抗精神病药物奥氮平和氯氮平对BMSCs成脂分化的作用及机制

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单位代码：10472学术学位□√专业学位□学号：20130225004中图分类号：Q2密级：公开硕士学位论文抗精神病药物奥氮平和氯氮平对BMSCs成脂分化的作用及机制EffectsandMechanismofAntipsychoticdrugsOlanzapineandClozapineontheAdiposeDifferentiationofMouseBoneMarrow-derivedMesenchymalStemCells作者姓名：纪晨燕导师姓名：李永海学科门类：理学专业名称：生物学培养院系：生命科学技术学院完成时间：二〇一六年三月 新乡医学院学位论文原创性声明本人邦重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加ｙ■标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在丈中从明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名；４矣日期：如日斗奉聲／在扣户学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学巧保辑井向国家有关部ｎ或机构送交论文的宴印件和电子版，允许论文被査阅和借阅。本人授权新乡医学院可ｙ■将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可从采、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文用影印。本学位论文属于。＂（请在臥下相应方框内打Ｖ）；１．保密□，在年解密后适用本授权书。＿２．不保密ｎ。作者签名：曰期：年月曰（Ｔ圭毛；片导师签名：Ｈ１為水冷期：＞辦年丈月〇Ｈ／ EffectsandMechanismofAntipsychoticdrugsOlanzapineandClozapineontheAdiposeDifferentiationofMouseBoneMarrow-derivedMesenchymalStemCellsAThesisSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：JiChenyanSupervisor：associateProf.LiYonghaiSchoolofLifeSciencesandTechnologyXinxiangMedicalUniversity 目录摘要....................................................................................................................................1Abstract..................................................................................................................................4前言....................................................................................................................................81材料与方法......................................................................................................................102结果..................................................................................................................................223讨论..................................................................................................................................374小结..................................................................................................................................40参考文献..............................................................................................................................40综述：第二代抗精神病药物诱导脂肪组织代谢变化的研究..........................................44攻读学位期间发表文章情况..............................................................................................56致谢.................................................................................................................................57个人简历........................................................................................................................58 新乡医学院硕士学位论文抗精神病药物奥氮平和氯氮平对BMSCs成脂分化的作用及机制摘要背景第二代抗精神病药物(Secondgenerationantipsychoticsdrugs,SGA)是治疗精神分裂症最常见的药物，与第一代抗精神病药物相比有很大的优势[1,2]。这些药物也越来越多地运用到其他精神疾病的治疗上，如精神障碍、孤独症及抑郁症等[3,4,5]。然而，在临床应用中，SGA主要的副作用是体重增加和代谢异常，包括高血糖、胰岛素耐受、Ⅱ型糖尿病、血脂异常和心血管疾病等[6,7]。骨髓间充质干细胞是一种颇具潜力的基因工程细胞，在体外能够诱导分化为脂肪细胞，是体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。关于SGA对小鼠骨髓间充质干细胞的作用研究较少。SGA引起体重增加的机制研究可以帮助指导临床用药及新的治疗方法的设计，以减少这些药物的副作用。目的1.探讨奥氮平和氯氮平对小鼠BMSCs增殖、成脂分化的影响；2.探究奥氮平和氯氮平在BMSCs增殖、成脂分化中的作用机制，为SGA可能导致肥胖及糖尿病的发生机制提供理论依据。方法1.细胞培养：BMSCs采用低糖DMEM+10%FBS进行培养，当细胞融合达到80-90%时，按照1:2或者1:3的比例进行传代。2.细胞诱导：①成脂诱导：用含有10mg/L胰岛素、0.5mmol/LIBMX、1.0µmol/L地塞米松、10%胎牛血清的DMEM低糖培养基（即成脂培养基）培养细胞2d，随后换成含有10mg/L胰岛素、10%胎牛血清的DMEM低糖培养基，每2d换一次液直到细胞分化成熟；②加入一定浓度的第二代抗精神病药物诱导。③成脂培养基与药物同时加入BMSCs进行诱导。3.采用MTT比色法和细胞计数法测定不同浓度的奥氮平、氯氮平对细胞增殖的影响，选取适宜浓度的奥氮平进行随后的实验。1 新乡医学院硕士学位论文4.采用油红O染色、Westernbloting、qRT-PCR等方法检测奥氮平对细胞成脂分化的作用及相关机制。结果1.MTT比色法和细胞计数法实验结果显示高浓度（80μM和100μM）奥氮平和氯氮平显著抑制细胞生长，20μM奥氮平和20μM氯氮平对BMSCs的的增殖几乎没有影响；2.油红O染色可见加入奥氮平的实验组细胞内脂肪滴明显多于阴性对照组；而MDI（成脂培养基）+奥氮平组、MDI+氯氮平组细胞内脂肪滴较MDI组（阳性对照组）有明显减少。3.Westernblot结果显示：单独使用奥氮平时，脂肪分化标志基因αp2和C/EBPβ的蛋白表达水平与对照组相比分别上升了36%(P<0.01)、25%(P<0.05)，均具有统计学意义；单独使用氯氮平时，C/EBPβ和αP2蛋白质表达水平分别上升35%(P<0.01)、25%(P＞0.05)，前者具统计学意义，后者差异不显著，无统计学意义；MDI和奥氮平共同作用时，MDI+20μM奥氮平组C/EBPβ和αP2的蛋白表达水平都比MDI组有所降低，灰度值分析表明降低水平差异性显著，具有统计学意义；MDI和氯氮平共同作用时，MDI+20μM氯氮平组C/EBPβ和αP2的蛋白质表达水平也较MDI组明显降低。4.RT-qPCR结果显示：单独使用奥氮平时，成脂相关基因Leptin、C/EBPα和Tnf-α的表达水平较对照组显著升高，分别上升68%（P<0.001）、79%（P<0.01）和60%（P<0.01）；单独使用氯氮平时，成脂相关基因PPARγ、Leptin和Tnf-α的mRNA表达水平分别上升52%（P<0.01）、66%（P<0.05）、65%（P<0.05），均具有统计学意义；MDI和奥氮平共同作用时，Leptin和C/EBPα的mRNA表达水平较MDI组显著降低，分别下调了65%（P<0.01）、84%（P<0.05），均具有统计学意义；MDI和氯氮平共同作用时，MDI+奥氮平组Leptin的mRNA表达水平较MDI组显著降低，下调了50%（P<0.001），具统计学意义；而PPARγ的基因表达水平有所升高；脂肪分化的负调控因子Tnf-α的mRNA表达水平较对照组和MDI组都有所上升，且具有统计学意义。5.Westernblot检测结果显示：单独使用奥氮平时，p-Akt的含量明显高于对照组、p-GSK-3β的表达随着p-Akt表达的增加逐渐减少，加入PI3K/Akt特异性阻断剂2 新乡医学院硕士学位论文(LY294002)后αp2和C/EBPβ的表达受到抑制，油红O染色结果显示细胞中的脂肪滴也明显减少；MDI和奥氮平共同作用时，下调了p-Akt的表达，而其上下游p-IRS和p-GSK-3β的表达也有变化。其中，p-Akt和p-IRS的表达较MDI组有所下调，且随着浓度的增加，逐渐下调。结论1.单独使用奥氮平、氯氮平可以促进小鼠BMSCs的成脂分化，且奥氮平的促进作用明显强于氯氮平；奥氮平可能通过促使PI3K/Akt信号通路中Akt磷酸化水平的升高来促进小鼠BMSCs的脂肪分化。2.MDI分别与奥氮平、氯氮平共同作用，与单独使用MDI相比，抑制了小鼠BMSCs的成脂分化。MDI和奥氮平共同作用时，胰岛素信号通路受到抑制，可能引起胰岛素耐受，其具体的机制有待于进一步研究。关键词奥氮平；氯氮平；第二代抗精神病药物；骨髓间充质干细胞；脂肪分化；PI3K/Akt信号通路3 新乡医学院硕士学位论文EffectsandMechanismofAntipsychoticdrugsOlanzapineandClozapineontheAdiposeDifferentiationofMouseBoneMarrow-derivedMesenchymalStemCellsAbstractBackgroundSecondgenerationantipsychoticdrugs(SGA)areconsideredtopossesssuperiorefficacyintreatingbothpositiveandnegativesymptomsofschizophreniacomparedtofirst-generationantipsychotics(FGA).Thesedrugsarealsoincreasinglyappliedtothetreatmentofotherpsychiatricdisorders,suchasmentaldisorders,autismanddepression.However,inclinicalapplications,SGAmainsideeffectsareweightgainandmetabolicabnormalities,includinghyperglycemia,insulinresistance,typeⅡdiabetes,dyslipidemiaandcardiovasculardisease.Bonemarrowmesenchymalstemcellsisaconsiderablepotentialofgeneticallyengineeredcellswithmultipledifferentiationpotential.Mesenchymalstemcellscanbeinducedtodifferentiateinvitrointoadipocytes,isadipocytedifferentiationinvitrostudiesthemostwidelyusedcelllines.AboutSGAmousebonemarrowmesenchymalstemcellsinvitrostudyless.MechanismSGAcauseweightgaincanhelpguidethedesignofclinicalmedicineandnewtreatmentstoreducethesideeffectsofthesedrugs.Objectives1.TodiscusstheinfluenceofolanzapineandclozapinetoproliferationandadipogenicdifferentiationinmiceBMSCs.2.ToexplorethemechanismolanzapineandclozapinetoproliferationandadipogenicdifferentiationinmiceBMSCs,inordertolaythefoundationforunderstandingSGAsinducedobesityanddiabetespathogenesis.Methods1.Cellculture:BMSCsusingsugarDMEM+10%FBSwerecultured,whencellfusionreaches80~90%,accordingto1:2or1:3ratioforpassage.2.Cellsinduce:①Adipogenicinduction:First,containing10mg/Linsulin,0.54 新乡医学院硕士学位论文mmol/LIBMX,1.0μmol/Ldexamethasone,10%andfetalbovineserumDMEMlowglucosemedium(adipogenicmedium)culturedcellsfor2days.Subsequentlythemediumwasreplacedbycontaining10mg/Linsulin,10%DMEMlowglucosemediumfetalbovineserum,andchangedforonceevery2dayuntilmaturation;②Addaseriesofconcentrationsofsecondgenerationantipsychoticsintoittoinduce.③BothadipogenicmediumandthedrugwasaddedtosimultaneouslyinduceBMSCs.3.Inordertomeasuretheinfluencecausedbydifferentconcentrationsofolanzapineandclozapineoncellproliferation,MTTassayandcellcountingmethodwereused,andselecttheappropriateconcentrationofolanzapineforsubsequentexperiments.4.OilredOstaining,Westernblotting,qRT-PCRwereusedtodetecteffectsofolanzapineonadipogenicdifferentiationanditsmechanism.Results1.MTTassayandcellcountingresultsshowedthathighconcentration(80μMand100μM)ofolanzapineandclozapineinhibitedthegrowthofcellsandtheminimaltoxicitywas20μmol/Lolanzapineandclozapine.2.TheOilRedOstainingshowedthattheleveloffatcellsdropsintheexperimentalgroupwassignificantlyhigherthancontrolgroupafteraddingolanzapine;HowevertheleveloffatcellsdropsintheMDI+olanzapinegroupandMDI+clozapinegroupwassignificantlyreducedthanMDIgroup.3.Whentheolanzapinewasusedalone,westernblotshowedthattheexpressionleveloffatdifferentiationmarkergeneandproteinαp2andC/EBPincreased36%(P<0.01)and25%(P<0.05)respectively,whichhadthestatisticalsignificance;whentheclozapinewasusedalone,theexpressionlevelofC/EBPβandαP2proteinincreased35%(P<0.01)and25%(P＞0.05)respectively,sotheformerhadthestatisticalsignificance,thelaterwasnotsignificant,anddidnothavethestatisticalsignificance;whenboththeMDIandolanzapinewereused,theexpressionlevelofC/EBPβandαP2proteinintheMDI+20μMgroupwasdecreasedthantheMDIgroup,besidesgrayvalueanalysisshowedthedifferencewassignificant;whenboththeMDIandclozapinewereused,theexpressionlevelofC/EBPβandαP2proteininthe5 新乡医学院硕士学位论文MDI+20μMgroupwasdecreasedthantheMDIgroup.4.Whentheolanzapinewasusedalone,theresultsofRT-qPCRshowedthattheexpressionlevelsofadipogenicgenesLeptin,C/EBPαandTnf-αsignificantlyincreasedthanthecontrolgroup,increasedabout68%（P<0.001）、79%（P<0.01）and60%（P<0.01）respectively.Whentheclonzapinewasusedalone,theexpressionlevelsofadipogenicgenesPPARγ,LeptinandTnf-αsignificantlyincreasedthanthecontrolgroup,increasedabout52%（P<0.01）、66%（P<0.05）、65%（P<0.05）respectively,whichhadthestatisticalsignificance;WhenboththeMDIandolanzapinewereused,theexpressionlevelsofadipogenicgenesLeptin,C/EBPαsignificantlydecreasedthantheMDIgroup,decreasedabout65%（P<0.01）、84%（P<0.05）respectively.however,heexpressionlevelsofTnf-αincreasedthantheMDIgroup.WhenboththeMDIandclozapinewereused,theexpressionlevelsofadipogenicgenesLeptin,significantlydecreasedthantheMDIgroup,decreasedabout50%（P<0.001）.TheexpressionlevelsofTnf-αandC/EBPαincreasedthantheMDIgroup,anddidnothavethestatisticalsignificance.5.Whentheolanzapinewasusedalone,theresultsofwesternblotshowedthattheexpressionlevelsofp-Aktsignificantlyhigherthanthecontrolgroup,theexpressionofGSK-3βwiththeincreaseofp-Aktexpressiongraduallyreduced.TheexpressionlevelsofαP2andC/EBPβwereinhibitedafterBMSCswerepretreatedwithPI3K/Aktinhibitor(LY294002),OilredOstainingresultsalsoshowedfatdropletsincellsalsodecreasedsignificantly.WhenMDIandclozapinetogether,,theexpressionlevelsofp-AktlowerthantheMDIgroup,andtheexpressionofitsupstreamanddownstreamp-IRSandp-GSK-3βalsohaschanged.Wherein,p-Aktandp-IRSexpressionthanMDIgrouphavecomedown,andwiththeincreasingconcentrationgraduallyreduced.Theexpressionofp-GSK-3βwiththeolanzapineconcentrationincreasedandincreased.Conclusions1.OlanzapineandclozapinecanpromoteBMSCsadipogenicdifferentiation,andthepromotingeffectofolanzapineisstrongerthanclozapine.Olanzapinecanactivate6 新乡医学院硕士学位论文PI3K/AktsignalingpathwaybyincreasingthelevelofAktphosphorylationtopromoteadipogenicdifferentiationofBMSCsinmice.2.ComparedwiththesingleuseMDI,MDIrespectivelywitholanzapineandclozapinecombinedaction,inhibitsadipogenicdifferentiationofmouseBMSCs.WhenMDIandolanzapinetogether,insulinsignalingpathwayisinhibited,itmayleadtoinsulinresistance,thespecificmechanismneedsfurtherstudy.Keywords:Olanzapine;Clozapine;Secondgenerationantipsychoticdrugs;Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells;Adipocytedifferentiation;AKTsignalingpathway7 新乡医学院硕士学位论文前言过去十几年以来，服用精神药物所致体重增加日益受到关注。体重增加是服用抗精神病药常见的不良反应，也是影响患者服药依从性、社会功能恢复的重要因素之一。当精神药物致体重增加至超重或肥胖时，可引发多种疾病的产生，从而增加病死率。抗精神病药分为第一代抗精神病药（Firstgenerationantipsychotics,FGA）和第二代抗精神病（Secondgenerationantipsychotics,SGA）。第一代抗精神病药主要有氯丙嗪、氟哌啶醇、舒必利、氯普噻吨等。其作用机制主要是阻断中枢神经系统多巴胺通路中的多巴胺受体而发挥其抗精神病作用。第二代抗精神病药包括氯氮平、利培酮、奥氮平、奎硫平、阿立哌唑、齐拉西酮等。其作用机制除了对多巴胺系统有抑制作用，还对5-HT系统有明显的抑制作用[8]。第二代精神病药物在治疗精神分裂症的阳性和阴性症状上与第一代精神病药物相比有很大的优势[1,2]。研究已证实了第二代抗精神病药物相对于第一代抗精神病药，有较高的临床功效，诱导锥体外系症状的风险也较低，很少有导致迟发性运动障碍的倾向[9,10]。此外，这些药物越来越多地被用到其他精神疾病的治疗，如精神障碍，孤独症和抑郁症等[3,4,5]。SGA的疗效明显优于FGA，但体重增加和代谢异常是一些二代抗精神病药物(SGA)临床应用过程中伴随出现的副作用。在引起体重增加的抗精神病药物中，氯氮平和奥氮平对体重影响最大，利培酮和喹硫平影响中度且没有剂量依赖性，而阿立哌唑和齐拉西酮和阿立派唑对体重的影响最小，但其具体的作用机制还不是十分清楚[11]。中枢神经系统在调节食物消耗，肥胖，血脂异常和糖尿病上起着关键作用[12]。然而，对于代谢失调，外周器官也有很大作用。有研究表明抗精神病药物可以通过作用于外周组织（主要指脂肪组织）促进体重和肥胖的增加[13]。更具体地说，第二代抗精神病药物可以直接影响大鼠的成熟脂肪细胞，造成三酸甘油酯的积累，从而使脂肪合成增加，已经证明氯氮平和奥氮平可以增加小鼠前脂肪细胞以及脂肪细胞的脂肪生成[14,15]，尤其是在那些位于内脏的白色脂肪组织。尽管在人类身上的研究数量有限，所获得的结果与小鼠模型是相似的。其他的研究也探索了一些SGA在外周组织参与机体能量平衡的生物学上有直接的影响。徐晓津等[16]的研究表明氯氮平能够影响外周组织细胞对葡萄糖的吸收和利8 新乡医学院硕士学位论文用，降低外周组织上葡萄糖转运蛋白GLUT4的表达，而利培酮对糖代谢的影响没有氯氮平明显，两者机制可能不同。与肥胖有关的白色脂肪组织的增加可能是两方面的作用：完全分化的脂肪细胞中脂质的积聚增大了脂肪细胞的体积，脂肪祖细胞的增殖和成脂分化增加了脂肪细胞的数目[17]。最近的报告表明，特定的SGA对成熟大鼠内脏白色脂肪组织中的脂肪细胞有直接作用，能够使其脂肪合成增加和减少脂肪分解，促进脂肪细胞脂质贮积[18,19]。此外，有人提出，SGA的氯氮平和奥氮平能够刺激小鼠前脂肪细胞系3T3-L1的脂肪形成[20,21]。目前，在国内外SGA与肥胖相关的细胞生物学研究中，SGA与骨髓间充质干细胞（BMSC）的增殖、分化及成熟相关的研究较少。骨髓间充质干细胞（bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs）是最早发现并在科研和临床研究中常用的成体干细胞之一。它容易分离，在体外具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在不同培养条件下能向脂肪、心肌、软骨、骨、神经和骨骼肌等多种方向分化[22]。BMSCs在体外分化为脂肪细胞是一个复杂的多基因调控过程，多种转录因子和信号通路在脂肪细胞的形成过程中发挥着重要的作用。在众多调控脂肪分化的转录因子中，过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma,PPARγ）[23]和CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancerbindingproteinbeta,C/EBPβ）发挥着关键作用，被称为脂肪细胞分化的主效基因。它们能够促进下游在脂质积累及脂代谢发挥重要作用的酶及功能蛋白质的表达[24]，如脂蛋白脂酶（lipoproteinlipase,LPL），脂肪酸结合蛋白4（fattyacidbindingprotein4,Fabp4,αP2）和脂肪酸结合酶（fattyacidsynthesis,FAS）等。间充质干细胞可以分化为脂肪前体细胞，进而分化发育为成熟的脂肪细胞。因此，探讨间充质干细胞分化为脂肪细胞的机制，可为防治肥胖的发生提供新的思路。骨髓间充质干细胞的的成脂分化受Wnt及PI3K/insulin等相关信号通路的调控[25]抑制Wnt信号通路可以抑制脂肪前体细胞的成脂分化[26]。抗精神病药物可以激活细胞内与细胞增殖或脂肪分化相关的多种信号途径中的信号分子。已有的研究表明，抗精神病药物可以通过ERK/MAPK[27]和Akt/GSK-3β[28]信号途径上调多巴胺D2受体的表达。9 新乡医学院硕士学位论文本文从小鼠骨髓间充质干细胞的多潜能特性出发，尝试将第二代抗精神病药物（包括氯氮平、奥氮平）作用于骨髓间充质干细胞（BMSCs），观察这些药物对小鼠BMSCs细胞脂肪分化及脂肪代谢的影响；并进一步探究第二代抗精神病药物对小鼠BMSCs脂肪分化过程中PI3K/Akt相关信号通路的作用机制，尝试为临床应用中预防肥胖及糖尿病的发生奠定理论基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1骨髓间充质干细胞来源骨髓间充质干细胞由本课题组冯志伟等分离培养的15代以内的细胞。其流式检测结果显示细胞表面标记物CD73、CD105、CD90呈阳性表达，而不表达造血干细胞标志物CD34、CD51和CD45，并且体外诱导分化实验表明分离的BMSCs能够向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞方向分化。1.1.2仪器名称来源细胞培养箱Thermo公司ZHJH-C1112B型超净工作台上海智城分析仪器制造有限公司SC-5A恒温水浴锅无锡沃信仪器有限公司PICO17型常温高速离心机Thermo公司BIOFUGEPRIMOR低温低速离心机Thermo公司瞬时离心机上海创奕科教设备有限公司TGL21M低温高速离心机长沙湘智离心机仪器有限公司振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司QL-90型漩涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限公司TS100型倒置显微镜日本尼康公司C-SHG1型倒置荧光显微镜带成像系统日本尼康公司通风橱中国山木实验设备公司10 新乡医学院硕士学位论文TS-100型脱色摇床海门市其林贝尔仪器制造有限公司QB-206型多用途旋转摇床海门市其林贝尔仪器制造有限公司电泳仪Bio-Rad公司蛋白电泳槽Bio-Rad公司转膜槽Bio-Rad公司PCR仪Biometra公司7500型实时荧光定量PCR仪美国ABI公司FE20pH计梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司IT-09B5型磁力搅拌器上海创奕科教设备有限公司电磁炉美的公司微波炉美的公司BSH1002-E型双模块数显干式恒温器美国Benchmark公司电子分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械有限公司101-3AB型电热鼓风干燥箱北京中兴伟业仪器有限公司恒温培养箱/干燥箱上海智城分析仪器制造有限公司MULTISKANGO酶标仪Thermo公司低温低速离心机Thermo公司凝胶成像系统Uvitec公司Forma902型-80℃超低温冰箱Thermo公司1.1.3试剂表1主要试剂信息表Table1.Mainreagentinformation名称来源DMEM低糖培养基干粉Gibco公司胎牛血清（FBS）Gibco公司胰蛋白酶Gibco公司11 新乡医学院硕士学位论文青链霉素上海碧云天生物技术有限公司细胞裂解液上海碧云天生物技术有限公司蛋白酶抑制剂（PMSF）上海碧云天生物技术有限公司BCA试剂盒上海碧云天生物技术有限公司山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体北京中杉金桥生物技术有限公司兔抗山羊IgG/辣根酶标记抗体北京中杉金桥生物技术有限公司小鼠β-Actin单克隆抗体北京中杉金桥生物技术有限公司羊抗兔IgG-HRPBOSTER公司鼠单克隆抗体C/EBPβCellSignaling公司羊单克隆抗体αP2CellSignaling公司兔单克隆抗体p-AktCellSignaling公司兔单克隆抗体AktCellSignaling公司兔单克隆抗体LPLSigma公司特异性阻断剂LY294002Sigma公司二甲基亚砜（DMSO）伊利公司高蛋白脱脂高钙奶粉北京鼎国昌盛生物技术有限公司PBS（细胞级）Thermo公司ECL发光试剂盒（增强型）Thermo公司Trizol试剂Thermo公司逆转录试剂盒Abm公司实时荧光定量PCR试剂盒Bio-Rad公司预染蛋白质markerBio-Rad公司油红O北京鼎国昌盛生物技术有限公司Tween-20北京索莱宝科技有限公司地塞米松北京索莱宝科技有限公司胰岛素北京索莱宝科技有限公司IBMX北京索莱宝科技有限公司12 新乡医学院硕士学位论文Tris北京鼎国昌盛生物技术有限公司甘氨酸北京索莱宝科技有限公司TEMED上海生工生物工程股份有限公司丙烯酰胺上海生工生物工程股份有限公司甲叉双丙烯酰胺上海生工生物工程股份有限公司NaCl天津市德恩化学试剂有限公司1.1.4主要试剂配制（1）DMEM低糖培养基：取低糖DMEM培养基干粉一袋，溶于800mL三蒸水中，按1000mL添加3.7gNaHCO3和1.2g羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），用磁力搅拌器搅拌混匀后定容至1L，调pH值为7.2~7.4，直径0.22μm的滤膜过滤除菌，4ºC保存。（2）D-Hank’s溶液（无钙、镁的Hank’s溶液）：称取NaCl8g，KH2PO40.06g，酚红0.02g，KCl0.4g，NaHCO30.35g，Na2HPO4·H2O0.06g，加三蒸水至1000mL，磁力搅拌器搅拌混匀，0.22μm滤膜过滤。（3）0.25%胰酶：胰蛋白酶粉0.25g，加入D-Hank’s溶液100mL，磁力搅拌器搅拌，待完全溶解后，过滤除菌，调整PH值至7.2～7.4，分装密封，-20ºC保存。（4）PBS缓冲液：称取KCl0.20g，NaCl8.13g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.25g，加入800mL去离子水充分溶解，使用HCl或NaOH调pH值为7.2～7.4，加水定容至1L。（5）0.02%EDTA溶液：称取0.2gEDTA，加入1000mLD-Hank’s溶液，搅拌溶解，高压蒸汽灭菌，使用前调pH值为7.2～7.4，4ºC保存。（6）TBE电泳缓冲液：称取10.8gTris，0.744gNa2EDTA，5.5g硼酸，置于1L烧杯中，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。加去离子水定容至1L后，室温保存。（7）1‰的DEPC水：将1mLDEPC加入1000mL双蒸水中，搅拌过夜。（8）5×Tris-Glycine缓冲液：称取94g甘氨酸，15.1gTris，5.0gSDS，溶于800mL的去离子水中，搅拌溶解，最后加水定容至1L，室温保存。13 新乡医学院硕士学位论文（9）30%丙烯酰胺：称取2.5g甲叉双丙烯酰胺，72.5g丙烯酰胺，溶于150mL去离子水中，定容至250mL，用0.45μm的滤纸滤去杂质，盛于棕色瓶中，4℃保存。（10）10%过硫酸铵：称取0.1g过硫酸铵，加入1mL去离子水，摇晃至完全溶解，储存于4ºC。（11）5×SDS-PAGELoadingBuffer：量取2.5mL甘油，1.25mL1MTris-HCl（pH6.8），称取0.5gSDS，25mg溴酚蓝（BPB），加入去离子水溶解后定容至5mL。分装（1mL/份）后保存于室温，使用前每毫升加入50μL的β-巯基乙醇。（12）考马斯亮蓝R-250染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250于1L烧杯中，加入100mL冰醋酸、250mL异丙醇、650mL去离子水，搅拌均匀，用滤纸除去颗粒物质后，室温保存。（13）考马斯亮蓝染色脱色液：量取100mL醋酸、10mL甲醇于1L烧杯中，加入850mL去离子水充分混匀，室温保存。（14）TBST缓冲液：量取1MTris-HCl(pH8.0)于1L烧杯中，称取8.8gNaCl，再加入800mL去离子水充分溶解，随后加入1mLTween20后充分混匀，加去离子水定容至1L，调pH值为7.2~7.4，4ºC保存。（15）5%的脱脂奶粉：称量1g脱脂奶粉，加入20mLTBST缓冲液，充分溶解，4℃保存。（16）湿转缓冲液：天平称量Tris3.03g、甘氨酸14.4g于1L烧杯中，加入800mL去离子水，磁力搅拌器搅拌溶解后加入甲醇100mL，再加水定容至1L。（17）丽春红染液：取1mL丽春红试剂，按1:10比例加入去离子水9mL，4ºC保存。（18）1MTris-HCl溶液：称取12.1gTris于烧杯中，加入80mL去离子水搅拌溶解，用浓HCl调整pH值为6.8，用去离子水定容至100mL后保存于室温。（19）10%SDS溶液：称取10gSDS于100mL烧杯中，加入80mL去离子水，水浴锅68℃加热溶解，滴加浓HCl调节pH值为7.2，将溶液定容至100mL后，室温保存。（20）1.5MTris-HCl溶液：称取18.2gTris于100mL烧杯中，加80mL去离子水搅拌溶解，用浓HCl调节pH值至8.8，将溶液定容至100mL后保存于室温。14 新乡医学院硕士学位论文（21）油红O染液：称取0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，混匀，然后加异丙醇至100ml，棕色瓶密封4℃保存，为储存液，可长期保存。用时与三蒸水以3:2混匀，定性滤纸过滤，稀释后数小时内用完。（22）成脂诱导培养基：将IBMX、地塞米松、胰岛素加入到10%胎牛血清的DMEM低糖培养基中，使其终浓度分别为0.5mmol/L、1.0µmol/L、10µg/mL，置于4℃保存。（23）4%多聚甲醛溶液：称取多聚甲醛40g于1L烧杯中，加入900mLPBS溶液，60℃水浴加热，待完全溶解后，调pH值至7.2～7.4，然后定容至1L，4℃统一用插入的单位符号保存。（24）4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加适量蒸馏水研磨，加双蒸水定容至100mL，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4%。1.2实验方法1.2.1BMSCs的培养本实验用细胞为课题组冯志伟等分离培养的小鼠BMSCs，其流式检测结果细胞表面标记物CD73、CD105和CD90阳性，造血干细胞表面标记物CD31、CD34和CD45阴性，并且体外诱导分化实验表明分离的BMSCs能够向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞方向分化。将BMSCs按照1×106/cm2密度接种在培养瓶内，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，当细胞接近90%融合时，弃培养液，PBS溶液冲洗细胞两次，0.25%的胰蛋白酶（pH7.4）消化细胞，加入新鲜的培养基重悬细胞，按1:2～1:3比例传代，倒置显微镜下观察细胞形态及生长变化。以后每3～4天进行传代培养。1.2.2骨髓充质干细胞的冻存与复苏待细胞密度达到80%～90%后，显微镜下观察细胞生长状态，取对数生长期的细胞，弃去培养基，PBS洗涤细胞两次，EDTA洗涤一次，加入1mL0.25%的胰酶消化2～3min，之后添加10倍体积的新鲜的生长培养基终止消化。用移液器反复吹打瓶底至细胞完全脱落，制成细胞悬液，吸入离心管中，1500转，离心5min；弃上清，加入冻存液（血清和DMSO按9:1的比例混合）重悬细胞沉淀，转移至冻存管中，分别置于4ºC，30min；-20℃，60min；-80℃过夜，后放入液氮罐中进行冻存。复苏细胞时，从液氮罐中取出一管小鼠BMSCs（P3～P5），置于37℃恒温水浴15 新乡医学院硕士学位论文锅中晃动使其迅速融化，无菌条件下将细胞吸至25cm2培养瓶中，添加4～5mL低糖DMEM培养液，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，4～6h细胞贴壁后换液培养。1.2.3诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化取生长状态良好的小鼠BMSCs按1×106/mL的密度铺于6孔板上，待细胞100%融合并接触抑制2d后，用经典的鸡尾酒法进行脂肪诱导分化，首先用含有10mg/L胰岛素、1.0µmol/L地塞米松、0.5mmol/LIBMX和10%胎牛血清的DMEM低糖培养基培养细胞2d，随后换成含10mg/L胰岛素、10%胎牛血清的DMEM低糖培养基，每2d换一次液直到分化成熟。1.2.4细胞计数和台盼蓝染色观察小鼠骨髓间充质干细胞增殖情况吸出培养基，用无菌PBS洗细胞3次加入1ml0.25％的胰蛋白酶溶液，置于培养箱内消化1-3min。显微镜下观察细胞是否脱壁，可用手拍打细胞使其脱落。迅速加入适量培养基终止消化，用吸管吹打均匀。稀释适当倍数后，取适量到载玻片上，加入0.4%台盼蓝溶液，使细胞培养液：台盼蓝溶液=9:1（体积比）。取10μL加入到细胞计数板中。注意不要有气泡产生。显微镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞则呈无色透明状。计数（计数四角大方格内的细胞总数。压线的细胞只计数上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数）。1.2.5MTT比色法测定不同浓度的奥氮平对BMSCs增殖的影响培养细胞至对数期，胰酶消化细胞后进行计数，调整细胞浓度为5×104/mL，每孔200μL铺于96孔板。细胞培养箱内培养24h后，弃培养基换加药培养基。另设阴性对照，即含相同浓度的DMSO的完全培养基。每个浓度以及对照分别设置5个复孔。置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养72h，每孔加入10μL5mg/mL的MTT，于培养箱中继续孵育4h后，取出96孔板，吸去液体，每孔加入150μLDMSO混匀，置摇床上低速振荡10min，用酶标仪测490nm波长下的吸光值，计算细胞增殖率。16 新乡医学院硕士学位论文1.2.6油红O染色观察奥氮平对BMSCs成脂分化的影响将生长良好的小鼠BMSCs(P3-P10)铺至6孔板中，贴壁并长满后加入20μM应前后一致，是否都把mol/L改为M？奥氮平，对照组为正常BMSCs。每2d换一次液，期间观察细胞形态变化，加药14d后，弃去培养基，37℃温育的PBS洗细胞3次，再用4%多聚甲醛室温下固定1h，随后再用PBS洗3次，最后用油红O工作液37℃孵育30min，之后弃掉油红O工作液，用双蒸水洗细胞3次，用75%酒精快速漂洗一次，显微镜下观察、照相。每孔中加入等量100%异丙醇进行油红O萃取，用酶标仪测490nm处吸光度。1.2.7Westernblotting检测脂肪分化标志基因蛋白的表达将生长良好的小鼠BMSCs(P3-P10)铺至6孔板中，贴壁并长满后加入20μM奥氮平，对照组为正常BMSCs。每2d换一次液，收获第3d的细胞，使用提前4℃预冷的PBS轻洗细胞两次，每孔加入80~100μL细胞裂解液，冰上裂解细胞30min后用细胞刮刮取细胞，反复吹打收集至1.5mLEP管中，12000g/min4℃离心10min，取上清，测蛋白质浓度，Westernblotting检测脂肪分化标志基因蛋白的表达情况。（a）SDS-PAGE凝胶蛋白质电泳：测定蛋白质浓度后，根据标准曲线计算出各样品上样10μg或20μg时所需的体积，按4:1的比例加入5×Loadingbuffer混匀，100℃沸水煮5min；按照SDS-PAGE凝胶配方表配制12%的SDS-PAGE凝胶，将蛋白marker和蛋白样品依次上样，顺序为：M(蛋白marker)、BMSCs和20μM奥氮平诱导3d的BMSCs，进行SDS-PAGE凝胶蛋白电泳；接通电源，调节电压为80V，运行15min，蛋白marker跑出浓缩胶后暂停，调节电压为120V，继续电泳；根据目的蛋白的分子量和蛋白Marker的电泳情况，适时关闭电源，终止电泳；（b）转膜：电泳结束后，根据目的蛋白条带所在的位置，用切胶板将胶切割成合适大小并量取长、宽，放入湿转液中，同时将湿转所用的海绵、滤纸也浸泡于湿转液中；根据所量胶的大小裁剪适当大小的PVDF膜，先放入甲醇中浸泡1min再放入湿转转膜Buffer中；在湿转板负极与正极之间依次放上海绵、三层滤纸、切好的胶、PVDF膜、三层滤纸和海绵，避免胶和膜之间产生气泡（气泡会影响蛋白质的转膜质量），按正负极放入湿转槽，槽中同时放入一块冰袋，并加满湿转液，接通电源，调节电流17 新乡医学院硕士学位论文为390mA，转膜1h30min；（c）封闭：电子天平称取1g脱脂奶粉，溶于20mLTBST中配成质量分数为5%的脱脂牛奶，将转好的PVDF膜放入牛奶中进行抗原封闭，4℃过夜或室温摇床上封闭1.5h；（d）孵育一抗：封闭结束后，将PVDF膜置于TBST缓冲液中，接下来用TBST溶液稀释的含质量分数为5%的脱脂牛奶稀释来源于小鼠的β-actin抗体（稀释比例为1:2,000）和来源于兔的C/EBPβ单克隆抗体（稀释比例为1:1,000）以及来源于羊的αP2单克隆抗体（稀释比例为1:1,000），将稀释好的抗体加到膜上（抗体需完全覆盖所裁剪的PVDF膜）分别孵育相对应的抗原，4℃过夜或室温360度摇床上孵育2h；（e）洗膜：回收一抗，将一抗孵育后的PVDF膜放入TBST缓冲液中，放在水平脱色摇床上进行洗涤（设置一定的转速，转速不可太快），每次10min，洗涤3次；（f）孵育二抗：用TBST溶液稀释的含质量分数为5%的脱脂牛奶分别稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体、兔抗山羊IgG/辣根酶标记抗体和羊抗兔IgG-HRP（稀释比例均为1:2,000），分别孵育β-actin、αP2和C/EBPβ一抗孵育过的PVDF膜，室温孵育1h。注：二抗孵育的时间不宜过长，以免造成膜的背景不干净。由于叠氮钠能抑制HRP的活性，所以HRP标记的二抗稀释液中不能添加叠氮钠；（g）洗膜：回收二抗，使用TBST洗涤孵育过二抗的PVDF膜3次，每次10min；（h）显色：用ECL发光试剂进行化学发光，将A液与B液以1:1的比例混合，均匀涂在PVDF膜上，在western曝光仪上进行曝光，观察实验结果并存储图片。用专业软件ImageJ1.48(NIH，美国)进行灰度分析。1.2.8实时荧光定量PCR检测成脂相关基因的表达（1）细胞总RNA的提取（a）将生长状态良好的小鼠BMSCs铺至6孔板中，对照组为正常BMSCs，实验组为加入20μM奥氮平的BMSCs，继续培养3d后弃去培养液，PBS轻洗细胞两次，每孔加入1mLTRIzol，枪头反复吹打充分裂解细胞，转移至1.5mLEP管中，室温放置5min，目的是分离核酸与核蛋白；（b）每毫升TRIzol中加入0.2mL氯仿，上下颠倒剧烈晃动15s，室温静置5min，18 新乡医学院硕士学位论文此时样品分为三层：下层有机相（蛋白质）、中间层白色絮状物（DNA）和上层水相（RNA），将其置于离心机中12,000rpm，4℃，离心15min；（c）吸取上层水相至一新的1.5mLEP管中（不要吸取中间层絮状物，否则会出现染色体DNA污染），加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；（d）12,000rpm，4℃，离心10min；（e）弃上清，沿管壁加入1mL75%乙醇（无水乙醇与DEPC水以3:1的体积比现配现用）洗涤沉淀，振荡器混匀，7,500rpm，4℃，离心5min，弃去上清；（f）室温干燥沉淀5min（使乙醇挥发，但不能完全干燥RNA，否则会很难溶解），加入适量（30µL）DEPC水溶解RNA沉淀，可用枪头轻轻吹打促进RNA的溶解，随后将RNA样品置于冰上，测各组RNA样品在260nm和280nm处的吸光值，并计算A260/A280的值，结果均为2.0左右，说明RNA纯度良好，同时计算各组RNA样品浓度，将RNA放置于−80℃超低温冰箱中备用。（2）合成cDNA第一条链（a）将5×All-In-OneRTMasterMix、各组RNA样品及RNase-FreeWater置于冰盒上备用；（b）根据之前所测RNA样品浓度，计算出各组RNA样品均加2µg时的体积，按如表2所示配制20µL反应体系；注：实验中RNA提取和反转录所用实验耗材如PCR管、离心管、枪头等均经过DEPC水浸泡处理，以隔绝RNA酶对RNA的降解作用。实验操作过程中必须戴口罩、勤换手套。表2：反转录反应体系Table1:Thereversetranscriptionreactionsystem试剂体积（µL）RNA样品（2µg）可变RNase-FreeWater可变19 新乡医学院硕士学位论文5×All-In-OneRTMasterMix4Total20（c）反转录程序设置如表3所示：表3：反转录程序的设置Table2:SettingofRTprocedure步骤温度时间25℃10min合成42℃50min灭活85℃5min保存4℃该步骤合成的cDNA可在-80℃超低温冰箱中长期保存。（3）qPCR扩增成脂相关基因Leptin、C/EBPα和Tnf-α、GAPDH、PPARγ各基因qPCR扩增所用引物序列如表4所示：表4：qPCR中用到的引物序列Table3:PrimersequencesusedforqPCRGenePrimerSequenceLeptinForward5’-AGTTCCTGGCCGACCTCTT-3’Reverse5’-CTCTTGTTTGCTCACCAGCG-3’C/EBPαForward5’-TCACACTCACAAACCACCAAG-3’Reverse5’-AGATAGCAAATCGGCTGACG-3’Tnf-αForward5’-ATGTGCTGGAGACCCCTG-3’Reverse5’-TGCCAGAGTCTGGTCCATCT-3’GAPDHForward5´-GACTTCAACAGCAACTCCCA-3´Reverse5´TGGGTGGTCCAGGGTTTCTT-3´PPARγForward5’-CTGTTGGCGGAGATCTCCAG-3’Reverse5’-CTGCAGGGGGGTGATATGT-3’引物由北京金唯智生物科技有限公司合成，用超纯水稀释为10µM。20 新乡医学院硕士学位论文（a）qPCR反应体系的配制，如表5所示：表5：qPCR反应体系的配制Table4:PreprationofqPCRreactionsystem试剂体积（µL）AceQTMqPCRSYBRGreen-MasterMix5ROXReferenceDye20.2Primer1（10µM）0.2Primer2（10µM）0.2模板DNA1灭菌水3.4Total10（b）qPCR反应程序设置，如表6所示：表6：qPCR反应程序的设置Table5:SettingofqPCRreactionsystem步骤温度时间循环数预变性95℃5min变性95℃10s40退火延伸60℃60s在ABI7500实时荧光定量PCR仪上设定程序，基因相对表达量用2-ΔΔCt法计算，以小鼠GAPDH作为内参基因。1.2.9统计学处理采用SPSS17.0统计学软件进行数据处理。数据以均数±标准差(Mean±SD)形式表示，各组间观察指标比较采用单因素方差分析和最小显著差法，检验水准α值取双侧P＜0.05。21 新乡医学院硕士学位论文2结果2.1奥氮平、氯氮平对细胞增殖的影响2.1.1MTT法测不同浓度的奥氮平、氯氮平对细胞增殖的影响采用MTT比色法测定不同浓度的奥氮平、氯氮平对细胞增殖的影响，细胞计数后均匀铺至96孔板，贴壁后，分别用1μM、10μM、20μM、40μM、80μM和100μM的奥氮平、氯氮平处理细胞72h，以DMSO处理的BMSCs作为对照组。如图1所示，从图A可以看到，与对照组相比，1μM~40μM的奥氮平对细胞的增殖有促进作用，其中20μM奥氮平促进作用最明显，而80μM和100μM的奥氮平抑制了细胞的生长，相差显微镜观察，有部分细胞死亡。从图B可以看到，与对照组相比，1μM~20μM的氯氮平对细胞的增殖有促进作用，其中20μM氯氮平促进作用最明显，而40μM、80μM和100μM的氯氮平抑制了细胞的生长，相差显微镜观察，有部分细胞死亡。图1.不同浓度奥氮平、氯氮平对细胞增殖的影响A.不同浓度的奥氮平处理BMSCs72h后的MTT结果，与对照组比较，*p<0.05；B.不同浓度的氯氮平处理BMSCs72h后的MTT结果。Fig.1TheeffectsofolanzapineandclozapineoncellproliferationindifferentconcentrationsA.TheresultsofMTTafterBMSCsweretreatedwitholanzapine72hindifferentconcentrations.22 新乡医学院硕士学位论文*p<0.05comparedwiththecontrolgroup.B.TheresultsofMTTafterclozapinetreatmentBMSCs72hindifferentconcentrations.2.1.2细胞计数法测药物对细胞增殖的影响培养小鼠骨髓间充质干细胞，传代时按照1×106/cm2的密度接种于12孔板中。每组3个复孔，待细胞密度达到90%后，胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，进行细胞计数，未消化的细胞加入20μM奥氮平和20μM氯氮平。分别在0d、3d、5d、7d、10d、14d消化细胞，台盼蓝染色，除去染上蓝色的死细胞，进行计数，并绘制生长曲线，观察奥氮平和氯氮平对细胞增殖的影响，如图2所示。从生长曲线的趋势可以看出，20μM奥氮平和20μM氯氮平在细胞生长的5d-14d期间也没有表现出对细胞的毒性作用。可以用此药物浓度进行之后的实验。图2.加入奥氮平、氯氮平0-14天的BMSCs生长曲线A.胰酶消化细胞后经台盼蓝染色图，标尺示100μm。B.加入20μM奥氮平和氯氮平后，分别在第1d、3d、5d、7d、10d、14d消化细胞，计数并制作生长曲线。Fig.2GrowthcurveofBMSCsintherangeof0-14daysafteraddingolanzapineandclozapineA.Thepictureoftrypsindigestioncellsthatstainedbytrypanblue,bar=100μm。B.Afteradditionof20μMolanzapineandclozapine,respectivelyatthefirstday,3days,5days,7days,10days,14daystocountthenumberofdigestivecellsandmadethegrowthcurve.2.2油红O染色观察奥氮平、氯氮平对BMSCs成脂分化的影响细胞生长至密度达90%后，进行诱导，对照组不作处理，实验组分别加入成脂诱导培养基（MDI，含有0.5mmol/LIBMX、1.0µmol/L地塞米松、10µg/mL胰岛素、23 新乡医学院硕士学位论文10%胎牛血清的DMEM低糖培养基），20μM奥氮平和20μM氯氮平，继续培养。其间每两天换一次液，分别在培养7d、14d后对细胞进行油红O染色，相差显微镜下观察、照相（图3）。图3.BMSCs成脂分化后的油红O染色结果A.未作任何处理的BMSCs，以及加入MDI、奥氮平和氯氮平之后继续培养7d、14d后经油红O染色的BMSCs，标尺示100μm；B.BMSCs分别加入MDI、奥氮平、氯氮平继续培养7d后，异丙醇萃取油红O的定量结果，与对照组比较，**P<0.01；C.BMSCs加入MDI、奥氮平、氯氮平继续培养14d后，异丙醇萃取油红O的定量结果，与对照组比较，**P<0.01，***P<0.001.Fig.3TheresultofadipogenicdifferentiationofBMSCsafterstainedbyoilredOA.NormalBMSCs,andtheBMSCswiththeadditionofMDI,olanzapineandclozapinethatcultured7d,14dandthenstainedbyoilredO,Bar=100μm;B.AfterBMSCswhichseparatelyaddedMDI,olanzapine,clozapineandcultured7d,withthequantitativeresultsofOilRedOthatextractedwith24 新乡医学院硕士学位论文isopropanol,thencomparedwiththecontrolgroup,**P<0.01;C.AfterBMSCsseparatelyaddedMDI,olanzapine,clozapineandcultured14d,withthequantitativeresultsofOilRedOthatextractedwithisopropanol,thencomparedwiththecontrolgroup,**P<0.01，***P<0.001.如图所示（图3A），培养7d后染色，发现MDI组细胞中形成了部分脂肪滴，而加入奥氮平和氯氮平的细胞中并未形成脂肪滴。异丙醇萃取结果与此一致（图3B）。培养14d之后，MDI组细胞中形成了大量脂肪滴，细胞分化前成纤维状，分化后细胞变厚，比较脆弱，显微镜下观察可见折光性强的油状透明脂肪滴，油红O染色可将其染成红色，而加入奥氮平和氯氮平的细胞也形成了脂肪滴，但较MDI组明显减少（图3A）。异丙醇萃取结果显示，三组细胞脂肪滴都较对照组明显增加，均具统计学意义（图3C）。两次诱导，对照组均没有形成脂肪滴。从细胞形态观察，奥氮平和氯氮平在诱导一定天数之后，对细胞的成脂分化起到了促进作用。2.3BMSCs脂肪分化标志基因蛋白的表达将BMSCs接种于6孔板中诱导其脂肪分化，实验组分别加入20μM奥氮平、氯氮平，每2d换一次液，收获第3d的细胞，Western印迹分析脂肪细胞分化的标志基因蛋白C/EBPβ和αP2的表达情况（图4，图5）。结果显示，与对照组相比，20μM奥氮平处理3d后的的BMSCsC/EBPβ和αP2蛋白质表达水平分别上升25%(P<0.05)、36%(P<0.01)，均有统计学意义（图4B、C）；20μM氯氮平处理3d后的BMSCs的C/EBPβ和αP2蛋白质表达水平分别上升35%(P<0.01)、25%(P＞0.05)，前者具统计学意义，后者差异不显著，无统计学意义（图5B、C）。以上实验结果表明，从蛋白质水平来讲，奥氮平和氯氮平都促进了小鼠BMSCs的成脂分化，且奥氮平的作用比氯氮平更明显。25 新乡医学院硕士学位论文图4.奥氮平处理后小鼠BMSCs3d后，Western印迹检测C/EBPβ和αP2的表达A:BMSCs加入20μM的奥氮平3d后C/EBPβ和αP2的蛋白表达；B：C/EBPβ表达水平的灰度值分析，与β-Actin对照组比较，*P<0.05；C：αP2表达水平的灰度值分析，与β-Actin对照组比较，**P<0.01。Fig.4TheexpressionlevelsofC/EBPβandαP2byWesternblotafterBMSCsweretreatedwitholanzapinefor3daysA.TheproteinexpressionofC/EBPβandαP2after20μMolanzapinetreatementonBMSCsfor3d;B.HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofC/EBPβasdescribedabove.Resultswerenormalizedbyβ-Actin,*P<0.05;C.HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofαP2asdescribedabove.Resultswerenormalizedbyβ-Actin,**P<0.01;图5.氯氮平处理后小鼠BMSCs3d后，Western印迹检测C/EBPβ和αP2的表达A:BMSCs加入20μM的氯氮平3d后C/EBPβ和αP2的蛋白表达；B：C/EBPβ表达水平的灰度26 新乡医学院硕士学位论文值分析，与β-Actin对照组比较，*P<0.05；C：αP2表达水平的灰度值分析。Fig.5TheexpressionlevelsofC/EBPβandαP2byWesternblotafterBMSCsweretreatedwithclozapinefor3daysA.TheproteinexpressionofC/EBPβandαP2after20μMclozapinetreatementonBMSCsfor3d;B.HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofC/EBPβasdescribedabove.Resultswerenormalizedbyβ-Actin,**P<0.01;C.HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofαP2asdescribedabove.2.4BMSCs成脂相关基因的表达将BMSCs接种于6孔板中诱导其脂肪分化，实验组分别加入20μM奥氮平、氯氮平，每2d换一次液，收获第3d的细胞，提取细胞总的RNA，实时荧光定量PCR分析成脂相关基因PPARγ、Leptin、C/EBPα和Tnf-α的mRNA表达水平（图6，图7）。结果显示，与对照组相比，20μM奥氮平处理3d后的BMSCs的Leptin、C/EBPα和Tnf-αmRNA表达水平分别上升68%（P<0.001）、79%（P<0.01）、60%（P<0.01），均具统计学意义（图6）；20μM氯氮平处理3d后的BMSCs的PPARγ、Leptin和Tnf-α的mRNA表达水平分别上升52%（P<0.01）、66%（P<0.05）、65%（P<0.05），均具统计学意义（图7）。上述实验我们从mRNA水平证明了20μM奥氮平和氯氮平促进了小鼠BMSCs的成脂分化。图6.奥氮平处理3d后，实时荧光定量PCR检测成脂相关基因Leptin、C/EBPα和Tnf-α的mRNA表达水平A:Leptin的实时荧光定量PCR检测结果，与对照组相比，***P<0.001；B:C/EBPα的实时荧光定27 新乡医学院硕士学位论文量PCR检测结果，与对照组相比，**P<0.01;C:Tnf-α的实时荧光定量PCR检测结果，与对照组相比，**P<0.01。实验数据以均数±标准差表示，均来自至少三次独立的实验。Fig.6ThemRNAexpressionlevelsofLeptin,C/EBPαandTnf-αafterolanzapineweretreatedwithBMSCsfor3dA:TheresultsofRT-qPCRdetectionofLeptin,***P<0.001，comparedwiththecontrolgroup.B:TheresultsofRT-qPCRdetectionofC/EBPα,**P<0.01,comparedwiththecontrolgroup.C:TheresultsofRT-qPCRdetectionofTnf-α,**P<0.01,comparedwiththecontrolgroup.Valuesarethemeans±SDofthreedeterminationsfromseparateexperiments.图7.氯氮平处理3d后，实时荧光定量PCR检测成脂相关基因PPARγ、Leptin和Tnf-α的mRNA表达水平A:PPARγ的实时荧光定量PCR检测结果，与对照组相比，**P<0.01；B:Leptin的实时荧光定量PCR检测结果，与对照组相比，*P<0.05;C:Tnf-α的实时荧光定量PCR检测结果，与对照组相比，*P<0.05。实验数据以均数±标准差表示，均来自至少三次独立的实验。Fig.7ThemRNAexpressionlevelsofPPARγ,Leptin,andTnf-αafterclonzapineweretreatedwithBMSCsfor3dA:TheresultsofRT-qPCRdetectionofPPARγ,,**P<0.01，comparedwiththecontrolgroup.B:TheresultsofRT-qPCRdetectionofLeptin,*P<0.05,comparedwiththecontrolgroup.C:TheresultsofRT-qPCRdetectionofTnf-α,*P<0.05,comparedwiththecontrolgroup.Valuesarethemeans±SDofthreedeterminationsfromseparateexperiments.28 新乡医学院硕士学位论文2.5奥氮平通过PI3K/Akt信号通路促进BMSCs的脂肪分化图8.奥氮平通过PI3K/Akt信号通路促进BMSCs脂肪分化A:BMSCs经10μM、20μM、40μM奥氮平处理30min后，western印迹分析p-Akt和p-GSK-3β的表达水平；B:p-Akt表达含量的灰度值分析，与Akt比较，*P<0.05，***P<0.001；C:LY294002预先处理细胞1h，再用20μM奥氮平处理细胞，3d后提蛋白，Western印迹分析C/EBPβ和αP2的表达水平；D:αP2的表达含量灰度值分析，与Actin比较，**P<0.01；E:C/EBPβ的表达含量灰度值分析，与Actin比较，*P<0.05；F:加入20μM奥氮平14d后进行油红O染色，细胞内出现部分油状脂肪滴，LY294002和20μM奥氮平共同作用14d后进行油红O染色，细胞内没有形成脂肪滴，标尺示100μm。29 新乡医学院硕士学位论文Fig.8OlanzapineactivatedsadipogenicdifferentiationofBMSCsviasuppressingPI3K/AktsignalingA:Westernblottingshowstheexpressionofp-Aktandp-GSK-3βafterBMSCsweretreatedwith20μMolanzapinefor30min;B:ThehistogramshowsthewesternblottingquanlificationrelativetoAkt,*P<0.05，***P<0.001,comparedwiththecontrolgroup.C:BMSCswerepretreatedwithPI3K/Aktinhibitor(LY294002)for1h,andthentreatedwith20μMolanzapinefor3d.WesternblotwasperformedtoanalyzethelevelsofC/EBPβandαP2;D:HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofαP2asdescribedabove.Resultswerenormalizedbyβ-Actin,**P<0.01;E:HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofC/EBPβasdescribedabove.Resultswerenormalizedbyβ-Actin,*P<0.05;F.ThecellswerestainedwithOilredOatday14inthepresenceof20μMolanzapine.Someofthelipiddropletsaccumulatedinthecell.ThecellswerestainedwithOilredOatday14inthepresenceofLY294002and20μMolanzapine.Thereisnoaccumulationoflipiddropletsinthecells.Bar=100μm.为进一步证实奥氮平对BMSCs脂肪分化的作用，将BMSCs接种于6孔板中，生长至密度达90%后，用20μM奥氮平处理细胞，分别在5min、10min、30min、1h和2h后提蛋白，Western印迹分析p-Akt表达情况，发现加入20μM奥氮平30min后p-Akt表达升高最明显（图中未显示）。随后，用不同浓度奥氮平（10μM、20μM和40μM）处理细胞30min后提蛋白，进行Westernblotting，其结果显示，p-Akt的表达含量较对照组分别上升了15%（P<0.05）、22%（P<0.001）、42%（P<0.001），均具统计学意义（图8A、B）。Akt的激活会抑制下游GSK-3β的活性，因此p-GSK-3β的表达随着p-Akt表达的升高而降低。奥氮平是否通过PI3K/Akt信号通路促进BMSCs的脂肪分化？我们随后又进行了信号通路干扰实验。加入PI3K/Akt特异性阻断剂LY294002预先处理细胞1h，再用20μM奥氮平处理细胞，其间每2d换一次液，3d后提蛋白，进行Westernblotting，14d后对细胞进行油红O染色。Western印迹分析结果显示，加入20µM的LY294002后，脂肪细胞分化的标志基因蛋白C/EBPβ和αP2的表达受到抑制（图8C、D和E）。14d后的油红O染色结果显示，20μM奥氮平处理的细胞中出现部分脂肪滴，而加入LY294002的这一组几乎没有形成脂肪滴（图8F）。该结果说明奥氮平有可能通过30 新乡医学院硕士学位论文PI3K/Akt信号通路促进BMSCs的脂肪分化。2.6MDI分别与奥氮平和氯氮平共同作用下对BMSCs成脂分化的影响（油红O染色）前面我们已证明了第二代抗精神病药物中的奥氮平和氯氮平单独作用于小鼠骨髓间充质干细胞，会促进其脂肪分化作用。接下来我们将研究MDI和奥氮平、氯氮平共同作用对小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响及相关机制。图9.BMSCs成脂分化后的油红O染色结果A.正常BMSCs，以及分别加入MDI、MDI+奥氮平、MDI+氯氮平培养7d、14d后的BMSCs，油红O染色结果，标尺示100μm；B.BMSCs分别加入MDI、MDI+奥氮平、MDI+氯氮平继续培养7d后，用异丙醇萃取油红O的定量结果，与MDI组比较，*P<0.05，**P<0.01；C.BMSCs分别加入MDI、MDI+奥氮平、MDI+氯氮平继续培养14d后，异丙醇萃取油红O的定量结果，与MDI组比较，*P<0.05.31 新乡医学院硕士学位论文Fig.9ThemorphologicalChangesofadipogeneicdifferentiationbyOilredOstainingA.TheresultsofOilRedOafterBMSCs,andwiththeBMSCswereinducedwithMDI,MDI+olanzapine,MDI+clozapinefor7daysand14days,Bar=100μm;B.BMSCswereinducedwithMDI,MDI+olanzapine,MDI+clozapinefor7days,thenstainedwithOilRedO.ThequantitativeresultsofOilRedOthatextractedwithisopropanol,thencomparedwiththeMDIgroup,*P<0.05，**P<0.01;C.BMSCswereinducedwithMDI,MDI+olanzapine,MDI+clozapinefor7days,thenstainedwithOilRedO.ThequantitativeresultsofOilRedOthatextractedwithisopropanol,thencomparedwiththeMDIgroup,*P<0.05.细胞生长至密度达90%后，进行诱导，实验组分别加入MDI、MDI+20μM奥氮平、MDI+20μM氯氮平，对照组不作处理继续培养。其间每两天换一次液，分别在培养7d、14d后对细胞进行油红O染色，相差显微镜下观察、照相（图9A）。如图所示，诱导7d后，MDI组细胞中已开始形成部分脂肪滴，而同MDI+奥氮平组和MDI+氯氮平组细胞中也有脂肪滴形成，但较MDI组减少，异丙醇萃取油红O定量之后的结果显示MDI+奥氮平组和MDI+氯氮平组油红量均较MDI组明显减少（图9B）。诱导14d后，MDI组细胞中形成大量脂肪滴，MDI+奥氮平组和MDI+氯氮平组细胞中也形成了脂肪滴，较7d时增多，但与此时的MDI组比较，仍然是大量减少（图9C）。两次诱导，对照组均没有形成脂肪滴。从细胞形态上观察，MDI和奥氮平、氯氮平共同作用抑制了细胞的脂肪分化。2.7MDI分别与奥氮平和氯氮平共同作用下对BMSCs脂肪分化标志基因蛋白表达的影响将BMSCs接种于6孔板中诱导其脂肪分化，实验组分别加入MDI、MDI+20μM奥氮平、MDI+20μM氯氮平，每2d换一次液，收获第3d的细胞，Western印迹分析脂肪细胞分化的标志基因蛋白C/EBPβ和αP2的诱导表达情况。结果显示，MDI+20μM奥氮平组C/EBPβ和αP2的蛋白质表达水平都比MDI组有所降低（图10A），灰度值分析表明降低水平差异性显著，具统计学意义（图10B、C）。32 新乡医学院硕士学位论文图10.MDI+奥氮平处理BMSCs3d后，Western印迹分析C/EBPβ和αP2的表达A:BMSCs加入MDI、MDI+20μM的奥氮平3d后C/EBPβ和αP2的蛋白表达；B：αP2表达水平的灰度值分析，与MDI组比较，***P<0.001；C：C/EBPβ表达水平的灰度值分析，与MDI组比较，**P<0.01。Fig.10WesternblotwereperformedtodetecttheinductionofC/EBPβandtheαP2afterMDIandolanzapinetreatedBMSCs3daysA:TheexpressionlevelsofC/EBPβandαP2afterBMSCsweretreatedwithMDI,MDI+20μMolanzapinefor3days;B:HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofαP2,resultswerenormalizedbyβ-Actin,andcomparedwiththeMDIgroup,***P<0.001;C:HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofC/EBPβ,resultswerenormalizedbyβ-Actin,andcomparedwiththeMDIgroup,***P<0.001;MDI+20μM氯氮平组C/EBPβ和αP2的蛋白质表达水平也是同样的结果（图11）。上述结果显示，从蛋白水平讲，MDI和奥氮平、氯氮平共同作用抑制了小鼠BMSCs的脂肪分化。图11.MDI+氯氮平处理BMSCs3d后，Western印迹分析C/EBPβ和αP2的表达A:BMSCs加入MDI、MDI+20μM的氯氮平3d后C/EBPβ和αP2的蛋白表达；B：αP2表达水平的灰度值分析，与MDI组比较，*P<0.05；C：C/EBPβ表达水平的灰度值分析，与MDI组比33 新乡医学院硕士学位论文较，*P<0.05。Fig.11WesternblotwereperformedtodetecttheinductionofC/EBPβandtheαP2afterMDIandclozapinetreatedBMSCs3daysA:TheexpressionlevelsofC/EBPβandαP2afterBMSCsweretreatedwithMDI,MDI+20μMclozapinefor3days;B:HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofαP2,resultswerenormalizedbyβ-Actin,andcomparedwiththeMDIgroup,*P<0.05;C:HistogramanalysisfortheexpressionlevelsofC/EBPβ,resultswerenormalizedbyβ-Actin,andcomparedwiththeMDIgroup,*P<0.05;2.8MDI分别与奥氮平和氯氮平共同作用下对BMSCs成脂相关基因表达的影响将BMSCs接种于6孔板中诱导其脂肪分化，实验组分别加入MDI、MDI+20μM奥氮平、MDI+20μM氯氮平，每2d换一次液，收获第3d的细胞，提取细胞总的RNA，实时荧光定量PCR分析成脂相关基因PPARγ、Leptin、C/EBPα和Tnf-α的表达水平（图12、图13）。从图12可以看出，MDI+奥氮平组的Leptin和C/EBPα的mRNA表达水平较MDI组显著降低，分别下调了65%（P<0.01）、84%（P<0.05），均具统计学意义。而脂肪分化的负调控因子Tnf-α的mRNA表达水平较对照组和MDI组都有所上升，且具统计学意义。从图13可以看出，MDI+氯氮平组的Leptin的mRNA表达水平较MDI组显著降低，下调了50%（P<0.001），具统计学意义；而结果显示PPARγ的基因表达水平有所升高；脂肪分化的负调控因子Tnf-α的mRNA表达水平较对照组和MDI组都有所上升，且具统计学意义。该实验结果从RNA水平上说明了MDI和奥氮平、氯氮平共同作用会抑制小鼠BMSCs的脂肪分化。奥氮平的抑制作用较氯氮平似乎更明显。34 新乡医学院硕士学位论文图12.MDI和奥氮平处理BMSCs3d后，实时荧光定量PCR检测成脂相关基因Leptin、C/EBPα和Tnf-α的mRNA表达水平A:Leptin的实时荧光定量PCR检测结果，与MDI组相比，**P<0.01；B:C/EBPα的实时荧光定量PCR检测结果，与MDI组相比，*P<0.05;C:Tnf-α的实时荧光定量PCR检测结果，与对照组相比，***P<0.001。实验数据以均数±标准差表示，均来自至少三次独立的实验。Fig.12ThemRNAexpressionofLeptin,C/EBPαandTnf-αafter20μMolanzapinetreatementonBMSCsfor3dA:TheresultsofRT-qPCRdetectionofLeptin,comparedwiththeMDIgroup,**P<0.0;.B:TheresultsofRT-qPCRdetectionofC/EBPα,comparedwiththeMDIgroup,*P<0.05;C:TheresultsofRT-qPCRdetectionofTnf-α,comparedwiththecontrolgroup,***P<0.001;Valuesarethemeans±SDofthreedeterminationsfromseparateexperiments.图13.MDI和氯氮平处理BMSCs3d后，实时荧光定量PCR检测成脂相关基因PPARγ、Leptin和Tnf-α的mRNA表达水平35 新乡医学院硕士学位论文A:PPARγ的实时荧光定量PCR检测结果；B:Leptin的实时荧光定量PCR检测结果，与MDI组相比，**P<0.01;C:Tnf-α的实时荧光定量PCR检测结果，与对照组相比，**P<0.01。实验数据以均数±标准差表示，均来自至少三次独立的实验。Fig.13ThemRNAexpressionofPPARγ,LeptinandTnf-αafter20μMclozapinetreatementonBMSCsfor3dA:TheresultsofRT-qPCRdetectionofPPARγ;B:TheresultsofRT-qPCRdetectionofLeptin,comparedwiththeMDIgroup,***P<0.01;C:TheresultsofRT-qPCRdetectionofTnf-α,comparedwiththecontrolgroup,***P<0.01,*P<0.05;Valuesarethemeans±SDofthreedeterminationsfromseparateexperiments.2.9奥氮平对BMSCs脂肪分化的机制研究为观察奥氮平对BMSCsAKT信号通路的影响，BMSCs生长至密度达90%后，在胰岛素刺激条件下，用20μM奥氮平分别处理细胞5min、10min、30min、1h、2h后提总蛋白，Western印迹检测磷酸化的Akt和Akt下游GSK-3β蛋白的表达水平，结果显示MDI和20μM奥氮平共同作用诱导5min时，p-Akt表达含量上升最明显（图14A）。随后我们又探究了加药诱导5min后不同浓度的奥氮平对p-Akt表达含量的影响，以及Akt上游IRS（胰岛素受体底物）的表达情况，结果如图14D所示。从图中可以看到，MDI和不同浓度的奥氮平共同作用，下调了p-Akt的表达，而其上游p-IRS的表达也有变化。其中，p-Akt和p-IRS的表达较MDI组有所下调，且随着浓度的增加，有逐渐下降的趋势。该结果说明，奥氮平在有胰岛素存在的条件下，对小鼠BMSCs的成脂分化起到了一定的抑制作用，且这个作用有可能是通过IRS、Akt信号通路发生的，具体的作用机制有待于进一步详细研究。36 新乡医学院硕士学位论文图14.奥氮平对胰岛素信号通路的影响。A:MDI和奥氮平作用5min和10min后的western印迹分析结果。B:MDI与不同浓度奥氮平（10μM、20μM、40μM）共同作用5min后，western印迹分析p-Akt及其上游分子p-IRS的蛋白表达情况。Fig.14Theinfluenceofolanzapineforinsulinsignalingpathways.A:Theresultofwesternblotanalysisin5minand10minbyMDIandolanzapine.B:MDIanddifferentconcentrationsofolanzapine(10μM,20μM,40μM)treatmentBMSCsfor5min,proteinswereextractedforwesternblotanalysisoftheexpressionlevelofp-Aktandit’supstreamp-IRS.3讨论服用抗精神病药物引起体重增加和代谢紊乱的机制认识在临床实践中非常重要，因为它可以帮助指导用药，以及设计新的治疗方法，以减少这些药物严重的代谢副作用。抗精神病药物引起体重增加可能是破坏能量摄入（摄入的热量）和能量消耗（运动）之间的平衡引起的。然而，一些研究报告说，体重增加与食物摄入量不相关[29]。临床研究发现一些肥胖者可能确实没有贪食[30]。因此，抗精神病药物的其他副作用，如镇静和肌肉僵硬、活动减少（运动）和能量消耗，可能也参与到所观察到的体重增加[31]。SGA导致肥胖发生过程中除了代谢等原因外，也伴随着脂肪组织的增生和改变，W.Tan等[32]研究表明，奥氮平治疗导致雌鼠体重增加，但并未明显影响食物摄取量，皮下脂肪组织形态改变明显，组织学检测表明奥氮平治疗3天后即检测到了未分化脂37 新乡医学院硕士学位论文肪细胞的增殖，这种改变与时间和剂量相关，奥氮平治疗后脂肪组织的增殖不依赖于体重增加，同时脂肪组织的蛋白表达特征也发生变化。第二代抗精神病药物可以直接影响大鼠的成熟脂肪细胞，造成甘油三酯的积累，从而使脂肪合成增加，氯氮平和奥氮平已被证明可以增加小鼠前脂肪细胞和脂肪细胞的脂肪生成[33,34]，尤其是在那些位于内脏的白色脂肪组织。尽管在人类身上的研究数量有限，所获得的结果与小鼠模型是相似的。氯氮平和奥氮平能够刺激人脂肪祖细胞脂肪分化的初始阶段，增加已分化脂肪细胞的甘油三酯的积聚[35,36]。在抗精神病药物治疗的患者的淋巴细胞中也观察到脂肪合成的影响。脂肪分化调控是研究肥胖及其相关疾病发生机制的热点问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下，能够向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞及成肌细胞等不同的细胞系分化[37]。由于其在体外能够诱导分化为脂肪细胞，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。前面已提到，SGA可引起体重增加，而体重增加是由人类脂肪细胞的增殖、分化和成熟脂肪细胞脂肪的形成造成的。此外，有人提出，SGA的氯氮平和奥氮平能够刺激小鼠前脂肪细胞系3T3-L1的脂肪形成[20,21]。然而，关于SGA对小鼠骨髓间充质干细胞的作用，研究的还很有限。对于这些作用仍然有很大的不确定性。本研究主要集中在第二代抗精神病药物对体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞脂肪分化及脂肪代谢的影响。我们的结果表明，单独使用药物时，第二代抗精神病药物中的奥氮平、氯氮平对一些基因有轻微的刺激作用，如C/EBPβ和αP2，这些基因被认为是脂肪组织分化早期或后期标志物。通过MTT法和细胞计数法我们选取了对细胞毒性影响较小的奥氮平、氯氮平浓度进行试验。通过脂质含量测定，奥氮平、氯氮平显著促进了BMSCs的脂肪分化，细胞中的脂滴明显增多。Westernblot结果显示，脂肪分化的标志基因蛋白C/EBPβ和αP2的表达水平较对照组明显升高。在前脂肪细胞向成熟脂肪细胞增殖的分化过程中受许多转录因子的调控，在基因敲除小鼠的研究中已表明：PPARγ和C/EBPα是脂肪细胞分化过程中必需的[38]。纯合敲除这两个中的任何一个基因都会导致小鼠胚胎期死亡，且不能形成正常的脂肪组织[39]。本研究证明了脂肪分化相关基因PPARγ、Leptin、C/EBPα和Tnf-α的mRNA表达水平也显著增加。SertiéAL等[40]38 新乡医学院硕士学位论文证明了奥氮平（40μmol/L）和氯氮平（30μmol/L）使人的脂肪干细胞中C/EBPβ、PPARγ和LPL表达量升高。Vestri等人[41]的实验观察到，氯氮平和奥氮平（100μM）增强了基础和胰岛素刺激的大鼠脂肪细胞的脂肪生成。我们的实验结果从细胞形态、蛋白水平及RNA水平证明了奥氮平（20μM）、氯氮平（20μM）促进了小鼠BMSCs的脂肪分化。Akt被称为蛋白激酶B（PKB），是一种蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶，已有文献研究了其在生长因子介导的细胞存活、细胞周期进程和转录调控中的作用[42]。Akt在葡萄糖代谢调节中也发挥着关键作用[43]。Gu等[44]的研究表明，PI3K/Akt信号通路在脂肪组织的形成中起着主要作用，同时，PI3K/Akt信号通路在脂肪、肝脏、骨骼肌等中发挥着传导胰岛素信号、促进靶组织对糖的摄取和维持正常糖代谢的重要作用。Yang等[45]发现，当PI3K/Akt信号通路被抑制之后，间充质干细胞会出现胰岛素耐受，而且脂肪分化会受到影响。为了更深入探究奥氮平是如何促进小鼠BMSCs的脂肪分化，我们发现，加入20μM奥氮平之后，脂肪分化过程中的p-Akt的表达含量比对照组升高，且有剂量依赖性，其下游p-GSK-3β的表达水平随着p-Akt的升高而降低。加入PI3K/Akt特异性阻断剂LY294002后，C/EBPβ和αP2的表达水平受到抑制，油红O染色也表明加入阻断剂后，脂肪分化受到抑制。推测奥氮平可能通过促进PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化来促进BMSCs的脂肪分化。随后我们又研究了胰岛素刺激条件下，奥氮平和氯氮平对BMSCs成脂分化的影响。方法同上。油红O染色结果显示，加药诱导7d、14d后，MDI组细胞内形成大量脂肪滴，而MDI+奥氮平组和MDI+氯氮平组细胞内脂肪滴较MDI组明显减少。Westernblot结果显示，MDI和奥氮平、氯氮平共同作用时，C/EBPβ和αP2的表达水平较MDI组明显下降。同时，成脂相关基因Leptin和C/EBPα的表达水平也显著下调，脂肪分化的负调控因Tnf-α的表达水平显著升高。我们的实验结果从细胞形态、蛋白水平及RNA水平证明了20μM奥氮平、20μM氯氮平和MDI共同作用抑制了小鼠BMSCs的脂肪分化。信号通路实验也表明了，MDI和奥氮平共同作用，抑制了p-Akt的表达，其上游p-IRS的表达水平也随着变化。这与前面的单独使用药物的结果相矛盾，其具体的机制有待于进一步研究。39 新乡医学院硕士学位论文综上所述，我们的研究结果表明，单独加入奥氮平、氯氮平可以促进小鼠BMSCs的脂肪分化，且奥氮平的促进作用明显强于氯氮平，奥氮平、氯氮平可能通过促使PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化水平升高来促进小鼠BMSCs的脂肪分化；而在胰岛素刺激条件下，与单独使用MDI相比，奥氮平和氯氮平抑制了小鼠BMSCs的脂肪分化，其中奥氮平与MDI共同作用抑制了胰岛素信号通路，这有可能引起胰岛素耐受，其具体的机制还有待于进一步深入研究。我们的实验结果为第二代抗精神病药物导致病人肥胖和糖尿病发生机制提供了体外实验的资料。探讨不同的第二代抗精神病药物对脂肪分化的影响及作用机制，将为预防第二代抗精神病药物临床应用过程中导致病人肥胖和糖尿病的发生奠定理论基础。4小结1.本研究利用MTT法和细胞计数法，说明了高浓度（80~100μM）的奥氮平、氯氮平对细胞的生长有抑制作用，低浓度（1-40μM）对细胞无毒害作用。2.利用油红O染色、westernblotting和qRT-PCR方法，从细胞形态、蛋白水平和分子水平上证明了单独使用奥氮平、氯氮平，可以促进小鼠BMSCs的成脂分化，且奥氮平的促进作用明显强于氯氮平；而MDI分别与奥氮平和氯氮平同时作用，与单独使用MDI相比，则会对小鼠BMSCs的成脂分化起到一定抑制作用。3.利用westernblotting法说明了单独使用奥氮平时，奥氮平可能通过促使PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化水平升高来促进小鼠BMSCs的脂肪分化。而MDI和奥氮平共同作用时，胰岛素信号通路受到抑制，具体的机制有待于进一步研究。4.下一步我们准备研究胰岛素存在条件下，奥氮平是通过什么机制来影响BMSCs的成脂分化。参考文献[1]BridlerR,UmbrichtD.Atypicalantipsychoticsinthetreatmentofschizophrenia[J].SwissMedWkly2003,133(5–6):63–76[2]KeefeRS,YoungCA,RockSL,etal.BreierA.HGGNStudyGroup.Oneyeardouble-blindstudyoftheneurocognitiveefficacyofolanzapine,risperidone,andhaloperidolinschizophrenia[J].SchizophrRes2006,81(1):1–15[3]BridlerR,UmbrichtD.Atypicalantipsychoticsinthetreatmentofschizophrenia[J].SwissMedWkly2003,133(5–6):63–7640 新乡医学院硕士学位论文[4]KeefeRS,YoungCA,RockSL,etal.BreierA.HGGNStudyGroup.One-yeardouble-blindstudyoftheneurocognitiveefficacyofolanzapine,risperidone,andhaloperidolinschizophrenia[J].SchizophrRes2006,81(1):1–15[5]McDougleCJ,StiglerKA,EricksonCA,etal.Atypicalantipsychoticsinchildrenandadolescentswithautisticandotherpervasivedevelopmentaldisorders[J].ClinPsychiatry2008,69(4):15–20[6]BridlerR,UmbrichtD.Atypicalantipsychoticsinthetreatmentofschizophrenia[J].SwissMedWkly2003,133(5–6):63–76[7]KeefeRS,YoungCA,RockSL,etal.BreierA.HGGNStudyGroup.One-yeardouble-blindstudyoftheneurocognitiveefficacyofolanzapine,risperidone,andhaloperidolinschizophrenia[J].SchizophrRes2006,81(1):1–15[8]张仁凯，付学凯，王建利，等．抗精神病药物研究[C].第十三届全国中西医结合精神疾病学术会议论文集，2014:246-249[9]MonshatK,CartyB,OlverJ,etal.Trendsinantipsychoticprescribingpracticesinanurbancommunitymentalhealthclinic[J].AustralasPsychiatry.2010,18(3):238-241[10]ShahSM,CareyIM,HarrisT,etal.AntipsychoticprescribingtoolderpeoplelivingincarehomesandthecommunityinEnglandandWales[J].IntJGeriatrPsychiatry.2011,26(4):423-434[11]HauptDW.Differentialmetaboliceffectsofantipsychotictreatments.EurNeuropsychopharmacol.2006,16:S149-155[12]GraysonBE,SeeleyRJ,SandovalDA.Wiredonsugar:theroleoftheCNSintheregulationofglucosehomeostasis[J].Nat.Rev.Neurosci.2013,14(1):24-37[13]VirkkunenM,WahlbeckK,RissanenA,etal.Decreaseofenergyexpenditurecausesweightincreaseinolanzapinetreatment—acasestudy[J].Pharmacopsychiatry.2002,35(3):124-126[14]VestriHS,MaianuL,MoelleringDR,etal.Atypicalantipsychoticdrugsdirectlyimpairinsulinactioninadipocytes:effectsonglucosetransport,lipogenesis,andantilipolysis[J].Neuropsychopharmacology.2007,32(4):765-772[15]YangLH,ChenTM,YuST,etal.OlanzapineinducesSREBP-1-relatedadipogenesisin3T3-L1cells[J].PharmacolRes.2007,56(3):202-208[16]徐晓津，王高华，王惠玲，等．氯氮平和利培酮对大鼠脂肪细胞GLUT4的影响[J]．中国民康医学，2012，24(2)：129-132[17]SpaldingKL,ArnerE,WestermarkPO,etal.Dynamicsoffatcellturnoverinhumans.Nature2008,453(7196):783–787[18]Minet-RinguetJ,EvenPC,ValetP,etal.Alterationsoflipidmetabolismandgeneexpressioninratadipocytesduringchronicolanzapinetreatment[J].MolPsychiatry2007,12(6):562–571[19]VestriHS,MaianuL,MoelleringDR,etal.Atypicalantipsychoticdrugsdirectlyimpairinsulinactioninadipocytes:effectsonglucosetransport,lipogenesis,andantilipolysis[J].41 新乡医学院硕士学位论文Neuropsychopharmacology2006,32(4):765–772[20]YangLH,ChenTM,YuST,etal.OlanzapineinducesSREBP-1-relatedadipogenesisin3T3-L1cells[J].PharmacolRes2007,56(3):202–208[21]YangZ,YinJY,GongZC,etal.Evidenceforaneffectofclozapineontheregulationoffat-cellderivedfactors[J].ClinChimActa2009,408(1–2):98–104[22]王玉兰，何晓梅，唐薇，等．基质细胞衍生因子-1α/CXCR4/CXCR7轴对骨髓间充质干细胞迁移的影响[J]．解剖学报，2014，45（5）：639-645[23]纪洪雷，宋成创，李优磊，等．MiR-125a-5p抑制3T3-L1前体脂肪细胞分化[J]．中国生物化学与分子生物学报，2014，30(11)：1147-1154[24]LinFT,LaneMD.CCAAT/enhancerbindingproteinalphaissufficienttoinitiatethe3T3-L1adipocytedifferentiationprogram[J].ProcNatlAcadSciUSA,1994,91(19):8757-8761[25]EvanD,Rosen,OrmondA,etal.Adipocytedifferentiationfromtheinsideout[J].NatRevMolCellBiol.2006,7(12):885-896[26]RossSE,HematiN,LongoKA,etal.InhibitionofAdipogenesisbyWntSignaling[J].Science.2000,289(5481):950-953[27]DeslauriersJ,DesmaraisC,SarretP,etal.ImplicationoftheERK/MAPKPathwayinAntipsychotics-inducedDopamineD2ReceptorUpregulationandinthePreventiveEffectsof(±)-α-lipoicacidinSH-SY5YNeuroblastomaCells[J].JMolNeurosci.2014,52(3):378-383[28]DeslauriersJ,DesmaraisC,SarretP,etal.JessicaDeslauriers,ChristianDesmarais&PhilippeSarret&SylvainGrignonα-LipoicAcidInteractionwithDopamineD2Receptor-DependentActivationoftheAkt/GSK-3βSignalingPathwayInducedbyAntipsychotics:PotentialRelevancefortheTreatmentofSchizophrenia[J].JMolNeurosci.2013,50(1):134-145[29]GuptaS,DroneyT,Al-SamarraiS,etal.Olanzapine:weightgainandtherapeuticefficacy[J].JClinPsychopharmacol.1999,19(3):273-275[30]VirkkunenM,WahlbeckK,RissanenA,etal.Decreaseofenergyexpenditurecausesweightincreaseinolanzapinetreatment—acasestudy[J].Pharmacopsychiatry.2002,35(3):124-126[31]CoccurelloR,MolesA.Potentialmechanismsofatypicalantipsychotic-inducedmetabolicderangement:cluesforunderstandingobesityandnoveldrugdesign[J].PharmacolTher.2010,127(3):210-251[32]TanW,FanH,YuPH.Inductionofsubcutaneousadiposeproliferationbyolanzapineinrodents[J].ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry.2010,34(6):1098-1103[33]VestriHS,MaianuL,MoelleringDR,etal.Atypicalantipsychoticdrugsdirectlyimpairinsulinactioninadipocytes:effectsonglucosetransport,lipogenesis,andantilipolysis[J].Neuropsychopharmacology.2007,32(4):765-77242 新乡医学院硕士学位论文[34]YangLH,ChenTM,YuST,etal.OlanzapineinducesSREBP-1-relatedadipogenesisin3T3-L1cells[J].PharmacolRes.2007,56(3):202-208.[35]HemmrichK,GummersbachC,PalluaN,etal.Clozapineenhancesdifferentiationofadipocyteprogenitorcells[J].MolPsychiatry.2006,11(11):980-981[36]PavanC,VindigniV,MichelottoL,etal.WeightgainrelatedtotreatmentwithatypicalantipsychoticsisduetoactivationofPKC-beta[J].PharmacogenomicsJ.2010,10(5):408-417[37]郑亮，李萍华，刘钰瑜，等．诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化[C]．第九届中国南方骨质疏松论坛暨江西省骨质疏松学术会论文集，2013：596-600[38]杨智．氯氮平对脂肪细胞PPARγ、C/EBPα、ADD1/SREBP<,1C>、LPL和DGAT1基因表达的调控[D]．[硕士学位论文]．长沙：中南大学，2008.[39]RosenED,SarrafP,TroyAE,etal.PPARgammaisrequiredforthedifferentiationofadiposetissueinvivoandinvitro[J]．MolCell,1999,4(4):611-617[40]SertiéAL,SuzukiAM,SertiéRA,Effectsofantipsychoticswithdifferentweightgainliabilitiesonhumaninvitromodelsofadiposetissuedifferentiationandmetabolism[J].ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry.2011,35(8):1884-1890[41]VestriHS,MaianuL,MoelleringDR,GarveyWT.Atypicalantipsychoticdrugsdirectlyimpairinsulinactioninadipocytes:effectsonglucosetransport,lipogenesis,andantilipolysis[J].Neuropsychopharmacology2006,32(4):765–772[42]BrazilDP,YangZZ,HemmingsBA.AdvancesinproteinkinaseBsignalling:AKTiononmultiplefronts[J].TrendsBiochemSci2004,29(5):233–242[43]PanarielloF,PerruoloG,CasseseA,ClozapineImpairsInsulinActionbyUp-RegulatingAktPhosphorylationandPed/Pea-15ProteinAbundance[J].JCellPhysiol.2012,227(4):1485-1492[44]GuD,YuB,ZhaoC,etal.Theeffectofpleiotrophinsignalingonadipogenesis[J].FEBSLett.2007,581(3):382-388[45]YangHJ,XiaYY,WangL,etal.Anovelroleforneuralcelladhesionmoleculeinmodulatinginsulinsignalingandadipocytedifferentiationofmousemesenchymalstemcells[J].JCellSci,2011,124(Pt15):2552-256043 新乡医学院硕士学位论文综述第二代抗精神病药物诱导脂肪组织代谢变化的研究摘要在过去的十几年中，第二代抗精神病药物(Secondgenerationantipsychoticsdrugs,SGA)被广泛应用于临床，提高了精神症状的缓解率和精神病患者的出院率。虽然其对患者的精神起到有益作用，却也伴随着一些副作用，如体重增加和代谢异常，包括高血糖，胰岛素耐受，II型糖尿病和心血管疾病等。这些不良影响的分子机制尚不完全清楚，但被认为是脂肪组织的动态平衡失调。因此，本文的目的是讨论第二代抗精神病药在脂肪组织中的作用以及引起的继发性不良代谢效应。更好地了解这些药物对脂肪组织代谢的影响，可以帮助指导临床用药及新的治疗方法的设计。关键词：第二代抗精神病药物；体重增加；代谢异常；脂肪组织AbstractInthepasttenyears,thesecondgenerationantipsychotics（SGA）arewidelyusedinclinical,psychiatricsymptomsimprovedresponserateandtherateofpsychiatricpatientsdischargedfromhospital.SGAplayausefulroleofmentalpatients,butalsoaccompaniedbysomesideeffectssuchasweightgainandmetabolicabnormalities,includinghyperglycemia,insulinresistance,typeIIdiabetesandcardiovasculardisease.Themolecularmechanismoftheadverseeffectsarenotentirelyclear,butisconsideredtobeadiposetissuedisorderofdynamicbalance.Therefore,thepurposeofthisarticleistodiscusstheroleofsecond-generationantipsychoticsinadiposetissueandsecondaryadversemetaboliceffects.Tobetterunderstandtheeffectsofthesedrugsforfattissuemetabolism,canhelptoguidetheclinicalmedicationandthedesignofnewtherapies.Keywords:Secondgenerationantipsychoticsdrugs;weightgain;metabolicabnormalities;adiposetissue44 新乡医学院硕士学位论文前言第二代精神病药物(Secondgenerationantipsychoticsdrugs,SGA)在治疗精神分裂症的阳性和阴性症状上与第一代精神病药物相比有很大的优势，这些药物越来越多地被用于其他精神疾病的治疗，如精神障碍、孤独症和抑郁症等[1,2,3]。然而，第二代精神病药物主要的副作用就是造成体重增加和代谢异常。当精神药物致体重增加至超重或肥胖时，可引发多种疾病产生并增加病死率。脂肪组织作为第二代精神病药的作用靶点与这些副作用有关联[4]。第二代抗精神病药物可能增加脂肪组织（尤其是内脏脂肪）的脂肪形成、分化增生以及胰岛素抵抗。不良代谢所依据的细胞和分子机制，还不是十分清楚，但脂肪组织内的稳态失调已经被建议为一个合理的解释。因此，本文的目的是讨论第二代抗精神病药的使用对脂肪组织代谢变化的影响。1抗精神病药物概述20世纪60年代末出现的氯氮平，以及随之开发的利培酮等，加上之后开发的阿立哌唑、氨磺必利，统称为SGA。世界精神医学协会2002年提出：SGA的有效性值得关注，这些药物为精神分裂症的治疗增加了新的选择，而且对其他精神障碍也有效，改变了精神疾病治疗的现状，开启了精神疾病治疗新药研究的新纪元[5]。根据2006年世界卫生组织的估计，神经精神障碍患者占了成人的10％，抗精神病药物在过去十年中使用急剧增加[6]。这增强了SGA如奥氮平，氯氮平，喹硫平，利培酮和阿立哌唑的引入，研究已证实了第二代抗精神病药物相对于第一代抗精神病药，有较高的临床功效，诱导锥体外系症状的风险也较低，很少有导致迟发性运动障碍的倾向[7,8]，而且对阴性症状有效，可以改善患者的认知功能缺陷，其耐受性总体上较第一代药物好。传统抗精神病药多为单纯的多巴胺D2受体阻断剂，而第二代抗精神病药物的药理特性表现在对除多巴胺D2受体以外的其他受体，包括5-羟色胺（5-HT）受体、谷氨酸受体等[9]。第二代抗精神病药物被用于治疗情绪障碍，其中39％的抗精神病药用于治疗抑郁症和双相性疾病[10]；35％用于治疗精神病，特别是精神分裂症；一小部分（7.4％）是用来研究痴呆，健忘或其他神经精神障碍[11]。45 新乡医学院硕士学位论文2抗精神病药物诱导脂肪组织代谢变化虽然抗精神病药物与患者的神经精神障碍的有益效果相关联，它们也具有不利的代谢效应，如体重增加，血脂异常，炎症，葡萄糖耐受不良，胰岛素抵抗等，因此发展为肥胖，2型糖尿病和心血管疾病的风险更高[11]。代谢异常在精神分裂症患者的首发表现最为突出，尤其是在那些以前没有服用过抗精神病药物的儿童和青少年中[12]。中枢神经系统在调节食物消耗，肥胖，血脂异常和糖尿病上起着关键作用[13]。然而，对于代谢失调，外周器官也有很大作用。脂肪组织是抗精神病药物代谢不良影响的重要参与者，了解这些药物对脂肪组织的动态平衡的影响，可能对开发新的不良影响较少的抗精神病药提供方向。2.1抗精神病药物与肥胖超重和肥胖在神经精神障碍患者中比一般人群中更为普遍。一些研究表明，这可能是由于使用第二代抗精神病药的原因[14]，因为这些药物已经被报道在精神分裂症患者中能够诱导体重增加[15,16]。此外，与不使用精神病药物治疗的患者相比较，这些患者表现出内脏脂肪组织更大程度的积累[17]。一些研究表明潜在的抗精神病药物与体重增加存在着剂量依赖性的关系[18,19,20]。第二代抗精神病药物，氯氮平和奥氮平与体重增加和肥胖症的关系更紧密，随后是利培酮和喹硫平，而齐拉西酮和阿立哌唑似乎关联较少[14,21]。经历首发精神病的年轻人体重容易迅速增加。已经报道，青少年肥胖患病率中64%是由氯氮平引起的，56%是由其他非典型药物引起的，28%是由非药物作用引起的[20]。抗精神病药物治疗诱导体重增加和肥胖已成为一个主要关注的问题，因为它可能影响服药依从性和复发率、生活质量、以及社会歧视，还会造成更大的发病率和死亡率[22]。抗精神病药物引起体重增加和肥胖的分子机制仍然不完全清楚。有研究表明它可以通过作用于外周组织（即脂肪组织）促进体重和肥胖的增加[23]。更具体地说，第二代抗精神病药物可以直接影响大鼠的成熟脂肪细胞，造成三酸甘油酯的积累，从而使脂肪合成增加，氯氮平和奥氮平已被证明可以增加小鼠前脂肪细胞和脂肪细胞的脂肪生成[24,25]，尤其是在那些位于内脏的白色脂肪组织。尽管在人类身上的研究数量有限，所获得的结果与小鼠模型是相似的。氯氮平和奥氮平能够刺激人脂肪祖细胞脂肪分化46 新乡医学院硕士学位论文的初始阶段，增加已分化脂肪细胞的甘油三酯的积聚[26,27]。在抗精神病药物治疗的患者的淋巴细胞中也观察到脂肪合成的影响。固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）是一种脂质稳态的关键转录因子[25]。第二代抗精神病药物被发现诱导肝细胞、神经胶质瘤细胞和脂肪细胞SREBP-1的活化[24]。因此，非典型抗精神病药物能上调SREBP-1及其相关的靶基因参与脂肪细胞中脂肪酸的合成[28]。有趣的是，脂肪酸合成酶和硬脂酰辅酶A脱氢酶也在奥氮平治疗的患者的血液中过表达[29]。第二代抗精神病药物，特别是氯氮平、奥氮平和利培酮，也能够通过减少脂肪组织脂解作用（即甘油三酯水解）增加体重[30,31]。与对照组大鼠比较，奥氮平和氯氮平治疗的大鼠脂肪细胞脂解活性低，低表达参与的脂解酶（激素敏感脂肪酶和脂蛋白脂肪酶）[31]。此外，奥氮平治疗组大鼠脂肪细胞往往比未经处理的大鼠更大[31]。脂肪来源于多能脂肪干细胞，而脂肪干细胞则在经历了多次有丝分裂分化成脂肪细胞。除了增加脂肪合成，减少脂肪分解，非典型抗精神病药物也能促进前脂肪细胞向脂肪细胞分化，从而增加脂肪组织的体积[32]。此外，这些药物对脂肪细胞分化的转录因子的表达至关重要，如过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ），βCCAAT增强子结合蛋白（C/EBPβ），以及脂肪细胞决定和分化因子1/SREBP1c（ADD1/SREBP-1c）[33]，这些转录因子在人类和啮齿类动物的脂肪细胞中被发现是由奥氮平和氯氮平上调的[4,25]。总的来说，这些研究提示非典型抗精神病药增加超重和肥胖的风险是可以解释的，通过它们增加脂肪合成，减少脂肪分解，促进白色脂肪组织（尤其是内脏白色脂肪组织）脂肪细胞的分化的能力来解释。2.2抗精神病药物与心血管疾病精神分裂症患者的心血管疾病发病率[34]和死亡率均高于普通人群。在美国，与普通人群中冠状动脉心脏疾病死亡的绝对风险是33％，而精神分裂症患者中为50~75％[35]。此外，精神分裂症患者发展为血脂异常的风险增加，这可能是由于遗传倾向或环境因素，如饮食和抗精神病药物的使用的结果[36]。一些研究已经报道了，在接受了第二代抗精神病药的精神分裂症患者的血液中的低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）和甘油三酯水平有了增加，高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）水平有了降低[37,,38,39]。有趣47 新乡医学院硕士学位论文的是，从用这些药物治疗的大鼠身上也获得了类似的结果[40]。在大鼠和人类中，氯氮平和奥氮平似乎会诱导更大程度的血脂异常，其次是利培酮和喹硫平，而阿立哌唑和齐拉西酮似乎与血脂异常不相关[40]。非典型抗精神病药物治疗能够增加原代小鼠和大鼠肝细胞[41]以及培养的人类肝细胞系[42]中复杂脂质（磷脂，三酰基甘油酯和游离脂肪酸）的合成。此外，大鼠用氯氮平迅速治疗，会引起肝磷脂和甘油三酯含量的显著增加[30]。然后这些复合脂存储在肝细胞的脂滴和膜结构中，或作为极低密度脂蛋白（VLDL）分泌到血液循环中。脂肪组织在甘油三酯代谢中起着核心作用，奥氮平处理的大鼠脂肪细胞倾向于变得更大，因此更容易破裂。这可能导致脂肪细胞内容物的释放，例如释放三酰基甘油酯，进入循环，从而增加血脂异常的风险[43]。另外，在第二代抗精神病药治疗的大鼠肝脏和脂肪组织中发现SREBP1基因表达上调，并呈现血脂异常[30]，这表明SREBP1基因表达上调可能是抗精神病药物引起血脂异常的一个重要机制。氯氮平或奥氮平治疗的大鼠肝脏[30]和脂肪组织[40]中胆固醇的积累增加了。SREBP-2调节基因参与胆固醇的生物合成，如编码基因的3-羟基-3-甲基CoA还原酶（HMGCR），同时基因参与胆固醇的吸收，如低密度脂蛋白受体（LDLR）基因[44]。有趣的是，抗精神病药刺激SREBP-2的活化，上调参与胆固醇生物合成的基因的表达[30,42,45]。在脂肪组织水平上，非典型抗精神病药物刺激胆固醇的积累[40]，脂肪细胞在体外（3T3-L1细胞）和体内（小鼠）[46]都是胆固醇转变为高密度脂蛋白(HDL)的调节来源。因此，抗精神病药物在脂肪细胞中增加胆固醇的合成代表了一个独特的调节和丰富的高密度脂蛋白(HDL)水平的仓库。总之，第二代抗精神病药在周围组织（特别是在脂肪组织）以及血液循环中增加脂质蓄积，最有可能通过一个SREBP依赖机制。这些可能是最终构成心血管疾病的发病率在精神分裂症患者中比一般人群较高的危险因素[47,48]。2.3抗精神病药物与糖尿病一些证据表明，精神分裂症患者发病率较高，糖耐量异常、胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病比一般人群高[48,49,50]。慢性精神分裂症患者的代谢综合征的发病率也被报道很高（约40%）[51]。Ⅱ型糖尿病的家族史中发现18~19%的精神分裂症患者，而普通人群48 新乡医学院硕士学位论文中只有1.2~6.3%[52]。在这些病人中基因和遗传的综合因素可能参与了葡萄糖的代谢失调。此外，涉及一个重要因素是抗精神病药物的使用[53]。对于第二代抗精神病药物，回顾性研究表明，用这些药物治疗的患者，葡萄糖耐受不良和糖尿病的患病率比典型的抗精神病药物治疗的患者高[54,55]。事实上，许多报告指出，葡萄糖耐受不良、酮症酸中毒、Ⅱ用哪个？前后一致型糖尿病经常发生在氯氮平[56]、奥氮平[57]、利培酮[58]治疗的患者中。在动物[59]和人类[60]的外周组织中，与利培酮和喹硫平相比，氯氮平和奥氮平更能够诱导胰岛素抵抗。葡萄糖代谢的调节主要发生在细胞的葡萄糖摄取水平。抗精神病药物干扰糖代谢，不仅因为他们损害激素分泌和外周组织的作用还因为他们减少流通的葡萄糖进入。如Ardizzone等[61]证明了氯氮平和氟奋乃静抑制大鼠肌L6细胞系中GLUT4介导的葡萄糖转运。之后，第一次证实了氯氮平降低胰岛素刺激的葡萄糖转运到大鼠脂肪细胞[62]。此外，氯氮平和奥氮平均表现出降低胰岛素刺激的葡萄糖转运到大鼠前脂肪细胞[63]。在组织中抗精神病药被累积约25~30倍，如脂肪组织[64]。一些研究表明，在体外抗精神病药有可能是通过直接结合到转运蛋白上抑制葡萄糖转运[65]。因此，抗精神病药可以充当类似于细胞松弛素B，直接结合到胞内转运蛋白上，对运输造成封锁。总之，本研究表明，抗精神病药物可以通过引起高血糖，高胰岛素血症及在脂肪组织中的胰岛素抵抗来影响糖代谢，从而增加Ⅱ型糖尿病的发病风险。3结语抗精神病药物的使用在过去的一二十年间急剧增加，许多精神疾病得到了有效控制，但非典型抗精神病药物已与次级代谢不良影响，如体重增加、血脂异常、炎症和葡萄糖耐受不良等相关联。对非典型抗精神病药物和代谢产生不良影响之间的关系的再认识是至关重要的，因为此类抗精神病药物具有相对较高的代谢风险，如喹硫平，利培酮和奥氮平，它们代表了超过四分之三的非典型抗精神病药物处方[66]。迄今为止，针对抗精神病药物引起的体重增加管理包括认知行为治疗干预，饮食改变和抗精神病药的切换[67]。治疗体重增加的药剂包括H2拮抗剂、多巴胺再摄取抑制剂（如金刚烷胺）、5-羟色胺再摄取抑制剂、二甲双胍和奥利司他（一种从胃肠道抑制脂肪吸收的49 新乡医学院硕士学位论文药）[68]。针对血脂异常的治疗，他汀类药物的使用在抗精神病药治疗的精神分裂症患者中是有效的，同时伴随着甘油三酯和总胆固醇以及LDL胆固醇显著的降低[69,70]。因此，他汀类药物的使用应考虑作为与抗精神病药物治疗[69]相关的心血管副作用的初级预防。人们已经在理解抗精神病药引起的次级代谢副作用的分子机制方面有了与日俱增的兴趣，目的是开发替代的治疗方法来控制或减弱与这些药物相关的代谢副作用。脂肪组织在糖脂代谢途径中起着重要作用。因此，人们已经提出，抗精神病治疗的不良代谢作用的分子机制可能涉及脂肪组织（特别是内脏的脂肪组织）的动态平衡。即脂肪组织中脂肪生成的增加、分化、增生、亲炎症介质的分泌和胰岛素抵抗以及脂肪组织中脂解作用的降低已经被发现。因此，接受抗精神病药物治疗的患者可能有发展成肥胖症，Ⅱ型糖尿病或心血管疾病的风险。更好地了解这些药物对脂肪组织稳态的影响，有助于推出开发新型的含有更少不利影响的抗精神病药物的策略，并给接受抗精神病药物治疗的患者制定辅助治疗。50 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新乡医学院硕士学位论文致谢三年研究生生活在我手中的马克笔下刷刷流走了。每次做实验用马克笔标日期就会感受到时间一天天一月月飞走了。犹记得开学报到第一天的情景，可如今我要毕业了。这三年来，我成长了许多，收获了许多。同样，要感谢的也很多。感谢我的导师——李永海老师，他严谨的科学态度，谦逊的品格，踏实的工作作风，都深深地影响了我。本研究就是在李老师的精心指导下完成的。无论是在学习上还是生活上，李老师都给了我大量的帮助。他是我试验道路上的引路人，教我实验方法，如何设计实验，如何写好文章。在此，衷心感谢李永海老师对我的指导和帮助！感谢冯志伟教授、杨海杰老师、程彬峰老师、陈红丽老师、王磊老师、井长勤老师、南文滨老师和徐志浩老师等所有生命科学技术学院的老师，在我实验的道路上，给了我许多建议以及指导。在此对他们表示衷心的感谢！感谢新乡医学院生命科学技术学院和干细胞与生物治疗研究中心给我提供这么好的实验平台和学习环境。感谢我的小伙伴们，郏亚静、于亚楠、任佩佩、李同彪、李天函等，有了你们，我的研究生生活才充满了色彩！谢谢你们！感谢我的师兄杨军政、何万里、刘世饶，师姐赵兴华、崔阳阳、冯培以及各位师弟师妹，对我实验上的帮助。感谢我的家人，你们对我的关心、支持、鼓励和无私的爱，让我在困难面前无所畏惧。你们是我最大的精神支撑！最后，再次向我的家人、导师以及所有帮助过我的老师、同学和朋友们表示最诚挚的感谢和最美好的祝愿！57 新乡医学院硕士学位论文个人简历纪晨燕女汉族中共党员硕士研究生出生年月：1989年7月籍贯：河南新乡毕业学校：新乡医学院专业：细胞生物学★教育背景2013.9-2016.6新乡医学院生物学理学硕士2011.9-2013.6南阳师范学院生物科学理学学士★研究领域干细胞基础与应用★语言及技能英语六级(CET-6)，英语听说读写流畅，能熟练查阅英文文献及撰写相关英文论文全国普通话水平测试一级乙等，已考取高级教师资格证熟练使用Office、Photoshop等办公、制图软件以及SPASS、DNAMAN、imagej等生物软件熟练掌握研究领域相关技术：细胞的冻存、复苏、传代、诱导、染色及转染；流式细胞技术；Westernblotting；免疫组化；DNA及RNA的提取与纯化；PCR；质粒提取；基因的克隆与表达、载体构建等★科研项目新乡医学院研究生科研创新支持计划资助项目：第二代抗精神病药物对3T3-L1及BMSC成脂分化的作用及机制（YJSCX20425Y）项目实施人发表论文：奥氮平对BMSCs成脂分化的作用及机制期刊名：解剖学报参与发明专利一项：一种多功能微生物培养装置（NO.ZL.201520190009.3）★获奖情况2009年获国家励志奖学金2010年获校说课大赛二等奖、校知识竞赛一等奖2011、2012年获三好学生证书2015年获优秀研究生干部称号★社会实践在校期间，担任社团副会长、校学生会干事、班级团支书。2013年6~9月：在郑州一辅导机构代课，担任辅导老师(主教数学、生物)节假日做家教、促销、在餐厅打工58