequence通过在线软件www.gcua.de对BmBDVns1序列在大肠杆菌中的密码子使用频率进行分析，结果如图2.2A显示：BmBDVns1基因中第三个密码子TCG的使用频率为55%，第四个密码子AAG的使用频率为41%，第九个密码子ATA的使用频率为45%，第十个密码子CTA的使用频率分别为16%，推测这些低使用频率的密码子限制了BmBDVns1基因在大肠杆菌中的高效率表达，从而降低了靶基因的表达产量。基于上述因素的考虑，本研究拟对将这四个低频率使用密码子分别进行同义突变，使其突变后的密码子变为TCA、AAA、ATC和CTG后，这些密码子在大肠杆菌中的使用频率变为90%、100%、66%和100%（如图2.2B所示），将同义突变后的BmBDVns1序列引入原核表达载体，从而希望能够该基因的表达量，为其功能的深入研究打下基础。25 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究图2.2BmBDVns1基因翻译起始区突变前后的密码子使用频率对比Fig2.2CompareofcodonusagefrequencyofBmBDVns1A:野生型ns1基因翻译起始区前15个密码子的使用频率分析；B:改造后的BmBDVns1基因翻译起始区前15个密码子的使用频率预测。红色方框内为改造前和改造后后的密码子。2三种片段的PCR扩增通过PrimerPremier5软件，设计三对不同的引物，分别通过ns1wt-F与ns11-R、ns1M-F与ns11-R及ns13-F与ns13-R三对不同的引物对扩增BmBDV基因组，通过切胶回收试剂盒分别对扩增产物进行切胶回收，对回收后的目的DNA片段进行电泳分析（如图2.3所示），从而将回收产物分别与pMD-18T载体相连进行连接，从而获得重组质粒。26 江苏大学硕士学位论文图2.3PCR扩增三种ns1片段的DNA电泳分析Fig2.3ElectrophoresisanalysisofthreetargetfragmentsusingdifferentprimerpairM:DNA标准分子;1：扩增的ns1wt片段;2：扩增的ns1M片段;3：扩增的ns1C片段3三种片段分别与pMD-18T连接的验证分别抽提重组质粒pMD18T-ns1M、pMD-18T-ns1wt和pMD-18T-ns1C，对它们分别进行EcoRI/XhoI和BamHI/XhoI双酶切，将酶切后的产物进行DNA凝胶电泳分析，结果表明：BmBDVns1基因野生型ns1wt、翻译起始区突变的ns1M片段以及ns1C片段都与pMD18T发生连接（如图2.4所示）。图2.4载体pMD-18T-ns1wt，pMD-18T-ns1M，pMD-18T-ns1C双酶切验证Fig2.4RestrictionanalysisofthevectorsofpMD-18T-ns1wt，pMD-18T-ns1MandpMD-18T-ns1CM:DNA标准分子;1:pMD-18T-ns1wt的PCR验证;2：pMD-18T-ns1wt的双酶切验证;3：pMD-18T-ns1M的PCR验证;4：pMD-18T-ns1M的双酶切验证;5:pMD-18T-ns1C的PCR验证6：pMD-18T-ns1C的双酶切验证27 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究2.3.2三种片段分别与表达载体连接的验证将ns1wt，ns1M，ns1C分别从pMD-18T-ns1wt，pMD-18T-ns1M和pMD-18T-ns1C上进行双酶切回收，得到带有粘性末端的ns1片段。将pGEX-5X-3和pET30a也进行相应的酶切，然后将ns1wt，ns1M片段连接到pGEX-5X-3上，将ns1C片段连接到pET30a上。再次经过转化，涂板，挑斑培养以及PCR和双酶切验证，如图2.5。由于pET30a-ns1C中的ns1序列含有BamHI酶切位点，ns1酶切时被分为两个片段，如果较大片段丢失或顺序颠倒，则PCR验证时无法扩增到950bp大小的片段，故ns1C的两部分与pET30a是按正确顺序连接的。图2.5载体pGEX-5X-3-ns1wt，pGEX-5X-3-ns1M，pET30a-ns1C双酶切验证Fig2.5RestrictionanalysisofthevectorsofpGEX-5X-3-ns1wt，pGEX-5X-3-ns1MandpET30a-ns1CM:DNA标准分子;1:pGEX-5X-3-ns1wt的PCR验证;2：pGEX-5X-3-ns1wt的双酶切验证;3：pGEX-5X-3-ns1M的PCR验证;4：pGEX-5X-3-ns1M的双酶切验证;5:pET30a-ns1C的PCR验证;6：pET30a-ns1C的双酶切验证2.3.3重组质粒转化E.coliBL21菌三种含有ns1序列的质粒pGEX-5X-3-ns1wt，pGEX-5X-3-ns1M与pET30a-ns1C转化BL21菌后，都长出白斑，分别挑斑培养，分别命名为28 江苏大学硕士学位论文pGEX-5X-3-ns1wt/BL21，pGEX-5X-3-ns1M/BL21与pET30a-ns1C/BL21菌。两种对照质粒pGEX-5X-3，pET30a转化BL21菌后，也长出白斑，也分别挑斑培养，分别命名为pGEX-5X-3/BL21与pET30a-ns1C/BL21菌。2.4讨论生物工程中常用的四种表达系统分别是原核表达系统，哺乳动物表达系统，酵母表达系统以及杆状病毒-昆虫细胞表达系统。其中最廉价和最便于操作的表达系统就是原核表达系统。我们在获得所需要的重组质粒时用的是最常用的TG-1克隆菌，最后转化到的表达菌BL21也是最常见的表达菌。有数据显示，GST标签能提高目的蛋白在缓冲液中的溶解度，为了能大量纯化目的蛋白，我们选择了含有GST标签的pGEX-5X-3质粒来与BmBDVns1基因来融合表达，希望能获得可溶性的BmBDVNS1蛋白。有研究报道：基因翻译起始区(TIR)的密码子的偏好性与mRNA的二级结构对蛋白的表达量有一定的影响，翻译起始区的优化能提高目的基因的表达效率，从而显著目的蛋白的表达产量，因此，我们构建的ns1M序列相对于原有的ns1wt序列在TIR上有4个位点的同意突变，这些突变密码子在大肠杆菌中被使用频率都有明显上升，希望能提高蛋白的表达水平。由于在引物设计时的忽略，ns1C的上游引物所对应的限制性内切酶BamHI在ns1下半部分有一个酶切位点，将ns1分为大约680bp与270bp的两个片段。幸运的是，将约680bp与270bp大小的两个片段同时回收，再同时与表达载体pET30a相连后，通过PCR与酶切筛选，我们找到了按照正确顺序连接的完整的pET30a-ns1C质粒。从这次意外中，我们发现，以后设计引物考虑酶切位点时，如有必要可以使序列内部出现一次所选内切酶的识别序列，只要验证时能通过PCR扩增出全长序列，酶切验证能看到被切成两部分的目的片段就能筛选到正确完整的重组质粒。不过，还有一个缺点，那就是得同时挑很多菌斑进行筛选，增加了后续的实验强度。29 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究第三章BmBDVNS1蛋白的表达及纯化研究报道：低温诱导有利于提高目的蛋白的可溶性，但会降低其表达产量；高温诱导又容易使表达出来的蛋白形成包涵体[49]。为此，本章通过对转化有重组质粒pGEX-5X-3-ns1wt的BL21菌在不同温度下进行诱导，从而对其可溶性表达及其产量进行分析，找出融合有GST的BmBDVNS1目的蛋白最佳的诱导温度；利用GST磁珠对目的蛋白进行纯化，对纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和质谱鉴定，为深入研究其生物活性打下基础。3.1材料试剂3.1.1主要材料材料公司硝化纤维素膜PVDF膜购自Miliproe公司琼脂糖亲和层析凝胶（GST凝胶）购自Invitrogen公司其它同上一章同上一章3.1.2主要试剂试剂公司蛋白预染Marker，小分子MarkerTAKARA公司IPTG，蛋白酶抑制剂PMSF，丙烯酰胺凝胶配制相关Invitrogen公司试剂，小鼠抗GST单抗（一抗），山羊抗小鼠辣根过氧化物酶抗体（二抗）增强化学发光法（ECL）显色试剂盒碧云天科技有限公司其它同上一章同上一章3.1.3配制试剂30 江苏大学硕士学位论文大肠杆菌裂解液：先配置好1M的Tris-HCl，5M的NaCl，0.5M的EDTA三种母液。然后三种母液依次分别取5ml，6ml，400μl，置于200ml容量瓶，用单蒸水定容至200ml，最后加1mlTritonX-100，之后在121℃，1×105Pa条件下灭菌20min，冷却后5℃保存。Washbuffer：母液同上，别取5ml1M的Tris-HCl，6ml5M的NaCl，400μl0.5M的EDTA，置于200ml容量瓶，用单蒸水定容至200ml，之后在121℃，1×105Pa条件下灭菌20min，冷却后5℃保存。Elutionbuffer：取0.303gTris，0.154g还原型谷胱甘肽，置于小烧杯，加40ml左右单蒸水，溶解后用HCl将PH调制8.0，最后倒入用50ml容量瓶，用单蒸水定容至50ml，5℃保存。5×proteinloading：加5ml1M的Tris-HCl（PH值为6.8），0.1gBPB,10ml甘油，2gSDS于小烧杯，用单蒸水定容至20ml，混匀后5℃保存，使用前，每1ml加50μlβ-巯基乙醇。10×SDS-PAGE电泳缓冲液：取15.1gTris，94gGlycine，5gSDS置于烧杯中，加入约350ml单蒸水溶解，然后定容至500ml，常温保存，使用时，取100ml，定容至1L即可。Westernblot转膜缓冲液：取5.8gTris，2.9gGlycine，0.37gSDS置于烧杯中，然后加单蒸水500ml溶解，再加入200ml甲醇，最后用单蒸水定容至1L，即可室温保存。考马斯亮蓝R-250染色液：取0.5g考马斯亮蓝R-250，125ml异丙醇，50ml冰醋酸置于烧杯中，加325ml单蒸水，溶解充分后过滤，常温保存溶液，备用。TBST溶液：在烧杯中加17.6gNaCl，40ml的1MTris-HCl（pH8.0），1mlTween20，500ml单蒸水，充分溶解后，加单蒸水至总体积2L，常温保存。5%奶粉封闭液：取5g脱脂奶粉溶解于100mlTBST溶液中，置于4℃冷藏3.1.4实验仪器低温离心机，聚丙烯酰氨凝胶电泳电泳仪，200-Ts脱色摇床，Rad-Bio转膜仪，ECL显色仪，布鲁克质谱仪，其它仪器同上一章。31 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究3.2实验方法3.2.1寻找最佳诱导表达温度首先，进行初步试验验证，含有pGEX-5X-3-ns1wt质粒的BL21菌在IPTG诱导表达后相比较只含有pGEX-5X-3质粒的BL21菌在SDS-PAGE图上多表达了一条60kDa左右的蛋白，之后再经过GST单抗进行Westernblot验证，能显示出该60kDa左右的蛋白条带。因为我们的目的是为了获得纯化的融合蛋白，以用来进行毒性研究。所以在经过初步试验验证能表达之后，要选择合适的诱导条件，使目的蛋白能大量表达，并能适当地溶解在超声裂解后的上清裂解液中，以用来进行纯化。(1)1‰体积工作浓度的IPTG就能起到不错的诱导效果，这里只进行诱导温度的摸索，首先准备好4个250ml锥形瓶，分别配置100ml的LB培养基并灭菌，然后各添加适量体积的Amp抗生素。然后再准备一只试管，添加3ml灭菌过的LB培养基，也加入Amp抗生素。然后在4个锥形瓶中各添加1ml充分活化的含有pGEX-5X-3-ns1wt质粒的BL21菌，在试管中添加40μl也充分活化的含有pGEX-5X-3质粒的BL21菌（用于对照）。将接种过的锥形瓶和试管一起置于37℃的摇床中摇动培养。当锥形瓶中的目的菌浓度在OD600=0.6左右时（一般培养3h左右，浓度比较合适），在4个锥形瓶中各添加合适体积的IPTG，然后将4个锥形瓶分别编号为1、2、3、4号，依次分别置于16℃、20℃、28℃、37℃4种温度的摇床中进行培养。培养有对照菌（含有pGEX-5X-3质粒的BL21菌）的试管不添加IPTG一直在37℃条件下摇动培养。在所有菌的浓度达到一个合适浓度后（时间为加IPTG后12h左右）收集菌体。1、2、3、4号锥形瓶以及试管里面的BL21菌均在4℃的冷冻离心机里面以8000rpm的转速离心10min，分别收集菌体，对照菌也离心收集菌体。(2)菌体收集完毕后，倒掉棕色的透明上清培养基，然后用移液枪将倒不掉的剩余培养基吸走，保留菌体。因为1、2、3、4号菌是为了纯化融合的目的蛋白，所以需要超声裂解获得可溶性上清，而试管中的菌仅仅是为了作为没有目的蛋白的对照，没有必要进行裂解而获得上清。我们在1、2、3、4号收集菌所在的容器中分别均添加8ml的大肠杆菌裂解液，用1000μl量程的移液枪击打均匀，32 江苏大学硕士学位论文再分别倒入直径1cm左右，最大容积为12ml的塑料离心管中，分别加入50μl工作浓度(0.1mol/L)的PMSF(防止目的蛋白被分解)。然后依次在超声破碎仪上超声裂解（样品管置于冰盒中），破碎仪的最大功率设置为200W，间隔时间为1~2s，每超声10次，停止4~5s（防止发热太严重而加速蛋白的分解），裂解至混合菌液刚刚有一点透明状即可（超声时间范围为50min~1h10min，1、2、3、4号菌分别裂解前均需要用单蒸水将破碎仪伸入溶液的部分冲洗干净，防止互相污染）。将裂解好的全部菌液从12ml离心管倒入与冷冻离心机相匹配的离心管，在冷冻离心机中4℃条件下，以8000rpm的速度离心1h，分别收集裂解上清和裂解后的沉淀。(3)在对照菌体中加80μl双蒸水，再加入20μl5×proteinloading，将1、2、3、4号菌的裂解上清分别取80μl，加入20μl5×proteinloading。1、2、3、4号菌的裂解沉淀分别用2ml的裂解液混匀，分别取80μl，加入20μl5×proteinloading。将这9个加了proteinloading的少量样品分别用移液枪吹打均匀，然后在沸水中煮10min，之后以13000rpm的转速离心10min(4个裂解上清的样品可以离心，也可不用离心)，上层蓝紫色透明液体即是可用于SDS-PAGE的样品。将所有样品跑两块10孔1mm厚度的SDS-PAGE胶，蛋白marker上样量为5μl，其它蛋白样品的上样量为每孔10μl。一块用于考马斯亮蓝染色，一块转PVDF膜用于Westernblot试验。(4)首先按照常用配方表配置12%的聚丙烯酰胺下层分离胶胶混合液10ml，然后用量程为1ml移液枪将击打均匀的混合液加入到两个塑料架上的玻璃板中，加到距离玻璃薄板上沿1.5cm处即可，将剩余混合液倒掉。等待约25min，下层分离胶就凝固了，接下来制上层浓缩胶。同样，按照说明书配制6ml的5%聚丙烯酰胺上层浓缩胶混合液，将混合液混合均匀后，加到玻璃板中，加至刚刚溢出即可，之后用1mm配套梳子插入玻璃板中。再等约25min，上层凝胶凝固即可。(5)将两块做好凝胶的玻璃板按说明放入SDS-PAGE槽中，加1×SDS-PAGE电泳缓冲液至刚刚淹没玻璃板上沿，然后上完样品，盖上电泳盖，插上电源，进行电泳，首先用80V电压保持30min，然后改为120V电压进行电泳，直至proteinloading的颜色刚跑出凝胶下沿即可停止电泳。(6)电泳结束后的凝胶，其中一块直接用考马斯亮蓝溶液进行染色，染色2h33 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究后用SDS-PAGE脱色液脱色。染色与脱色都是在常温摇床上进行。脱色充分后，将SDS-PAGE胶在扫描以上扫描采集图片。另外一块进行转膜，按照说明在两块海绵中从连接电源负极的那一侧依次夹上两层滤纸，凝胶，被甲醇激活的PVDF膜，两层滤纸。然后置于转膜槽中，加满转膜缓冲液，以250mA转膜1h。转膜结束后，用能将膜完全浸泡的5%奶粉封闭液在4℃下过夜封闭（12h左右）。封闭结束后，将1μl抗GST的小鼠单抗（一抗）溶解于3ml的5%奶粉封闭液中，混匀后与封闭过的膜一起封在一个小塑料袋中（保证混合液与膜的各个地方都充分接触），在摇床上孵育。孵育2h后，取出膜，用TBST溶液完全浸泡，在摇床上洗8min，重复4到5次，每次换新的TBST缓冲液，将没有与目的蛋白的抗体洗掉。洗完后，孵山羊抗小鼠辣根过氧化物酶抗体（二抗），将二抗取1μl溶解于5%的脱脂奶粉溶液（2ml~10ml）中，与PVDF膜封在塑料中孵育（方法同孵育一抗相同，）。孵育2h后，取出膜，用TBST溶液洗掉没有与一抗结合的二抗，方法与洗掉多余一抗的方法相同。洗掉多余的二抗后，用增强化学发光法（ECL）显色[50]。使用ECL试剂盒，按照说明书，将A液与B液各取150μl，混合均匀（现用现配）。用200μl量程移液枪将混合液均匀涂在PVDF膜上各个泳道所对应的地方。然后迅速将PVDF膜置于对应的ECL显色仪器中曝光显色，选择合适长度的曝光时间，然后采集图片。(7)根据SDS-PAGE胶的扫描图和Westernblot的ECL图判断融合蛋白的最佳诱导温度（所尝试的4种诱导温度中的其中一个）。3.2.2翻译起始区（TIR）内同义突变对表达的影响(1)准备好4个分别含有100ml培养基的锥形瓶。4个锥形瓶分别编号A，B，C，D，灭菌后，A和B分别接种活化后的1mlpGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌，C和D分别接种活化后的1mlpGEX-5X-3-ns1M/BL21菌。当菌培养到合适的浓度后，加入适量的IPTG。将加入IPTG的A和C都在37℃的摇床上培养，B和D都在20℃（由3.2.1所得到的最佳温度）的摇床上培养。培养合适时间后，分别收集菌体和裂解、离心，获得A、B、C、D菌的上清和沉淀。然后跑4块SDS-PAGE34 江苏大学硕士学位论文胶，第1、2两块跑A菌与C菌的上清与沉淀。第3、4两块跑B菌与D菌的上清与沉淀。跑完SDS-PAGE后，第1、3两块胶均用考马斯亮蓝溶液染色，然后用脱色液脱色。第2、4两块胶均转PVDF膜，用相对应的抗体孵育，然后用对应试剂盒显色。方法参照3.2.1。(2)然后根据两块SDS-PAGE图和两块Westernblot图分析NS1蛋白基因TIR内同义突变相对于wt型在常用温度（37℃）和最佳温度（20℃）下对融合的目的蛋白表达产量和可溶性的影响。3.2.3蛋白的纯化(1)同3.2.1，在最佳温度（20℃）条件下用100ml培养基诱导pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌表达NS1蛋白。然后收集菌体，裂解，离心，对上清与沉淀进行SDS-PAGE和Westernblot试验，在验证到裂解上清溶液中含有GST标签的融合蛋白后进行下面的操作。(2)用Washbuffer洗涤平衡过滤柱，一般洗4次左右，每次取1.5mlWashbuffer淹没柱子里的过滤膜，3min后让液体从下端流尽。柱子平衡后，取适量保存在70%乙醇中的谷胱甘肽琼脂糖亲和层析凝胶(GST凝胶)，置于过滤柱中。同样用适量的Washbuffer洗涤平衡GST凝胶3到4次，每次用Washbuffer浸泡GST凝胶2分钟，然后打开下面的盖子，让Washbuffer流尽。最后一次时，保留Washbuffer，用移液枪将液体和泡在其中的GST凝胶一起转移到pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌裂解离心后的上清中，重新用少量Washbuffer浸泡过滤柱的膜以保持其湿润。将含有GST凝胶的细菌裂解液上清倒入一个合适的塑料管中并混合均匀，将塑料管安装到4℃冰箱中的旋转孵化器上，孵化器以15rpm的速度旋转过夜（旋转时间为12~24h之间），让目的融合蛋白与GST凝胶充分结合。旋转孵育结束后，将含有GST凝胶的混合液倒入过滤柱中，让液体从下端流出并回收，GST凝胶在滤纸的作用下被挡住了。GST凝胶上除了结合有目的融合蛋白以外还有很多很多其它蛋白的非特异性结合。然后用Washbuffer洗凝胶以去除杂蛋白，取1.5mlWashbuffer浸泡过滤柱中的凝胶2min，然后让Washbuffer从下端流出，重复清洗13次左右，每次都用新的Washbuffer，收集第一次和最后一次流出的Washbuffer以用来进行过程分析。在Washbuffer清洗结束并完全流35 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究尽后，用准备好的Elutionbuffer对目的蛋白进行回收，取500μlElutionbuffer淹没住柱子中的GST凝胶3min，之后让Elutionbuffer从下端完全流出并回收，重复回收5次以上，每次都用新的Elutionbuffer。回收结束后，用1到2ml的70%的乙醇溶液浸泡洗涤柱子中的GST凝胶和过滤膜，每次4min，重复4到5次。然后将悬浮在70%乙醇中的GST凝胶转移到EB管中，以备下次使用（用过的GST凝胶下次只能用来纯化相同的蛋白）。用70%的乙醇淹没住柱子中的过滤膜，以备下次使用。(3)将回收的相关溶液制备成样品后跑SDS-PAGE。(4)为了进一步比较分析TIR内同义突变对纯化的影响，我们用pGEX-5X-3-ns1M/BL21菌进行了相同的表达和纯化，方法同pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌，然后也按照相同的顺序跑了SDS-PAGE。(5)为了为下一章的蛋白毒性研究提供一个用来比较的参照，我们对pGEX-5X-3/BL21菌也进行了IPTG诱导表达和纯化，方法同pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌。同样也跑了一张SDS-PAGE图。(6)把这一节中从pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌与pGEX-5X-3/BL21菌第一次回收到的Elutionbuffer进行蛋白浓度测定（用的是BCA蛋白浓度试剂盒，按照说明书步骤测定），然后冷藏保存，以便于下一章的使用。3.2.4NS1蛋白的质谱分析用小刀将纯化到的60kDa左右大小的GST-NS1融合蛋白从SDS-PAGE胶上切下，按照布鲁克公司质谱仪所要求的步骤进行一维电泳胶内酶解操作[51]。具体操作如下：将样品加入200-400l脱色剂，将其清洗至透明，去除上清，冻干。加入100mMDTT，56℃孵化30min。去上清，加入200mMIAA，暗处20min。去上清，加入100mMNH4HCO3，室温15min。去上清，加入ACN，5min后吸去，冻干加入2.5-10ng/lTrypsin溶液，在37℃条件下反应过夜，20小时左右。将处理后的样品进行MALDI-TOF-MS分析。36 江苏大学硕士学位论文3.3实验结果pGEX-5X-3-ns1wt重组质粒转化大肠杆菌BL21，用4种不同温度（16℃、20℃、28℃、37℃）诱导重组质粒表达，在20℃时，pGEX-5X-3-ns1wt可溶性NS1蛋白表达产量最高；在20℃和37℃两种温度诱导条件下，比较野生型重组质粒pGEX-5X-3-ns1wt和TIR的突变型重组质粒pGEX-5X-3-ns1M表达NS1蛋白，结果显示NS1翻译起始区的密码子同义突变并不能明显提高目的蛋白的表达量与可溶性。此外，对20℃诱导表达的目的蛋白进行纯化，经质谱分析表达产物是融合蛋白NS1。3.3.1最佳诱导表达温度如图3.1，pGEX-5X-3-ns1wt/BL21的4组（8个泳道）表达条件除了温度之外（16℃、20℃、28℃、37℃），其它都相同，这些样品的处理方式及上样量都相同。所以可以做一些合理范围内的比较。37 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究图3.1不同温度下融合蛋白表达的SDS-PAGE与Westernblot图。Fig3.1SDS-PAGEandWesternblotdetecttheexpressionoffusionproteinatdifferenttemperature.A，B：不同温度下融合蛋白表达的SDS-PAGE图与Westernblot图M:预染蛋白标准分子；1：pGEX-5X-3/BL21对照组样品10μl；2:16℃诱导上清样品10μl；3:16℃诱导沉淀样品10μl；4:20℃诱导上清样品10μl；5:20℃诱导沉淀样品10μl；6:28℃诱导上清样品10μl；7:28℃诱导沉淀样品10μl；8:37℃诱导上清样品10μl；9:37℃诱导沉淀样品10μl图3.1显示NS1蛋白在16℃，20℃，28℃和37℃四种温度条件下均能表达，而只有在16℃，20℃和28℃三种较低温度下诱导才能溶解于裂解液上清中，在20℃条件下表达产量比较高而且可溶性的量最大。这些都说明在4种温度中，20℃是进行表达及纯化的最佳温度。；38 江苏大学硕士学位论文3.3.2翻译起始区（TIR）内同义突变对表达的影响将重组质粒pGEX-5X-3-ns1M和pGEX-5X-3-ns1wt分别转化感受态细胞BL21，挑取氨苄平板上的克隆培养在LB液体培养基中，对菌液进行IPTG诱导，收集过夜诱导的菌液，对离心后的菌体进行超声破碎，通过离心收集裂解上清和菌体沉淀，分别对它们的上清和菌体沉淀进行SDS-PAGE和Westernblot分析，其结果表明：BmBDVNS1蛋白成功获得表达，主要以不可溶形式存在（图3.2Alane2和lane4），其中泳道2中的目的蛋白量与泳道4中目的蛋白量相近，说明BmBDVns1基因翻译起始区突变后，未见显著提高其在宿主菌中的表达量。Westernblot结果（图3.2B）进一步证明：图3.2Blane2和lane4中60kDa的位置的蛋白为目的蛋白。如图3.2，从图中可以发现在20℃与37℃，两种质粒（pGEX-5X-3-ns1wt/BL21与pGEX-5X-3-ns1M/BL21）均能表达目的蛋白，而且在20℃时，两者上清中均有溶解的目的蛋白（图3.2Clane1和lane3），但两种质粒的表达量与可溶性没有明显区别，这些结果说明翻译起始区（TIR）内的同义突变对蛋白表达量以及蛋白的溶解度没有明显的提高。39 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究图3.2pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌与pGEX-5X-3-ns1M/BL21菌20℃与37℃时的表达情况比较Fig3.2ExpresscompareofpGEX-5X-3-ns1wt/BL21andpGEX-5X-3-ns1M/BL21at2temperatureA，B：37℃时，两种菌表达比较的SDS-PAGE图与Westernblot图M：预染蛋白标准分子；1：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌37℃诱导上清样品10μl；2：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌37℃诱导沉淀样品10μl；3：pGEX-5X-3-ns1M/BL21菌37℃诱导上清样品10μl；4：pGEX-5X-3-ns1M/BL21菌37℃诱导沉淀样品10μlC，D：20℃时，两种菌表达比较的SDS-PAGE图与Westernblot图M：预染蛋白标准分子；1：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌20℃诱导上清样品10μl；2：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌20℃诱导沉淀样品10μl；3：pGEX-5X-3-ns1M/BL21菌20℃诱导上清样品10μl；4：pGEX-5X-3-ns1M/BL21菌20℃诱导沉淀样品10μl40 江苏大学硕士学位论文3.3.3BmBDVNS1蛋白的纯化将表达菌进行超声破碎，利用GST柱子从裂解液上清中纯化BmBDVNS1蛋白，通过含不同浓度的还原型谷胱甘肽缓冲液对富集目的蛋白的柱子进行洗脱，收集系列BmBDVNS1蛋白流出液，通过SDS-PAGE电泳对这些流出液成分进行分析，结果表明（图3.3A）：泳道1和泳道2分别为宿主表达菌总蛋白和与柱子结合后的蛋白流出液，而泳道4-8中分别为收集的目的蛋白，其大小与目的蛋白理论大小相一致；而不含ns1的pGEX-5X-3重组质粒的大肠杆菌裂解上清进行纯化，对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明：只获得GST标签大小的肽段，而不含与GST融合的BmBDVNS1融合蛋白，说明图3.3A电泳图中55kDa处的蛋白为目的蛋白，可用于进一步实验分析。41 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究图3.3pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌与pGEX-5X-3/BL21菌进行蛋白纯化后的SDS-PAGE图Fig3.3ProteinpurificationofpGEX-5X-3-ns1wt/BL21andpGEX-5X-3/BL21A：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌的蛋白纯化B:pGEX-5X-3/BL21菌的蛋白纯化M：预染蛋白标准分子；1：混合液过柱子后的回收液；2：第一次洗柱子后回收的Washbuffer；3：最后一次洗柱子后回收的Washbuffer；4：:第一次洗柱子后被回收的Elutionbuffer；5：:第二次洗柱子后被回收的Elutionbuffer；6：:第三次洗柱子后被回收的Elutionbuffer；7：:第四次洗柱子后被回收的Elutionbuffer；8：泳道是第五次洗柱子后被回收的Elutionbuffer(1)从图3.3可以发现没有ns1序列的pGEX-5X/BL21菌只能纯化到一条与GST凝胶结合的小蛋白，而pGEX-5X-3/BL21菌所纯化的蛋白溶液不仅有该小42 江苏大学硕士学位论文蛋白，还有一条前者没有的60kDa左右的蛋白条带，这说明这条大小在60kDa左右的蛋白条带就是目的蛋白NS1蛋白。pGEX-5X-3-ns1M/BL21菌纯化结果图与图3.3的A图完全一样，进一步证明，翻译起始区（TIR）内得同义突变对蛋白表达量以及蛋白的溶解度都没有明显的提高。(2)经测定，回收的pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌的Elutionbuffer蛋白浓度为3.2μg/μl，回收的pGEX-5X-3/BL21菌的Elutionbuffer蛋白浓度为4.0μg/μl3.3.4NS1蛋白的质谱分析将图3.3泳道4中的蛋白条带抠出，对蛋白条带进行预处理，对处理后的蛋白肽段混合物进行质谱分析，结果表明：红色字体表示对检测到的肽段，有五个肽段能够被检测到，经分析它们都是BmBDVNS1序列中的肽段，该分析结果表明：纯化的蛋白为BmBDVNS1，可对该蛋白的生物活性在细胞水平和家蚕体内进行深入分析，为揭示该蛋白的生物功能和作用机制打下基础。图3.4纯化的BmBDVNS1蛋白质谱分析Fig3.4MSanalysisofpurifiedBmBDVNS1fromlysatesofE.coli(BL21)红色字体表示BmBDVNS1蛋白序列中被检测到的肽段.43 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究3.4讨论对于最佳诱导温度的选择，我们是按照经验选择的16℃，20℃，28℃，37℃四个温度梯度。结果显示四种温度下，NS1蛋白都能表达，但是37℃时，在裂解的上清溶液中没检测有任何的NS1蛋白，而在较低温度时，上清溶液中或多或少都有NS1蛋白。有相关文章显示，蛋白的可溶性与温度和所带有的蛋白标签有很大的关系，在用较高温度诱导蛋白表达时，目的蛋白容易形成在裂解液上清中不易溶解的包涵体，只能存在于裂解后的沉淀中，而经常用于蛋白纯化的His与GST标签，经比较，GST更能增加蛋白的溶解量，对于一些难溶蛋白，都可以尝试与GST融合表达。在纯化过程中还遇到很多问题，首先，摇床显示器所设定的温度与实际测量温度不一致，要低2℃左右，为了增加试验的可靠性，以实际测得的温度为准。其次，在超声裂解时，蛋白酶抑制剂是一定要加的。虽然使用量很少，但是能防止被有关酶降解，有几次忘记添加，纯化到的蛋白量很低。同时，超声裂解时的功率也很重要，功率太大蛋白会降解，功率太小裂解太慢，根据不断摸索，最后所用功率在100~200W之间。在超声裂解时，通常裂解50min到1h10min后，裂解液变透明，可以终止裂解，但是有几次裂解混合液始终无法变透明，结果还好，裂解1h也能纯化到蛋白。另一方面，pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌与pGEX-5X-3-ns1M/BL21菌的目的蛋白表达量以及溶解度都没有明显差异，这可能是BL21菌的表达能力有限，没有经过序列突变的pGEX-5X-3-ns1wt就可以让BL21菌的表达达到饱和水平，故ns1基因在TIR的同义突变在实际表达上是没有太大的意义。为了增加试验的可靠性，我们用没有ns1序列的pGEX-5X-3/BL21菌也进行的蛋白诱导表达和纯化，结果纯化到了一个较小的条带，这与pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌Westernblot中偶尔能看到的较小的条带是一致的，经对比Westernblot和之后质谱分析都证明，该小片段是单独表达的标签蛋白，同时NS1蛋白确实得到表达和纯化，而且pGEX-5X-3/BL21菌纯化到的溶液还可以在下一章中作为阴性对照。44 江苏大学硕士学位论文第四章BmBDVNS1蛋白生物毒理性分析本实验室李芒芒等人[52,53]通过在家蚕体内过表达BmBDVNS1蛋白，研究结果表明：体内过表达该蛋白能加速家蚕的死亡进程，其中肠糜烂程度也更加严重，由此推测该蛋白对家蚕具有毒理性。为获得该实验报道的直接证据，本实验通过纯化的BmBDVNS1蛋白口添和皮下注射家蚕，来研究其对家蚕发育和其存活时间的影响；同时将纯化的BmBDVNS1蛋白添加到培养的BmN细胞培养基中，来研究其对细胞形态和增殖的影响。4.1材料试剂4.1.1主要材料材料来源306品系家蚕，BmN细胞，桑叶本实验室提供其它同上一章同上一章4.1.2主要试剂试剂公司BmN细胞培养基GIBCO公司其它同上一章同上一章4.1.3配制试剂3.2μg/μl的牛血清白蛋白（BSA）溶液：在电子天平上称取32mg的BSA粉末，然后倒入10ml的单蒸水中，混匀后5℃保存。4.1.4实验仪器细胞培养箱，加湿器，25μl量程的医用注射器45 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究4.2实验方法4.2.1NS1蛋白对BmN细胞的毒性为了进一步的分析NS1蛋白毒性，我们在细胞水平上进行了相关实验，我们选择的细胞是家蚕卵巢细胞BmN细胞。根据所纯化的NS1融合蛋白浓度，配置了对应的BSA蛋白溶液（浓度与NS1融合蛋白浓度相同3.2μg/μl）。(1)将(1×105)BmN细胞平铺在6孔板上，分为四组。四组在正常添加培养基后分别进行的操作是，添加NS1蛋白10μl（32μg）的试验组，添加阴性对照蛋白32μg（8μl）的对照组(Negativecontrol)，添加BSA溶液10μl（32μg）的对照组，以及没有添加蛋白溶液的空白组。(2)在添加完NS1蛋白以及对照蛋白后，在27℃下培养，每隔一段时间观察各组BmN细胞的生长增殖情况。4.2.2NS1蛋白在家蚕水平的毒性选择了家蚕306品系，进行试验。306是BmBDV的易感品系，能让NS1蛋白的毒性更加显著。分别进行了注射和口添试验。(1)选取4龄306家蚕适量，在4龄快结束时喂食添加适量抗生素的桑叶一天。在5龄起后第二天再喂食含有适量抗生素的桑叶一天。5龄第三天对家蚕进行注射和口添各组蛋白溶液，注射和口添操作如下:为了加强研究的可靠性，我们除了用GST与NS1的融合蛋白作为实验组；pGEX-5X-3/BL21菌所纯化的GST蛋白作为阴性对照（Negativecontrol）；还添加了BSA蛋白作为另一个对照；最后还留部分家蚕不作处理，为空白对照。选择健康的家蚕7组，每组30头家蚕。注射实验组每头家蚕注射纯化的NS1融合蛋白10μl（32μg），注射阴性对照组每头家蚕注射等重量阴性对照蛋白8μl（32μg，Negativecontrol），注射BSA对照组每头家蚕注射BSA溶液10μ（l32μg）。口添实验组每头家蚕经口添食纯化的NS1融合蛋白10μl（32μg），口添阴性对照组每头家蚕口添等重量阴性对照蛋白8μl（32μg），口添BSA对照组每头家蚕口添BSA溶液10μl（32μg）。最后一组家蚕既不注射也不经口添食蛋白溶液，46 江苏大学硕士学位论文正常饲养。注射各种蛋白时，使用的都是25μl量程的微量注射器，经由第八腹节与第七腹节的节间膜穿破皮肤，沿着第七腹节表皮向家蚕头部的方向插入3mm左右，然后缓慢注射溶液。口添时，用移液枪吸入蛋白溶液，对准家蚕口部慢慢打出，直至家蚕全部吸入体内。(2)注射和口添结束后，所有家蚕都用无抗生素的桑叶在25℃正常饲养。并每隔若干小时观察一次各组家蚕的生长情况。所有家蚕试验重复3次。4.3实验结果将纯化的BmBDVNS1蛋白添加到BmN细胞中，27℃连续培养3天后，对其进行光学显微观察，其结果表明：BmBDVNS1蛋白会影响BmN细胞的正常生长，BmN细胞的增殖明显收到抑制，培养孔中的细胞呈零星状态，细胞表面粗糙，而其它对照中的细胞都能正常增殖，其细胞状态都较好，细胞边缘光滑圆润，推测BmBDVNS1蛋白对BmN细胞增殖具有副作用。为进一步测定BmBDVNS1蛋白对家蚕个体生长的影响，将纯化的目的蛋白通过皮下注射进入家蚕血液中，同时将空白对照菌的洗脱流出液和BSA蛋白分别注射入家蚕血液中用作阴性对照，结果表明：24h后，注射有BmBDVNS1蛋白的家蚕全部死亡，其身体呈透明状，身体后半部分略显黄色；而注射有不含目的蛋白的洗脱流出液的家蚕对照组中，其个体全都是活的，它们还能正常取食桑叶；为排除家蚕死亡是因为血液中注射有过量的异源蛋白，本研究中又对家蚕皮下注射等量的BSA蛋白，对其培养24后，发现这些家蚕与没有经过任何处理的健康家蚕没有明显差异，其行动和取食仍能正常进行，说明BmBDVNS1蛋白对家蚕确实具有致死作用。47 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究图4.1NS1蛋白对BmN细胞与家蚕（注射组）生长的影响Fig4.1EffectofproteinNS1onthegrowthofBmNcellsandsilkworm(injection)4.3.1NS1蛋白对BmN细胞的毒性如图4.1，四组BmN细胞在接受处理后（在27℃条件下培养72h后的情况图），添加BmBDVNS1蛋白的细胞数量明显少于没有进行添加处理的细胞，而阴性对照组(Negativecontrol)与BSA对照组的细胞数量与没有添加蛋白处理的细胞数量很接近。同时相对于其他组，添加NS1蛋白后细胞表面更加粗糙。这些情况共同说明BmBDV的NS1蛋白对BmN细胞有毒性，NS1蛋白不仅减缓了BmN细胞的增殖，而且还对细胞的正常状态有不良影响。4.3.2NS1蛋白对家蚕的毒性在家蚕方面（家蚕图片在处理后24h时采集）如图4.1，注射有NS1蛋白的家蚕首先变黄，然后慢慢变黑，最后死亡，在18h时，死亡15头，24h时，全部死亡。而其他6组家蚕都能正常取食桑叶，正常生长，所有三种口添组家蚕的生长情况都同没有注射和口添蛋白的家蚕，图略。这些现象说明NS1蛋白经注射直接进入家蚕血淋巴对家蚕有很大毒性，而其他对照的注射蛋白对家蚕没有毒性。推测口添的NS1及其它蛋白均被家蚕消化吸收，所以对家蚕生长没有影响。三次重复结果相同。48 江苏大学硕士学位论文4.4讨论很多研究显示：细小病毒NS1蛋白具有毒性，它主要是通过参与宿主细胞的复制，调控其凋亡，控制一些基因的表达而起到作用[54]。Jurg等发现，A9细胞系的酪蛋白激酶催化亚单位CKIIα会与细小病毒NS1蛋白结合，停止细胞CKIIα相关反应，改变细胞内环境，产生不利于细胞的反应，使细胞凋亡。细小病毒B19的NS1蛋白在一些细胞系中表达，会上调两种与炎症相关的细胞因子，导致自身免疫病的产生，对生物体有害[55]。Gregory和Hsu、Poole等[56]还认为B19的NS1蛋白会参与caspase途径，影响了细胞凋亡。BmBDV的NS1蛋白与细小病毒NS1蛋白具有一定的同源性，具有ATP酶，结合特定DNA序列，DNA解旋酶等活性。有研究显示[52]，BmBDV的NS1蛋白是一种磷酸化蛋白，通过对可能的磷酸化位点进行突变后发现，NS1蛋白的各种活性都有降低。将突变后的病毒（ns1基因无磷酸化位点）感染家蚕后发现，病毒对家蚕的半致死剂量有明显上升，这些现象都能说明磷酸化对NS1蛋白及BmBDV的重要性，但是该实验没有直接单独使用NS1蛋白进行实验。我们猜想，BmBDV的NS1蛋白单独存在时也是具有一定的毒性，所以我们对家蚕口添和注射NS1蛋白溶液，在家蚕卵巢细胞BmN细胞系中添加NS1蛋白溶液进行实验。结果与我们的预期是一致的，其它组家蚕都能健康生长，而注射NS1蛋白的家蚕第二天全部死亡，其它细胞系均正常增殖，添加NS1蛋白细胞系的增殖受到抑制。这些现象说明单独的NS1蛋白对家蚕和BmN细胞是有毒性的，而口添的NS1蛋白则可能被消化掉而没有毒性。特别需要指出的是，注射NS1蛋白的家蚕在死亡之前先变黄，家蚕减少取食桑叶，然后变黑。这些现象与被病毒感染而死亡有一定相似性，但是比染病死亡要快。和家蚕农药中毒也有一定的相似性，但是致死剂量要比农药高得多，农药中毒是通过口进入体内，而且死亡更快。49 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究第五章BmBDVNS1蛋白与Bm-SP142及BmBDVDNA聚合酶的体外互作分析文献报道：家蚕二分浓核病毒BmBDVNS1蛋白能与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142及BmBDVVD1-ORF4编码的DNA聚合酶发生相互作用[44]，为揭示BmBDVNS1蛋白的作用分子机制，本章对它们的相互作用进行进一步分析，从而有助于阐明BmBDVNS1蛋白的活性和空间结构，为病毒与宿主间的相互博弈和家蚕的先天性免疫提供理论依据。为此，通过体外GST-pulldown实验来分析BmBDVNS1蛋白与Bm-SP142及BmBDVVD1-ORF4的3个截短片段（其表达的DNA序列长度分别为1093bp，616bpA，616bpB）的相互作用。5.1材料试剂5.1.1主要材料材料来源pGEX-5X-3-Bm-SP142/BL21菌，pET30a-1093bp/BL21菌，本实验室提供pET30a-616bpA/BL21菌，pET30a-616bpB/BL21菌其它同第二，三章同第二，三章5.1.2主要试剂试剂公司同第三章同第三章5.1.3配制试剂同第三章50 江苏大学硕士学位论文5.1.4实验仪器同第三章5.2实验方法5.2.1带His标签的BmBDVNS1蛋白的表达将pET30a-ns1C/BL21菌进行小试管表达，并用His标签对应的抗体进行Westernblot，具体表达与Westernblot步骤参考3.2.1。5.2.2NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142的pull-downassay我们表达家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142用的是含有GST标签pGEX-5X-3-Bm-SP142/BL21菌，所以该实验用Bm-SP142蛋白作为诱饵蛋白，NS1蛋白为目的蛋白即捕获蛋白。(1)将pGEX-5X-3-Bm-SP142/BL21菌与pET30a-ns1C/BL21菌分别转接于100ml培养基中，在37℃摇床中培养，到合适浓度后，2瓶菌液中分别添加100μl工作浓度的IPTG，然后置于20℃摇床中过夜培养（12h至15h）。第二天分别收集细菌，加裂解液和PMSF超声裂解，离心收集上清和沉淀（方法同3.2）。将收集的两种菌上清和沉淀一起跑一块SDS-PAGE电泳，确定两种蛋白是否表达，如有表达，则看在上清中是否有溶解的家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142和NS1两种蛋白。(2)确定在上清中有两种蛋白后，首先用Washbuffer对柱子与GST凝胶进行平衡处理（方法同3.2），然后将悬浮在Washbuffer中的GST凝胶加入到pGEX-5X-3-Bm-SP142/BL21菌的上清中，在4℃条件下孵育（旋转时间为12~24h之间），让GST凝胶与GST-Bm-SP142融合蛋白充分结合。孵育完成后，用柱子收集过滤收集GST凝胶，用Washbuffer洗GST凝胶4~5次（方法同3.2），然后再次用Washbuffer悬浮，将悬浮混合液都加入到pET30a-ns1C/BL21菌的裂解上清中，再次在4℃条件下孵育（旋转时间为12~24h之间），让蛋白充分接触，如能结合则可充分作用。孵育再次完成后，再用柱子过滤收集GST凝胶，51 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究用Washbuffer洗GST凝胶12~15次，让杂蛋白完全去除，最后用Elutionbuffer洗GST凝胶回收蛋白，每次用500μlElutionbuffer，完全浸泡GST凝胶3min后，从下端回收Elutionbuffer溶液，重复5次。之后，用70%乙醇溶液洗涤GST凝胶3次，每次2ml70%乙醇，完全浸泡GST凝胶2min后，让70%的乙醇从下端流出，最后用70%乙醇悬浮GST凝胶，将悬浮的混合液回收到1.5mlEP管内保存。空柱子也用70%乙醇洗3次，每次1~2ml70%乙醇，浸泡2min，洗完后，在空柱子中加1ml70%乙醇用来让柱子的膜保持湿润。(3)蛋白回收后，用pET30a-ns1C/BL21菌裂解上清和Elutionbuffer第一次回收的蛋白跑2块一样的SDS-PAGE电泳，一块用考马斯亮蓝染色，一块用来转膜，做Westernblot，一抗是小鼠抗His单克隆抗体（pET30a载体上自带用6个His的标签），二抗是羊抗小鼠的辣根过氧化物酶标签抗体，最后用ECL显色（具体步骤同3.2.1）。根据考马斯亮蓝染色图与，Westernblot图判断Bm-SP142蛋白和NS1蛋白两者是否有直接的相互作用。5.2.3NS1蛋白与VD1-ORF41093bp蛋白片段的pull-downassay如图1.1，实验室李等人制备了含有BmBDVVD1-ORF4部分片段的3种表达菌，分别是含有600bp（A）的pET30a-616bpA/BL21菌，含有600bp（B）的pET30a-616bpB/BL21菌以及含有1077bp的pET30a-1093bp/BL21菌，因为两端均含有酶切位点和保护碱基，所以长度均加上16bp。我们有能表达GST与NS1融合蛋白的pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌，以及实验室现有含His标签的pET30a-1093bp/BL21菌，所以该实验用NS1蛋白作为诱饵蛋白，1093bp蛋白片段为目的蛋白即捕获蛋白。操作方法同5.2.2最后用pET30a-1093bp/BL21菌裂解上清和Elutionbuffer第一次回收的蛋白跑2块一样的SDS-PAGE电泳，也是一块考马斯亮蓝染色，一块用来转膜，做Westernblot。Westernblot方法和抗体同5.2.1。根据根据考马斯亮蓝染色图与，Westernblot图判断NS1蛋白和VD1-ORF4的1093bp蛋白片段两者是否有直接的相互作用。52 江苏大学硕士学位论文5.2.4NS1蛋白与VD1-ORF4616bpA蛋白片段的pull-downassay我们有能表达GST与NS1融合蛋白的pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌，以及实验室现有含His标签的pET30a-616bpA/BL21菌，所以该实验用NS1蛋白作为诱饵蛋白，616bpA蛋白片段为目的蛋白即捕获蛋白。操作方法同5.2.2最后用pET30a-616bpA/BL21菌裂解上清和Elutionbuffer第一次回收的蛋白跑2块一样的SDS-PAGE电泳，也是一块考马斯亮蓝染色，一块用来转膜，做Westernblot。Westernblot方法和抗体同5.2.1。根据根据考马斯亮蓝染色图与，Westernblot图判断NS1蛋白和VD1-ORF4的616bpA蛋白片段两者是否有直接的相互作用。5.2.5NS1蛋白与VD1-ORF4616bpB蛋白片段的pull-downassay我们有能表达GST与NS1融合蛋白的pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌，以及实验室现有含His标签的pET30a-616bpB/BL21菌，所以该实验用NS1蛋白作为诱饵蛋白，616bpB蛋白片段为目的蛋白即捕获蛋白。操作方法同5.2.2最后用pET30a-616bpB/BL21菌裂解上清和Elutionbuffer第一次回收的蛋白跑2块一样的SDS-PAGE电泳，也是一块考马斯亮蓝染色，一块用来转膜，做Westernblot。Westernblot方法和抗体同5.2.1。根据根据考马斯亮蓝染色图与，Westernblot图判断NS1蛋白和VD1-ORF4的616bpB蛋白片段两者是否有直接的相互作用。5.3实验结果5.3.1pET30a-ns1C/BL21菌的诱导表达将序列测定正确的重组质粒pET30a-ns1C转化宿主表达菌BL21，将转化菌液均匀涂抹在抗性平板上，次日，从抗性平板上挑取克隆在LB液体培养基中进53 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究行培养，通过IPTG对含重组质粒pET30a-ns1C的菌液进行诱导，对诱导的大肠杆菌总蛋白进行SDS-PAGE分析，从图5.1A可以看出，含pET30a-ns1C/BL21的宿主菌能够特异地表达出一条大小在40kDa左右的蛋白，为进一步验证该蛋白为融合有6×His标签的目的蛋白，通过Westernblot对该诱导蛋白进行验证，结果表明如图5.1B所示：在泳道2，40kDa左右的特异位置能够交杂到一条特异的目的蛋白，该蛋白N端融合有6×His标签的的目的蛋白，可用于下一步的GST-pulldown的体外分析中。图5.1重组质粒pET30a-ns1C诱导后的目的蛋白分析Fig5.1SDS-PAGEandWesternblotanalysisoftargetproteinA，B：pET30a-ns1C/BL21菌表达的分析图M：蛋白分子量；1：无ns1序列的pET30a/BL21菌总蛋白电泳分析；2：pET30a-ns1C/BL21菌总蛋白的Westernblot分析5.3.2NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142的体外互作为验证Bm-SP142与BmBDVNS1蛋白之间的相互作用，我们对其在体外进行GST-pulldown分析，其中Bm-SP142蛋白为与GST融合的融合蛋白（如图5.2A泳道3，4），BmBDVNS1为融合有6×His标签的目的蛋白（如图5.2A泳,1，2），首先通过亲和层析将融合蛋白Bm-SP142与ProteinIsoTMGSTResin亲和层析柱结合通过平衡液将目的蛋白Bm-SP142表面吸附的杂质洗脱，再将纯化的融合有6×His标签的BmBDVNS1蛋白移入到Bm-SP142与ProteinIsoTMGSTResin亲和层析柱中，通过平衡液将其余杂质漂洗干净，通过一系列的Elutionbuffer54 江苏大学硕士学位论文对亲和层析柱中的蛋白进行洗脱，分别收集Elutionbuffer并进行SDS-PAGE（如图5.2B所示）和Westernblot（如图5.2C所示）分析，在Elutionbuffe中不能特异地杂交到BmBDVNS1蛋白（如图5.2C所示泳道2），说明BmBDVNS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142在体外没有直接的强烈相互作用。图5.2NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142的pull-downassayFig5.2Pull-downassayoftheinteractionsbetweenBmBDVNS1andBm-SP142A：pET30a-ns1C/BL21菌与pGEX-5X-3-Bm-SP142/BL21菌裂解后的上清与沉淀M：预染蛋白分子量；1：pET30a-ns1C/BL21菌裂解后的上清；2：pET30a-ns1C/BL21菌裂解后的沉淀；3：pGEX-5X-3-Bm-SP142/BL21菌裂解后的上清；4：pGEX-5X-3-Bm-SP142/BL21菌裂解后的沉淀B，C：Pull-down的SDS-PAGE图与Westernblot图M：预染蛋白分子量；1：pET30a-ns1C/BL21菌裂解后的上清；2：pull-down后第一次回收的Elutionbuffer5.3.3NS1蛋白与VD1-ORF41093bp蛋白片段的体外互作为揭示BmBDVNS1与BmBDVDNA聚合酶蛋白之间的相互作用，我们对其在体外进行GST-pulldown分析，其中BmBDVNS1蛋白为与GST融合的融合蛋白（如图5.3A泳道1，2），BmBDVDNA聚合酶为融合有6×His标签的截55 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究短蛋白肽（如图5.3A泳道3，4），首先通过亲和层析让融合蛋白BmBDVNS1与ProteinIsoTMGSTResin亲和层析柱结合，通过平衡液将目的蛋白BmBDVNS1表面吸附的杂质洗脱，再将融合有6×His标签的BmBDVDNA聚合酶截短多肽移入到BmBDVNS1与ProteinIsoTMGSTResin亲和层析柱中，通过平衡液将其余杂质漂洗干净，通过一系列的Elutionbuffer对亲和层析柱中的蛋白进行洗脱，分别收集Elutionbuffer并进行SDS-PAGE（如图5.3B所示）和Westernblot（如图5.3C所示）分析，在收集液中没有能特异地杂交到BmBDVDNA聚合酶截短多肽（如图5.3C所示泳道2），说明BmBDVNS1蛋白与BmBDVVD1-ORF41093bp编码的多肽区域内没有直接的相互作用，该实验结果为我们准确定位BmBDVNS1蛋白与BmBDVVD1-ORF4编码的蛋白间的作用位点提供了理论依据。图5.3BmBDVNS1蛋白与BmBDVVD1-ORF41093bp编码的截短多肽间的pull-downassayFig5.3Pull-downassayoftheinteractionbetweenproteinNS1andproteinVD1-ORF41093bpA：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌与pET30a-1093bp/BL21菌裂解后的上清与沉淀M：预染蛋白分子量；1：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌裂解后的上清；2：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌裂解后的沉淀；3：pET30a-1093bp/BL21菌裂解后的上清；4：pET30a-1093bp/BL21菌裂解后的沉淀B，C：Pull-down的SDS-PAGE图与Westernblot图M：预染蛋白分子量；1：pET30a-1093bp/BL21菌裂解后的上清；2：pull-down后第一次回收的Elutionbuffer56 江苏大学硕士学位论文5.3.4NS1蛋白与VD1-ORF4616bpA蛋白片段的体外互作为进一步揭示BmBDVNS1与BmBDVDNA聚合酶蛋白之间的相互作用位点，我们对BmBDVNS1和BmBDVVD1-ORF4616bpA编码的截短多肽进行体外GST-pulldown分析，其中BmBDVNS1蛋白为与GST融合的融合蛋白（如图5.4A泳道1，2），BmBDVVD1-ORF4616bpA为融合有6×His标签的截短蛋白肽（如图5.4A泳道3，4），首先通过亲和层析将融合蛋白BmBDVNS1与ProteinIsoTMGSTResin亲和层析柱结合，通过平衡液将目的蛋白BmBDVNS1表面吸附的杂质洗脱，再将融合有6×His标签的BmBDVDNA聚合酶截短多肽移入到BmBDVNS1与ProteinIsoTMGSTResin亲和层析柱中，通过平衡液将其余杂质漂洗干净，通过一系列的Elutionbuffer对亲和层析柱中的蛋白进行洗脱，分别收集Elutionbuffer并进行SDS-PAGE（如图5.4B所示）和Westernblot（如图5.4C所示）分析，在收集液中没有特异地杂交到BmBDVDNA聚合酶截短多肽（如图5.4C所示泳道2），说明BmBDVNS1蛋白与BmBDVVD1-ORF4616bpA编码的多肽区域内没有直接的相互作用，该实验结果为我们准确定位BmBDVNS1蛋白与BmBDVVD1-ORF4编码的蛋白间的作用位点提供了理论依据。57 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究图5.4BmBDVNS1蛋白与BmBDVVD1-ORF4616bpA编码的截短多肽之间的的pull-downassayFig5.4Pull-downassayoftheinteractionbetweenBmBDVNS1andtruncatedproteinencodedbyBmBDVVD1-ORF4616bpAA：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌与pET30a-616bpA/BL21菌裂解后的上清与沉淀M：预染蛋白分子量；1：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌裂解后的上清；2：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌裂解后的沉淀；3：pET30a-616bpA/BL21菌裂解后的上清；4：pET30a-616bpA/BL21菌裂解后的沉淀B，C：Pull-down的SDS-PAGE图与Westernblot图M：预染蛋白分子量；1：pET30a-616bpA/BL21菌裂解后的上清；2：pull-down后第一次回收的Elutionbuffer5.3.5NS1蛋白与VD1-ORF4616bpB蛋白片段的体外互作同时，我们对BmBDVNS1与BmBDVVD1-ORF4616bpB编码的截短多肽之间的相互作用进行了体外分析，，其中BmBDVNS1蛋白为与GST融合的融合蛋白（如图5.5A泳道1，2），BmBDVVD1-ORF4616bpB为融合有6×His标签的截短蛋白肽（如图5.5A泳道3，4），首先通过亲和层析将融合蛋白BmBDVNS1与ProteinIsoTMGSTResin亲和层析结合，通过平衡液将目的蛋白BmBDVNS1表面吸附的杂质洗脱，再将纯化的融合有6×His标签的BmBDVDNA聚合酶截短多肽移入到BmBDVNS1与ProteinIsoTMGSTResin亲和层析柱中，通过平衡液将其余杂质漂洗干净，通过一系列的Elutionbuffer对亲和层析柱中的蛋58 江苏大学硕士学位论文白进行洗脱，分别收集Elutionbuffer并进行SDS-PAGE（如图5.5B所示）和Westernblo（t如图5.5C所示）分析，在Elutionbuffer中不能特异地杂交到BmBDVDNA聚合酶截短多肽（如图5.5C泳道2所示），说明BmBDVNS1蛋白与BmBDVVD1-ORF4616bpB编码的截短多肽之间没有直接的相互作用，该实验结果为我们准确定位BmBDVNS1蛋白与BmBDVVD1-ORF4编码的蛋白间的作用位点提供了理论依据。图5.5BmBDVNS1蛋白与BmBDVVD1-ORF4616bpB编码的截短多肽间的pull-downassayFig5.5Pull-downassayoftheinteractionbetweenBmBDVNS1andtruncatedproteinencodedbyBmBDVVD1-ORF4616bpBA：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌与pET30a-616bpB/BL21菌裂解后的上清与沉淀M：预染蛋白分子量；1：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌裂解后的上清；2：pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌裂解后的沉淀；3：pET30a-616bpB/BL21菌裂解后的上清；4：pET30a-616bpB/BL21菌裂解后的沉淀B；C：Pull-down的SDS-PAGE图与Westernblot图M：预染蛋白分子量；1：pET30a-616bpB/BL21菌裂解后的上清；2：pull-down后第一次回收的Elutionbuffer59 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究5.4讨论在细胞内，NS1蛋白不仅能与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142相结合，还能与BmBDVVD1-ORF4表达的蛋白相互作用[44]。这些蛋白之间的相互作用，极有可能与BmBDVNS1蛋白的作用机制及毒性有关，对家蚕与BmBDV病毒的研究具有重要意义。于是我们在实验室现有的条件下，做了一下体外pull-down验证，结果都是阴性的。这说明BmBDV的NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142在细胞外无法进行强烈地相互作用，它们的结合需要在细胞内环境，或者还需要其它蛋白的帮助。而BmBDV的NS1蛋白与BmBDVVD1-ORF4上三个片段的阴性结果产生的原因，除了上面的原因之外，还有可能是三个片段都是BmBDVVD1-ORF4蛋白的小部分，无法形成一个能与NS1蛋白相互作用的完整有效结构，还有可能是NS1蛋白只能与VD1-ORF4上剩余部分对应的蛋白片段所形成的结构相互作用。BmBDV的NS1蛋白已被证实具有ATP酶，解旋酶，识别并结合特定DNA序列的功能，这些能很好地解释NS1蛋白参与到基因组的复制与病毒的扩增。而DNA聚合酶在DNA复制中是不可缺少的，这很好的解释了在生物体内NS1蛋白与BmBDVVD1-ORF4完整序列所对应蛋白存在的相互作用。而NS1蛋白在体内与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142能相结合，这会影响家蚕体内的一系列代谢途径，而使家蚕中毒死亡。蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀(Co-IP)、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。60 江苏大学硕士学位论文第六章总结与展望6.1主要工作总结主要工作是对家蚕二分浓核病毒（BmBDV）ns1基因序列进行了改造、表达和纯化及其生化毒理分析，最后还与可能相互作用的蛋白进行了体外pull-down。（1）为了后面实验需要我们用特异性的引物扩增得到了原有野生型ns1wt，TIR含有4个使用频率较高的同义密码子突变的ns1M以及含有不同酶切位点的ns1C三种ns1的基因序列，将ns1wt连上pGEX-5X-3质粒是为了表达可溶性蛋白并进行纯化，将ns1M连上pGEX-5X-3质粒是为了与前者进行蛋白表达的比较，将ns1C连上pET30a是为了最后pull-downassay的需要。（2）我们首先用pGEX-5X-3-ns1wt/BL21菌在16℃，20℃,28℃,37℃四种不同温度下进行诱导表达，发现在37℃诱导时，在裂解液上清中没有可溶性的NS1融合蛋白，而在20℃时NS1融合蛋白的溶解性最高。然后我们在37℃和20℃两种温度下用pGEX-5X-3-ns1wt/BL21与pGEX-5X-3-ns1M/BL21两种菌进行了表达比较，发现TIR含有使用频率较高的密码子并不能显著增加蛋白的表达量和溶解度，这可能是ns1wt序列就能让BL21的表达达到饱和的缘故。最后我们用GST凝胶从含有NS1融合蛋白的裂解液上清中纯化到NS1融合蛋白，为了下一章对照实验的需要，还特意诱导表达了无ns1序列的pGEX-5X-3/BL21菌，对该菌也进行了蛋白纯化，最后对纯化得到的两种蛋白溶液进行了浓度测定。（3）在获得纯化好的蛋白后，为了检测NS1蛋白是否具有毒性，我们将蛋白溶液分别注射和口添对BmBDV没有抗性的306家蚕，还在家蚕卵巢细胞BmN细胞的培养基中添加了蛋白溶液。结果口添NS1蛋白溶液的家蚕能正常取食桑叶，健康生活，而经皮下注射NS1蛋白溶液的家蚕在第二天都逐渐变黄，然后变黑，最后死亡，与其它中毒死亡时的情况非常相似，同时，培养基中添加NS1蛋白溶液的BmN细胞在培养3天以后，细胞的增殖明显降低。这些现象说明NS1蛋白对家蚕和BmN细胞均具有很强的毒性，而NS1蛋白口添家蚕对家蚕健康没有影响，极有可能是蛋白被家蚕消化分解而丧失毒性。（4）最后，由于有研究显示NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142和61 家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究BmBDVVD1-ORF4编码蛋白在体内能相互结合，也为了进一步探索NS1蛋白的功能，我们用NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142，以及BmBDVVD1-ORF4的3个蛋白片段分别进行体外pull-downassay。结果都是阴性，这说明NS1蛋白与这些蛋白或蛋白片段在体外是无法直接结合的。6.2展望BmBDV的NS1蛋白是一种多功能蛋白，至今，我们实验室已经完成了的工作有：NS1蛋白的表达，纯化，在细胞中的定位以及磷酸化对功能的影响。大家已经对NS1蛋白已经进行了充分地研究，但随着技术的发展，仍然有很多的领域需要进一步的探索。进一步的工作有：（1）不同浓度的NS1蛋白对多种品种家蚕的毒力大小；（2）少量NS1蛋白在家蚕体内引起的信号通路；（3）NS1蛋白与其它BmBDV蛋白在病毒扩增中如何起作用。62 江苏大学硕士学位论文参考文献[1]COTMORESF,AGBANDJE-MCKENNAM,CHIORINIJA,etal.ThefamilyParvoviridae[J].ArchivesofVirology,2014,159(5):1239-47.[2]潘敏慧.家蚕浓核病毒BmDNV-6的研究[D];西南农业大学,2005.[3]FLEGELTW,NIELSENL,THAMAVITV,etal.Presenceofmultiplevirusesinnon-diseased,cultivatedshrimpatharvest[J].Aquaculture,2004,240(s1–4):55-68.[4]BROZIOM,BELLA.NucleusfingerprintingfortheuniqueidentificationofFeulgen-stainednuclei[J].ProcSpie,2012,8315:17--7.[5]PEANGPIMB,SA-NGAP,SUPATRAT,etal.MarkedlyreducedseverityofDenguevirusinfectioninmosquitocellculturespersistentlyinfectedwithAedesalbopictusdensovirus(AalDNV)[J].Virology,2004,329(2):261-9.[6]HUL,ZHANGL,SHENC,etal.ThedensovirusofPeriplanetafuliginosa(PfDNV)asaninsectvectorforpersistentforeigngeneexpressioninvivo[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2007,358(4):976-82.[7]GIRAUDC,.,DEVAUCHELLEG,.,BERGOINM,.ThedensovirusofJunoniacoenia(JcDNV)asaninsectcellexpressionvector[J].Virology,1992,186(1):207-18.[8]LEDERMANNJP,SUCHMANEL,BLACKWC,etal.InfectionandpathogenicityofthemosquitodensovirusesAeDNV,HeDNV,andAPeDNVinAedesaegyptimosquitoes(Diptera:Culicidae)[J].JournalofEconomicEntomology,2004,97(6):págs.1828-35.[9]司亚运,邢亚丽,张盼盼,等.浓核病毒用于载体和生物防控的研究进展[J].生物学杂志,2015(06):77-80.[10]WELLERDM.BiologicalControlofSoilbornePlantPathogensintheRhizospherewithBacteria[J].AnnualReviewofPhytopathology,2003,26(1):379-407.63 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家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究致谢时间就这样在不经意中匆匆流过，在江苏大学，我度过了最丰富多彩的时光。自己不仅掌握了找工作所需要的实验技能，更重要的是学到了生活中的一些道理，让我更加自信地面对将来的生活。现在，到了这个重要的时刻，我的心情无比激动。首先，我要感谢我的导师姚勤研究员，在我对病毒学一无所知的时候，不辞劳苦地给我普及病毒学知识，讲解我所从事的课题；在我打不开思路实验无法继续时，和我讨论实验的每一种可能性，给我提供新的想法；在我生活上遇到困难时，像母亲一样给我鼓励，给我无微不至地关心，这些都让我深受感动。此外，姚老师博学的知识，平易近人的品格，严谨治学的态度无时不刻引导着我们，这些都让我受益匪浅。在这里，真诚地谢谢姚老师。此外，我还要感谢我的另一位老师李国辉副研究员，从我什么实验技术都不了解开始，李老师无私地带领我从最基础的试验操作学起，教我阅读有关文献，一步一步地让我学会相关的一系列实验知识，慢慢完成自己的各项实验，直至论文写作，不厌其烦，一路上给我持续的帮助。在此，深深地祝福李老师。另外，我还要感谢陈克平院长，朱玲萍书记，张春霞老师，马晓柯老师，陈焰老师以及王以一老师，感谢你们让我拥有在生命科学研究院无比珍贵的学习机会。我还要感谢胡朝阳老师，刘晓勇老师，夏恒传老师，杨艳华老师，邱旭华老师，陈亮老师、唐琦老师和王强老师，是你们的建议和帮助，让我少走了很多弯路，学习到更多知识。感谢张晓龙、周倩、张盼盼、闵超、陈先涛、殷逸能、杨丹枫、刘伟、王梅子、鲁爽、聂志超、董歆、陶慧敏、吕鹏、潘晔、冯凡、马上上、王鹏、韩莹莹、张苗苗、潘晓利，你们的陪伴让我的研究生生活变得更加丰富与充实，让我充满动力。我要感谢我的爸爸、妈妈还有妹妹，你们无论何时都默默的支持我，让我没有后顾之忧，是你们无悔的付出，让我顺利完成至今的学业。最后，再次感谢各位！70