武汉协和医院肺部感染来源产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌及泛耐药铜绿假单胞菌分子流行病学特征和产ESBLs细菌异质性耐药机制初探

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分类号学号M201575648学校代码10487密级硕士学位论文武汉协和医院肺部感染来源产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌及泛耐药铜绿假单胞菌分子流行病学特征和产ESBLs细菌异质性耐药机制初探学位申请人：刘京学科专业：急诊医学指导教师：张劲农、王小溶答辩日期：2018年5月 AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreefortheMasterofMedicineMolecularcharacterizationofESBLsproducingE.ColiandK.pneumoniaefrompulmonaryinfection,aswellasextensively-drug-resistantP.aeruginosainWuhanUnionhospital,withapreliminarymechanismexplorationofESBLsproducingbacterialheterogeneityCandidate：LiuJingMajor：EmergencyMedicineSupervisor：ZhangJingnongWangXiaorongHuazhongUniversityofScience&TechnologyWuhan430074,P.R.ChinaMay,2018 －Ｊｔｆ３＾■議画—ｓ．ｍｎｌｔ＿眺ｌＪ 独创性声明的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的本人声明所呈交何其他个人引用的内容外，本论文不包含任，除文中己经标明研究成果。尽麵知的个人雜体’均己成集体写过麵究腿。对本文＿錄出麵己舰誠撰承担。：。本人完全意识到本声明的法律结果由本人／ｔ文中以明确方式标明？学位论文作者签名？曰期：知年ｊｒ月曰丨｜〇学位论文版权使用授权书，即：学校有权本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定保留并门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借向国家有关部可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进阅。本人授权华中科技大学和汇编本学位论文。、缩印或扫描等复制手段保存行检索，可以采用影印密后适用本授权书。保密□，在年解本论文属于不保密义“”内打ｖ）（请在以上方框指导教师签名：学位论文作者签名：曰期：年上月曰曰期：年ｖ厂 目录中英文缩略词……………………………………………………………………1中文摘要…………………………………………………………………………2Abstract…………………………………………………………………………7第一部分武汉协和医院肺部感染来源产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌分子流行病学特征1前言…………………………………………………………………………142材料与方法……………………………………………………………………163结果…………………………………………………………………………244讨论…………………………………………………………………………415结论…………………………………………………………………………49第二部分武汉协和医院泛耐药铜绿假单胞菌分子流行病学特征1前言…………………………………………………………………………502材料与方法……………………………………………………………………513结果…………………………………………………………………………574讨论…………………………………………………………………………595结论…………………………………………………………………………62第三部分产ESBLs细菌异质性耐药机制初步研究1前言…………………………………………………………………………632材料与方法……………………………………………………………………643结果…………………………………………………………………………654讨论…………………………………………………………………………675结论…………………………………………………………………………68参考文献…………………………………………………………………………69文献综述…………………………………………………………………………78综述参考文献……………………………………………………………………82致谢…………………………………………………………………………………85 中英文缩略词英文缩写英文全称中文全称ESBLsExtended-Spectrum-β-Lactamases超广谱β-内酰胺酶E.coliEscherichiacoli大肠杆菌K.pneumoniaeKlebsiellapneumoniae肺炎克雷伯杆菌PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应Rep-PCRRepetitiveExtragenicpalindromicPCR细菌基因组重复序列PCRMLSTMultilocusSequenceTyping多位点序列分析P.aeruginosaPseudomonasaeruginosa铜绿假单胞菌PMQRPlasmid-mediatedquinoloneresistancegenes质粒介导喹诺酮耐药基因QRDRQuinoloneResistanceDeterminingRegions喹诺酮类药物耐药决定区GFPGreenFluorescentProtein绿色荧光蛋白FIFluorescenceIntensity荧光强度CAPCommunityAcquiredPneumonia社区获得性肺炎HAPHospitalAcquiredPneumonia医院获得性肺炎VAPVentilatorAssociatedPneumonia呼吸机相关性肺炎CPISClinicalPulmonaryInfectionScore临床肺部感染评分NationalCommitteeonClinicalLaboratoryNCCLS临床实验室标准化委员会StandardsFSCFowardScatter前向散射光SSCSideScatter侧向散射光MICMinimumInhibitoryConcentration最低抑菌浓度1 华中科技大学硕士学位论文摘要第一部分武汉协和医院肺部感染来源产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌分子流行病学特征目的了解来源于肺部感染病人产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离株ESBLs基因流行情况，确定其基因亚型，基因背景及菌株特征，探讨产超广谱β-内酰胺酶细菌在我院肺部感染病人分布情况、耐药及传播机制，为临床医师用药及院内感染的控制提供依据。方法收集2015年11月-2016年6月来自华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科确证产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌及肺炎克雷伯杆菌分离菌株263株，剔除不合格标本，最终符合要求的菌株59株。用血琼脂培养基进行细菌培养，以药敏纸片法确证ESBL表型，以聚合酶链反应(PCR)法及测序检测CTX-M、SHV、TEM基因，PCR产物进行测序并确定其基因亚型，同时测定ESBL基因上游序列；以细菌基因组重复序列（Rep-PCR）、多位点序列分型（MLST）法检测细菌间的同源性。结果本院肺部感染产ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌检出率达22.43%，产ESBLs菌对三代、四代头孢、氨曲南、喹诺酮类抗生素耐药率高于60%，对阿米卡星、亚胺培南、美罗培南敏感率高于90%。在59份标本中，分离出31株大肠埃希氏菌，其中20株CTX-M基因阳性（占64.51%，分别为CTX-M-3、-14、-27），17株SHV基因阳性（54.84%，分别为SHV-12、-28、-77、81），3株TEM基因阳性（占9.68%，分别为TEM-1），1株菌同时携带SHV-77、-81，1株含有CTX-M、SHV、TEM2 华中科技大学硕士学位论文三种基因阳性（3.23%）。在分离的28株肺炎克雷伯菌中，21株CTX-M基因阳性（占75.00%，分别为CTX-M-3、-14、-27、-65），23株SHV基因阳性（82.14%，分别为SHV-1、-2、-11、-12、-28、-77、-78、-119），16株TEM基因阳性（57.14%，分别为TEM-1、-104、-135）；其中7株同时CTX-M、SHV、TEM三种基因阳性（25.00%）。MLST分型结果显示致病力、强耐药性及传播力强的的超级细菌ST131型大肠杆菌以及高毒力、携带多种耐药质粒高致病性的ST11型肺炎克雷伯杆菌在我院肺部感染患者中流行，值得我们高度警惕。此外还检测出4株耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯杆菌，均携带有NDM型基因。上游调控序列检测发现，CTX-M型基因上游序列ISEcp1、SHV型基因上游序列IS26参与ESBL传播及促进酶的表达。结论1)我院肺部感染产ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌检出率高，以呼吸机相关性肺炎占主要，主要集中在外科、重症医学科。2)产ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌总体耐药率高，特别是对三、四代头孢、氨曲南、喹诺酮类抗生素耐药率高，虽存在耐碳青霉烯抗生素肺炎克雷伯杆菌，但总体对碳青霉烯类抗生素敏感。此外，对阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦敏感度高，可作为替代或者联合用药。3)CTX-M型是我院产ESBLs菌株主要类型，其中以CTX-M-14占比最高。大肠杆菌以CTX-M型为主，肺炎克雷伯杆菌以SHV基因型为主。多基因携带情况多见。4)致病力、强耐药性及传播力强的的超级细菌ST131型大肠杆菌以及高毒力、携带多种耐药质粒高致病性的ST11型肺炎克雷伯杆菌在我院肺部感染患者中流行，值得我们高度警惕。5)本实验只发现有肺炎克雷伯杆菌同时携带产碳青霉烯酶和超广谱β-内酰胺酶耐药基因，其携带的碳青霉烯酶基因包括NDM基因。6)ISEcp1和IS26分别作为3 华中科技大学硕士学位论文CTX-M型、SHV型ESBLs基因上游序列，参与了CTX-M型、SHV型传播，且参与了促进了耐药基因的表达，是ESBL广泛流行的重要原因。关键词:CTX-MSHVTEM超广谱β-内酰胺酶产碳青霉烯酶ISEcp1IS26大肠埃希菌肺炎克雷伯菌4 华中科技大学硕士学位论文第二部分武汉协和医院泛耐药铜绿假单胞菌分子流行病学特征目的：调查研究我院泛耐药铜绿假单胞菌流行情况及耐药机制。方法：收集2016.1-2017.6武汉协和医院仅对多粘菌素敏感的泛耐药铜绿假单胞菌菌株，REP-PCR及MLST分析菌株同源性关系。PCR扩增检测产碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶基因、氨基糖苷钝化酶基因以及喹诺酮类耐药基因。结果：总共分离得到非重复816株铜绿假单胞菌，其中仅对多粘菌素敏感的菌株7株。经过MLST分型，7株菌共发现有6种类型，其中有两株同属于一个类型，ST274。两株为新类型，即ST2546、ST3001。耐药基因检测发现，7株铜绿假单胞菌均含有多种耐药基因。结论：1、我院仅对多粘菌素敏感的泛耐药铜绿假单胞菌检出率低于全国水平。从科室分布来看，内科系统检出率高于外科系统，其中以呼吸科、重症医学科为主。从标本类型来看，痰、胆汁明显多于血、尿标本。仅对多粘菌素敏感的泛耐药铜绿假单胞菌引起肺部感染、胆系特别是对有胆管支架植入术感染在我院仍不容乐观。2、从已有的数据来看，仅对多粘菌素敏感的泛耐药铜绿假单胞菌均有多基因携带情况，其中喹诺酮类耐药基因兼具染色体和质粒介导的多种类型，机制颇为复杂。3、ST274型铜绿假单胞菌在我院已经存在水平传播，该型铜绿假单胞菌易于形成突变系，再加上泛耐药的特性，给我们控制该菌株引起的感染带来了极大的挑战。关键词：铜绿假单胞菌泛耐药仅对多粘菌素敏感5 华中科技大学硕士学位论文第三部分产ESBLs细菌异质性耐药机制初步研究目的既往对于细菌的研究都是基于群体而忽视了个体间的差异，而实际上经过抗生素筛选后，单克隆来源的细菌间总有一小部分生存下来，这一小部分细菌在耐药性方面与其他有显著不同，本研究在第一部分的基础上，拟研究以单个细菌为对象，初步探究这种耐药性差异机制，为深入了解细菌在抗生素压力环境下的生存机制提供基础。方法前期已构建好含绿色荧光蛋白（GFP）与β-内酰胺酶基因的表达载体，在荧光显微镜下检测β内酰胺酶调控序列介导下GFP在单个细胞中的表达情况。通过流式分选分选经过过夜培养后的高低表达GFP的两组细菌，然后在流式分选及检测下分析高低亚群单克隆细胞间耐药水平的差异。同时检测药敏值差异。结果高低表达亚群细菌流式检测分析有明显差异，高表达组的细菌荧光强度高，细菌结构更复杂，生长速率更慢，耐药性高。低荧光蛋白表达亚群荧光强度低，生长速率快，耐药性低。结论1、单克隆来源的大肠埃希菌菌株间存在耐药水平的显著差异2、这种耐药水平的差异可能于某种物质调控细菌生长速率有关。关键词:GFP生长速率异质性耐药超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌6 华中科技大学硕士学位论文AbstractPartIMolecularcharacterizationofextended-spectrum-β-lactamases(ESBLs)producingEscherichiacoli,KlebsiellapneumoniaeisolatedfrompatientswithPneumoniainWuhanunionhospitalObjectiveTodetectthemolecularepidemiologyofextended-spectrumβ-lactamases’genesfromKlebsiellapneumoniaeandEscherichiacoliisolatedfromPneumonia,identifytheirsub-types,anddiscussthehomologyofresistantbacteriaaswellastoinvestigatethedistribution,resistancemechanism,andapproachoftransmissionso,thatcanprovideevidencefortheclinicaltherapyandcontrolofnosocomialinfection．Methods263specimensfromPneumoniawerecollectedinthefirstaffiliatedhospitalofHuazhongUniversityofScienceandTechnologyfromDecember2015toJune2016.Total59sampleswerecollectedafterexcludingunqualifiedcases.ESBLsphenotypewasascertainedbycompositediskmethodafterbacteriaculturedinbloodagarmedium.Firstly,CTX-M,SHV,andTEMgenesweredetectedbyPCR.Then,wehadsequencedPCRproductsalongwithupstreamISEcp1andIS26,asISEcp1andIS26upstreamsequencescontributetoESBLsexpression.HomologousanalysisweremeasuredwiththehelpofrepetitiveextragenicpalindromicPCR(Rep-PCR)andmultilocussequencetyping(MLST).ResultsThepercentageofESBL-producingisolatesfrompneumoniawas22.43%,7 华中科技大学硕士学位论文amongthemspeciesproducingESBLshadthehighestrateofcephalosporinresistance.E.coliandK.pneumoniaeshowedresistanttoFluoroquinolonesandmostoftheβ-lactams,withtheexceptionofimipenem,ertapenem,amikacin,andpiperacillin/tazobactam.31strainsofEscherichiacoliand28strainsofKlebsiellapneumoniaewereisolatedfrom59specimens.Among31strainsofEscherichiacoli，20strains(64.51%)carriedCTX-MgenespredominatelyCTX-M-3,CTX-M-14,andCTX-M-27;17strains(54.84%)carriedSHVgenespredominatelySHV-12,SHV-28,SHV-77,andSHV-81;3strain(9.68%)carriedTEM-1,respectively.1oftheESBLsphenotypepositivestraincarriedtwogenes(SHV-77andSHV-81),and1morestrain(3.23%)carried3genes(CTX-M-14,SHV-77,TEM-1)atthesametime.Amongthe28strainsofKlebsiellapneumoniae,21strains(75.00%)carriedCTX-MgenespredominatelyCTX-M-3,CTX-M-14,CTX-M-27,andCTX-M-65;23strains(82.14%)carriedSHVgenespredominatelySHV-1,SHV-2,SHV-11,SHV-28,SHV-77,SHV-78,andSHV-119;16strain(57.14%)carriedTEMgenespredominatelyTEM-1,TEM-104,andTEM-135;7strain(25%)simultaneouslycarriedCTX-M,SHV,andTEMgenes.MLSTanalysisshowedthatST131wasthepredominantsub-typesofE.colistrainswhereasST11waspredominantsub-typesofK.pneumoniaestrains.Only4Carbapenem-resistantK.pneumoniaewithNDMgenewasdetected.Conclusions(1)ThepercentageofESBL-producingE.coliandK.pneumoniaeinourhospitalishigh,mainlydistributedinsurgerydepartmentandICU.Amongthem8 华中科技大学硕士学位论文ventilator-associatedpneumoniawasthecommonestone.(2)E.coliandK.pneumoniaeshowedresistanttoFluoroquinolonesandmostoftheβ-lactams,withtheexceptionofimipenem,ertapenem,amikacin,andpiperacillin/tazobactam.,so,thesefourantibioticsmightbeappropriatealternativesfortreatingpneumoniaduetoESBL-producingisolates(3)theCTX-Mwasthemaindrug-resistantgeneinEscherichiacoli,amongthemCTX-M-14wasthemostcommonsub-type;butSHVwasthemaindrug-resistantgeneinKlebsiellapneumoniae,amongthemSHV-11wasthemostcommonsub-type.Thedifferentsub-typesofSHVmightexistinthesamestrain.ESBLsphenotypepositiveEnterobacteriaceaecancarrymanytypesESBLsgenes.(4)ST131E.coliandST11K.pneumoniaewerehighlyinvasiveandhyper-virulent,spreadinginhospitals,especiallyinsurgerydepartment.(5)inmystudy,theco-existingESBLsandCarbapenem-resistantwasonlyobservedinK.pneumoniae,thatalsocarryNDMgene.(6)ISEcp1andIS26contributedtotheexpressionofESBLs.Keywords:CTX-M,SHV,TEM,extended-spectrum-β-lactamase,Carbapenem-resistant,ISEcp1,IS26,Escherichiacoli,Klebsiellapneumoniae9 华中科技大学硕士学位论文PartIIClinicalepidemiologyandmolecularcharacterizationofextensively-drug-resistantPseudomonasaeruginosainWuhanunionhospitalObjectiveToinvestigatetheepidemiologyandmolecularcharacterizationofresistancemechanismsofextensively-drug-resistantPseudomonasaeruginosainWuhanunionhospitalMethodsThedatabaseatourclinicalmicrobiologylaboratorywasreviewedtoidentifypatientswithP.aeruginosainfectionfromJanuary2016toJune2017atthefirstaffiliatedhospitalofHuazhongUniversityofScienceandTechnology.Carbapenemresistance,Extended-Spectrum-β-Lactamase,Aminoglycosideresistance,andquinoloneresistancegenesweredetectedbyPCRandthesePCRproductsweresequenced.HomologousanalysiswasmeasuredwiththehelpofrepetitiveextragenicpalindromicPCR(Rep-PCR)andmultilocussequencetyping(MLST).ResultsOnly7isolatesoutof816(0.86%)werecolistin-only-sensitivePseudomonasaeruginosastrainsdisplayingresistancetoallantimicrobialagentsexceptcolistin.MultilocusSequencetyping(MLST)showedthattheisolatesbelongedtosixdifferentSTs,amongthem,twosharedthesameSTssequencetypeST274.AmongsixdifferentSTs,thereweretwonovelSTs:ST2546andST3001.These7isolateswhowereextensivelydrug-resistantP.aeruginosastrainswerealsoassociatedwithmultipledrug10 华中科技大学硕士学位论文resistancegenes.Conclusions1)Thepercentageofcolistin-only-sensitiveP.aeruginosainourhospitalwaslower,mainlydistributedinRespiratoryDepartmentandICU.Sputumandbilecultureswerepredominantlyspecimens.Totreatpatientswithpulmonaryinfectionandbiliarystentshistoryisgreatchallengeforus.2)co-existenceofmultipledrugresistancegenesincolistin-only-sensitiveP.aeruginosawasuniversalinmyresearch.Plasmid-mediatedquinoloneresistancegenes(PMQR)andQuinoloneResistanceDeterminingRegionsgenes(QRDR)weredetectedatthesametimebyPCR.3)ST274P.aeruginosaalongwithcolistin-only-sensitivecharacterizationwillbeagreattroubleforpatientswhosufferedfromchronicpulmonaryinfection.Keywords:Pseudomonasaeruginosa；extensively-drug-resistant；colistin-only-sensitive11 华中科技大学硕士学位论文PartIIIApreliminarymechanismexplorationofESBLsproducingbacterialheterogeneityObjectivePreviousstudyaboutbacteriaresistancewasbasedonthedifferentclonalpopulationsdatawithignoringcell-to-cellvariation.But,asmallpartofisolatessurviving,whoseresistanceareobviouslydifferentfromothers,eventhoughaftercompleteantibioticstreatment.Therefore,myaimofthisresearchisbasedonmypreviousworkonthemolecularcharacteristicsofESBLstofurtherinvestigatethecell-cellvariationonsinglecelllevel,andalsothemechanismsofdiversificationinantibioticresistancefromsignalclonalcells,whichcanprovidethebasicknowledgeforbacteriathatcanfightagainstthefluctuatingstressofantibiotics.MethodsAspecificexpressionvectorpUA66carryinggreenfluorescentprotein(GFP)geneandthetranscriptionalregionofESBLwiththeirentirecodingsequenceswasreconstructedpreviously.FluorescencemicroscopewereappliedtoanalyzetheexpressionpatternoftheESBLgeneinsinglecellviaGFPreporters,andflowcytometrywasusedtosortoutthehighandlowfluorescenceintensityisolates，alongwithanalysisofthedrugresistancedifferencebetweenthesetwosub-groups(highintensityisolatesandlowintensityisolates).ResultsTheflowcytometryanalysisshowedremarkablydifferencebetweentwogroups.Cellswithhighfluorescenceintensity(FI)weremorecomplexinthecontextofbacteria12 华中科技大学硕士学位论文structure,grewslower,andwaspronetodrugresistancecomparedtocellswithlowfluorescenceintensity(FI).Conclusions1)Heterogeneousresistancelevelsexistsinsingleclonalpopulation2)Theremightbeexistenceofakeyfactorcausingheterogeneousresistanceviamodulatingbacteriagrowthrate.Keywords:GFP,heterogeneousresistance,growthrateflowcytometry13 华中科技大学硕士学位论文第一部分武汉协和医院肺部感染来源产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌分子流行病学特征前言感染性疾病一直以来是一个重大的社会问题，人类一直在与之不懈的战斗。自1940年第一个抗生素青霉素的问世以及后续各种抗菌药物被发现，很多细菌感染性疾病得到了有效控制，人类获得了治疗和战胜感染性疾病的有效武器，挽救了无数人的性命。随着抗生素的广泛应用，耐药菌的发展与传播也变得也来越严重，使一些原有的抗生素失去了药效，甚至产生了对各种抗生素耐药的超级细菌，给人类的健康(1)带来了巨大的威胁。1983年第一株产ESBL（Extended-Spectrumβ-Lactamases,ESBL）肺炎克雷伯杆菌在德国首次被报道，此后ESBL基因在肠杆菌科细菌，尤其是大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌为代表的细菌中迅速广泛传播流行。(2-3)产ESBL菌株所引起的肺炎、尿路感染、败血症等治疗难度大，病死率高，给人类的健康带来了巨大威胁的同时也导致沉重的社会、经济负担。我国大陆地区大肠埃希菌及肺炎克雷伯杆菌检出率很高并呈现逐年增长趋势，根据CHINET细菌耐药性监测显示，2005-2010年住院患者中ESBLs检出率大肠埃希菌(4-9)从38.9%上升至56.2%，肺炎克雷伯杆菌从39.1%上升至43.6%.由于抗生素的不适当或过度使用导致产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌逐渐发展演变为多耐药、广泛耐药和全耐药细菌进一步增加治疗难度和病死率。2008-2010年流行病学调查(10)发现肠杆菌科细菌对头孢噻肟耐药率为66.7%，对头孢他啶耐药率为35.4%.14 华中科技大学硕士学位论文2009年国内13家教学医院临床流行病学调查发现，医院获得性肺炎病原学中大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的比例分别为27.1%和10.8%，占革兰阴性菌的第三位(11)和第四位。尿路感染中产ESBL的大肠埃希菌52.3%-68.8%，肺炎克雷伯杆菌(12-13)43.8%-49.1%.肠杆菌科特别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌是导致腹腔感染最常见的病原菌。对于发生于外伤及手术后的颅内感染，肠杆菌占所有细菌性感染的(14)5.2%左右，其中大肠埃希菌及肺炎克雷伯杆菌分别占23.9%和32.6%；此外肠杆菌也是慢阻肺急性加重、支气管扩张急性加重等的主要病原体之一。人类对于感染性疾病的斗争还将会持续下去，在面对细菌抗菌药物耐药性日益增强的同时，我们不仅要谨慎选用抗生素，同时要对细菌耐药性监测做好相关工作，随时掌握最新的细菌耐药性信息，为临床用药提供科学依据。15 华中科技大学硕士学位论文材料与方法一、材料1、病例、菌株来源收集2015年11月-2016年6月来自华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科确证产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌及肺炎克雷伯杆菌标本对应的住院病历263份，剔除痰标本不合格（白细胞<25个/视野，上皮细胞>10/视野或者鳞状上皮细胞/白细胞<1：2.5）、杂菌污染或菌株标本缺失对应的病例以及菌株相对应病人信息不全病例，最终诊断为“肺部感染”的病例59份，其中痰标本54例；血标本5例。诊断标准符合中华医学会呼吸病学分会制定的社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎（HAP）、呼吸机相关性肺炎（VAP）标准。对于收集的菌株均经华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科微生物室统一培养，对培养阳性的细菌菌落进一步分离鉴定。共计培养出大肠埃希菌31株,肺炎克雷伯菌28株。菌种鉴定采用TMphoenix100全自动微生物鉴定仪(美国Becton,Dickinson公司)。收集菌株置于4℃冰箱内保存；并随机抽取同期从下呼吸道标本中检测出非产ESBLs肺炎克雷白菌和大肠埃希菌患者共47例。社区获得性肺炎（CAP）诊断标准：1.1新近出现咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重并出现脓性痰，伴或不伴胸痛1.2发热1.3肺实变体征和（或）闻及湿罗音991.4WBC>10×10/L或<4×10/L，伴或不伴中性粒细胞核左移1.5胸部X线检查示片状、斑片状侵润性阴影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。（以上l一4项中任何1项加第5项，并除外肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸性粒细胞浸润症及肺血管炎等非感染性疾病可作出诊断。）16 华中科技大学硕士学位论文医院获得性肺炎（HAP）诊断标准：院内获得性肺炎（HAP）：患者入院时不存在，也不处于潜伏期，而于入院48小时后在医院内发生的肺炎。院内获得性肺炎的诊断标准1.发热超过38℃2.血白细胞增多或减少3.脓性气道分泌物X线检查出现新的或进展的肺部侵润影加上上述临床症状中两个或以上可以诊断。呼吸机相关性肺炎（VAP）诊断标准;呼吸机相关性肺炎（VAP）：机械通气48h后至拔管后48h内出现的肺炎。呼吸机相关性肺炎的诊断标准：简化的临床肺部感染（CPIS）评分标准：分值特征012气道分泌物少多，非脓性多，脓性胸片肺内侵润影无弥漫局部融合体温（℃）36.5℃≤T≤38.4℃38.5℃≤T≤38.9℃≤36℃或≥39℃外周血白细胞（×109/L）4≤WBC≤11<4或>11<4或>11且带状核≥0.5氧合指数（mmHg）>240或ARDS≤240或无ARDS微生物学指标阴性阳性阳性且与革兰式染色一致注：建立人工气道、行机械通气的患者，入院后第三天评估CPIS评分，当CPIS评分>6，且呼吸道分泌物革兰染色出现阳性结果时诊断为呼吸机相关性肺炎。2、抗生素药敏纸片均购自北京天坛药物生物技术开发公司:头孢噻肟(CTX,30μg)、头孢他17 华中科技大学硕士学位论文啶(CAZ,30μg)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA,30ug/10μg)和头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA,30ug/10μg)。3、仪器与试剂3.1.1、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、M—H水解酪蛋白胨(北京天坛生物技术研究所产品)。3.1.2、PCR试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、TaqDNA聚和酶、dNTPs、DNAMaker(D2000)均为北京天根生化科技有限公司产品，引物为上海英潍捷基技术有限公司合成，琼脂糖凝胶(美国sigma公司产品)。3.1.3、质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯杆菌ATCC700603，3.2、生化培养箱SPX-250BIII（天津市泰斯特仪器有限公司）、CO2Incubator(美TM国Sheldon公司)、phoenix100全自动微生物鉴定仪(美国Becton,Dickinson公司)、PCR扩增仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)、BioDoc-It220凝胶成像分析系统(美国UVP公司)、恒温摇床（美国Crystal公司）、高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）。二、方法1、细菌分离与鉴定将合格痰标本接种于血琼脂平板和麦康凯琼脂平板两种培养基，置于35℃细菌培养箱孵育24小时后进行疑似病原菌的分离及在phoenix100自动微生物鉴定仪上鉴定。2、ESBLs表型筛选和确定试验：按美国临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)标准(2010)所推荐的方法进行操作,使用CAZ及CAZ/CA纸片、CTX及CTX/CA纸片,若其中任何一对纸片加克拉维酸比不加克拉维酸纸片抑菌圈直径≥5mm判定为产ESBLs菌株。3、药敏试验TM依据临床实验室标准化委员会(NCCLS)的标准，采用Phoenix100全自动微生物分析仪对纳入试验的菌株进行菌株鉴定及微量稀释法做药敏实验。药敏实验包括以下药18 华中科技大学硕士学位论文物：头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林克拉维酸、氨苄西林舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、氯霉素。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯杆菌：ATCC700603。4、产ESBLs菌株基因分型4.1产ESBLs菌株质粒DNA的提取：通过细菌基因组DNA提取试剂盒(蛋白酶K消化法)制备收集的59株产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌菌株的质粒DNA作为扩增模板4.2PCR扩增ESBL基因引物依据PUBMED数据库提供的耐药基因序列，由上海英潍捷基生物公司合成，见表1。按照试剂盒说明进行菌株质粒DNA提取。PCR的反应体系:DNA混合酶12.5ul,引物1（10μM）1μl，引物2（10μM）1μl，待测模板DNA1μl,加双蒸水至25μl。反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30S,54℃退火30S，共32个循环,最后72℃延伸8min，4℃保存。在1.5%琼脂糖凝胶中按照10000:1体积比加入相应的GelRed染色剂，然后将产物在100mv电压下电泳40min,最后在紫外灯凝胶成像分析系统下观察结果。PCR产物送北京赛默飞生物技术有限责任公司行测序。结果在PUBMED比对查询。表1PCR扩增的引物序列、片段长度和设计引物的序列号基因型引物碱基序列扩增片段长度（bp）序列号CTX-M(Group1)FTGTTATTTCGTCTCTTTCAG926AM003905RCATTCCCTTTCCGCTATTACCTX-M(Group2)FTGAAGGCCGAGGGATAATAC986DQ125241RGTTGCAAGACAAGACTGAAGCTX-M(Group8)FCAGGAGTTTGAGATGATGAG910AF189721RGAGCGCTCCACATTTTTTAGCTX-M(Group9)FCGTATTGGGAGTTTGAGATG907EF570051RTTCAACAAAACCAGTTACAG19 华中科技大学硕士学位论文CTX-M(Group25)FAGGATGATGAGAAAAAGCGT923AF518567RTACAAATAGTAAGTGGAGCGSHVFGCCCTCACTCAAGGATGTAT888AF132290RTTAGCGTTGCCAGTGCTCGA注:F:上游引物；R:下游引物。5、菌株同源性分析5.1对保留的产ESBLs肺炎克雷白菌和大肠埃希菌进行细菌基因组重复序列PCR同源性分析。5.1.1提取细菌基因组DNA-使用北京天根生化科技有限公司产品柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒制备。所提取DNA置入4℃冰箱内保存。5.1.2以此DNA为模板，上海英潍捷基生物技术有限公司合成的Rep-PCR为随机引物，其序列为ERIC1R(5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3')和ERIC2(5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3')。PCR的反应体系:DNA混合酶12.5ul,ERIC1R（10μM）1μl，ERIC2（10μM）1μl，待测DNA模板2μl,加双蒸水至25μl。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性1min,42℃退火1min,65℃延伸8min,循环35次;最后65℃延伸16min;4℃保存.产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,电压选用100V，电泳时间约为25-40分钟,按10000:1比例加入GelRed染色剂,在紫外灯凝胶成像分析系统下观察分析结果。并拍照，记录结果。5.2对保留的产ESBLs肺炎克雷白菌和大肠埃希菌进行多位点序列分型（MLST）同源性分析。①大肠杆菌MLST分型5.2.1提取细菌基因组DNA-使用北京天根生化科技有限公司产品柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒制备。所提取DNA置入4℃冰箱内保存。[15]5.2.2依据Wirth等推荐的方法进行，选取七个管家基因包括“adk，fumC，gyrB，icd，mdh，purA，recA”进行分析。引物序列如表20 华中科技大学硕士学位论文2所示，PCR的反应体系:DNA混合酶12.5ul,引物1（10μM）1μl，引物2（10μM）1μl，待测模板DNA1μl,加双蒸水至25μl。反应条件:95℃预变性5min;95℃变性1min,50℃-60℃退火1min,72℃延伸1min,循环30次;最后72℃延伸5min;4℃保存.产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,电压选用100V，电泳时间约为25-40分钟,按10000:1比例加入GelRed染色剂，在紫外灯凝胶成像分析系统下观察分析结果。拍照并记录结果。取5μlPCR产物于1.5%凝胶电泳检测，剩余PCR产物直接送公司测序。对获得的等位基因序列信息进行处理、分析，并通过PUBMEDMLST数据库确定分型。表2大肠杆菌MLST分型引物序列PrimerSequence(5'-3')扩增片段退火E.coli长度（bp）温度（ºC）adkF1TCATCATCTGCACTTTCCGC58354adkR1CCAGATCAGCGCGAACTTCAfumCR1TCCCGGCAGATAAGCTGTGG80654fumCRFTCACAGGTCGCCAGCGCTTCgyrBFTCGGCGACACGGATGACGGC91160gyrBR1GTCCATGTAGGCGTTCAGGGicdFATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACA87854icdRGGACGCAGCAGGATCTGTTmdhF1AGCGCGTTCTGTTCAAATGC93260mdhR1CAGGTTCAGAACTCTCTCTGTpurAF1TCGGTAACGGTGTTGTGCTG81654purARCATACGGTAAGCCACGCAGArecAR1AGCGTGAAGGTAAAACCTGTG78058recAFCGCATTCGCTTTACCCTGACC②肺炎克雷伯杆菌MLST分型[16]依据Diancourt等推荐的方法进行，选取七个管家基因21 华中科技大学硕士学位论文“rpoB，gapA，mdh，pgi，phoE，infB，tonB”进行分析。引物序列如表3所示。PCR的反应体系:DNA混合酶12.5ul,引物1（10μM）1μl，引物2（10μM）1μl，待测模板DNA1μl,加双蒸水至25μl。反应条件:95℃预变性2min;95℃变性1min,50℃/60℃退火1min,72℃延伸1min,循环30次;最后72℃延伸5min;4℃保存.产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,电压选用110V，电泳时间约为25-40分钟,按10000:1比例加入GelRed染色剂，在紫外灯凝胶成像分析系统下观察分析结果。并拍照，记录结果。取5μlPCR产物1.5%凝胶电泳检测，剩余PCR产物直接送公司测序。对获得的等位基因序列信息进行处理、分析，并通过PUBMEDMLST数据库确定分型。表3肺炎克雷伯杆菌MLST分型引物序列PrimerSequence(5'-3')扩增片段退火K.pneumoniae长度（bp）温度（ºC）rpoBFGGCGAAATGGCWGAGAACCA50150rpoBRGAGTCTTCGAAGTTGTAACCgapAFTGAAATATGACTCCACTCACGG45060gapARCTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT50mdhFCCCAACTCGCTTCAGGTTCAG47750mdhCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG50pgiFGAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC43250pgiRCGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT50phoeFACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG42050phoeRTGATCAGAACTGGTAGGTGAT50infBFCTCGCTGCTGGACTATATTCG31850infBRCGCTTTCAGCTCAAGAACTTC50tonBFCTTTATACCTCGGTACATCAGGTT41150tonBRATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG22 华中科技大学硕士学位论文6.上游调控序列分析6.1提取细菌基因组DNA-使用北京天根生化科技有限公司产品柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒制备。所提取DNA置入4℃冰箱内保存。[17]6.2利用PCR和测序方法得到CTX-M和SHV基因的上下游序列，参照DiestraK报道方法设计引物和PCR反应条件。对所有blaCTX和blaSHV基因进行基因背景分析。PCR的反应体系:DNA混合酶12.5ul,引物1（10μM）1.5μl，引物2（10μM）1.5μl，待测模板DNA2μl,加双蒸水至25μl。反应条件:95℃预变性5min;95℃变性10sec,55℃退火15sec,72℃延伸1min,循环30次;最后72℃延伸5min;4℃保存.产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,电压选用100V，电泳时间约为30分钟,按10000:1比例加入GelRed染色剂，在紫外灯凝胶成像分析系统下观察分析结果。并拍照，记录结果。取5μlPCR产物1.5%凝胶电泳检测，剩余PCR产物直接送公司测序。结果在PUBMED比对查询。7．统计学处理所有数据均采用SPSS23．0统计软件分析，两组均数比较，符合正态分布数据使用t检验，不符合正态分布数据采用非参数检验；两组间样本数少于40用Fisher精准检验。所有检验均为双侧性，以P<0．05判为差异有统计学意义。23 华中科技大学硕士学位论文结果一、106株细菌标本对应的病人中，检测出产ESBLs肺炎克雷伯杆菌和大肠埃希菌病人(阳性组)共59例，男性41例，女性18例，年龄18-90岁。非产ESBLs肺炎克雷白菌和大肠埃希菌病人(阴性组)共47例，男性33例，女性14例，年龄18-90岁。两组性别、年龄比较无统计学差异(P>O．05)。106株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌菌株，经酶抑制剂增强纸片扩散法确认产ESBLs菌株59株，检出率为55.66％(59／106)，其中大肠埃希菌检出率为77.5％(40／31)，肺炎克雷伯菌检出率为42.42％(28／66)。痰标本检出率65.85%（54/82），血标本检出率35.71%（5/14）。痰标本中肺炎克雷伯杆菌占主要62.20%（51/82）；血标本中大肠埃希菌占主要64.29%（9/14）见表4-6.。CAP占22%（13/59），HAP占22%（13/59），VAP占56%（33/59）见图1。表4下呼吸道感染ESBLs检出率病原菌总数产ESBLs数检出率大肠埃希菌403177.5%肺炎克雷伯杆菌662842.42%总计1065955.66%表5下呼吸道感染痰、血标本ESBLs检出率标本类型总数产ESBLs数检出率痰825465.85%血14535.71%总计1065955.66%表6痰、血标本大肠埃希菌与肺炎克雷伯杆菌分布标本类型大肠埃希菌肺炎克雷伯杆菌总计痰31（37.8%）51（62.20%）82血9（64.29%）5（35.71%）1424 华中科技大学硕士学位论文图159列标本CAP、HAP、VAP分布比例二、各科肺炎痰、血标本产ESBLs检出率表7各病区产ESBLs菌株检出情况科室大肠埃希菌和肺炎产ESBLs的大肠埃希菌ESBLs检出率克雷伯杆菌菌株数肺炎克雷伯杆菌菌株（%）神经外科301550.00心外科12975.00神经内科11327.27重症医学科10880.00心内科10440.00感染科6350.00胸外科44100综合内科4375.00血液科4125.00呼吸科3266.67肿瘤科3266.67普外科3266.67其他科室6350.00合计1065955.66表7可以看出，胸外科、重症医学科、心外科、综合内科产ESBLs检出率较高;分别为100%（4/4）、80%（8/10）、75%（9/12）、综合内科75%（3/4）三、肺部感染痰、血标本大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的药敏结果+-1、106例ESBLs和ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌菌株药敏结果+-106例ESBLs和ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌菌株药敏结果显示，耐药性最高的为氨苄西林、头孢唑林、哌拉西林，分别为90.6%、67.42%、65.56%；敏感性最好的为美罗培南、亚胺培南、阿米卡星；分别为97.17%、96.23%、95.28%。5925 华中科技大学硕士学位论文株产ESBLs菌株对青霉素类氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林克拉维酸、氨苄西林舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦耐药率分别为100%、100%、20.3%、57.6%、16.9%；对头孢唑林、头孢他啶、头孢吡肟耐药率分别为100%、59.32%、83.1%；对氨曲南、阿米卡星、庆大霉素耐药率分别为72.9%、8.5%、57.6%；对亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、氯霉素耐药率分别为6.8%、5.1%、67.2%、64.4%、61.2%、48.5%.而47株非产ESBLs菌株对对青霉素类氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林克拉维酸、氨苄西林舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦耐药率分别为78.7%、0、2.1%、13.3%、2.1%；对头孢唑林、头孢他啶、头孢吡肟耐药率分别为3.3%、0、0；对氨曲南、阿米卡星、庆大霉素耐药率分别为0、0、2.1%；对亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、氯霉素耐药率分别为0、0、4.3%、4.3%、61.2%、48.5%.尚未发现对替加环素耐药菌。具体见表8.表8106例大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌药敏结果＋－抗身素平均药敏（106株）ESBLs菌药敏（59株）ESBLs菌药敏（47株）RISRISRISAMP90.602.806.601000078.706.4014.90PIP65.563.3331.111000009.7090.30AMC12.2623.5864.1620.3039.0040.702.104.3093.60SAM36.5119.0544.4457.6036.406.1013.30086.70TZP10.396.6083.0116.9011.9071.202.10097.90CZO67.42032.58100003.30096.70CAZ33.028.4958.4959.3215.2525.4300100CRO55.66044.341000000100FEP46.237.5446.2383.1013.603.4000100ATM40.574.7254.7172.908.5018.6000100AMK4.72095.288.50091.5000100GEN33.020.9466.0457.6042.402.102.1095.70IPM3.77096.236.80093.2000100MEM2.83097.175.10094.9000100CIP39.058.5752.3867.2013.8019.004.302.1093.60LVX37.740.9461.3264.401.7033.904.30095.70SXT35.423.1361.4561.206.1032.708.50091.50CHL28.574.7666.6748.503.0048.506.706.7086.70注：AMP氨苄西林，PIP哌拉西林，AMC阿莫西林克拉维酸，SAM氨苄西林舒巴坦，TZP哌拉西林他唑巴坦，CZO头孢唑林，CAZ头孢他啶，CRO头孢曲松，FEP头孢吡肟，ATM氨曲南，AMK阿米卡星，GEN庆大霉素，IPM亚胺培南，MEM美罗培南，CIP环丙沙星，LVX左氧氟沙星，SXT复方新诺明，CHL氯霉素26 华中科技大学硕士学位论文+-2、40株ESBL与ESBL大肠埃希菌耐药情况比较+-表940株ESBL与ESBL大肠埃希菌耐药情况比较+－抗生素ESBLs菌(31株)ESBLs菌（9株）P值RISRISAMP1000066.7033.30.009PIP10000001000.000AMC6.52964.511.122.266.70.001SAM35.352.911.837.5062.50.092TZP3.26.590.311.1088.90.422CZO10000200800.000CAZ54.89.735.5001000.002CRO10000001000.000FEP87.112.90001000.000ATM77.43.219.4001000.000AMK3.2096.8001001.000GEN41.9058.111.1088.90.124IPM0010000100-MEM0010000100-CIP77.43.219.422.2077.80.003LVX77.4022.622.2077.80.008SXT47.84.447.833.3066.70.464CHL23.55.970.612.512.5750.655注：AMP氨苄西林，PIP哌拉西林，AMC阿莫西林克拉维酸，SAM氨苄西林舒巴坦，TZP哌拉西林他唑巴坦，CZO头孢唑林，CAZ头孢他啶，CRO头孢曲松，FEP头孢吡肟，ATM氨曲南，AMK阿米卡星，GEN庆大霉素，IPM亚胺培南，MEM美罗培南，CIP环丙沙星，LVX左氧氟沙星，SXT复方新诺明，CHL氯霉素从表9可以看出，31株产ESBLs菌对头孢唑林、氨苄西林、头孢曲松、哌拉西林耐药率为100%，对头孢吡肟、头孢他啶耐药率分别为87.1%、54.8%；对β-内酰胺与酶抑制剂抗生素阿莫西林克拉维酸、氨苄西林舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦耐药率分别为6.5%、35.3%、3.2%；对氨基糖苷类阿米卡星、庆大霉素耐药率分别为3.2%、41.9%；对喹诺酮类环丙沙星、左氧氟沙星耐药率相同，为77.4%；对氨曲南、复方新诺明、氯霉素耐药率分别为77.4%、47.8%、23.5%；对碳青霉烯类亚胺培南、美罗培南无耐药株。9株非产ESBLs菌对哌拉西林、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、阿米卡星敏感率为100%，对氨苄西林敏感率最低为33.3%，其次为氨苄西林舒巴坦，为62.5%,对阿莫西林克拉维酸、复方新诺明、头孢唑林、氯霉素敏感率分别为66.7%、27 华中科技大学硕士学位论文66.7%、80%、75%；对哌拉西林他唑巴坦、庆大霉素敏感率相同，为88.9%。+-3、66株ESBL与ESBL肺炎克雷伯杆菌耐药情况比较+-表1066株ESBL与ESBL肺炎克雷伯杆菌耐药情况比较+－2抗生素ESBLs菌(28株)ESBLs菌（38株）ⅹP值RISRISAMP1000081.67.910.51.7650.184PIP10000010.389.762.0000.000AMC35.75014.30010029.1640.000SAM81.218.804.5095.553.1660.000TZP32.117.9500010014.4710.000CZO100000010066.0000.000CAZ64.321.414.30010022.3370.000CRO100000010066.0000.000FEP78.614.37.10010053.9920.000ATM67.914.317.90010043.3760.000AMK14.3085.7001003.5420.060GEN7502502.697.440.9940.000IPM14.3085.7001003.5420.060MEM10.7089.3001002.1530.142CIP55.625.918.502.697.438.9300.000LVX503.646.40010025.1130.000SXT73.17.719.22.6097.441.7820.000CHL750254.54.590.932.9920.000注：AMP氨苄西林，PIP哌拉西林，AMC阿莫西林克拉维酸，SAM氨苄西林舒巴坦，TZP哌拉西林他唑巴坦，CZO头孢唑林，CAZ头孢他啶，CRO头孢曲松，FEP头孢吡肟，ATM氨曲南，AMK阿米卡星，GEN庆大霉素，IPM亚胺培南，MEM美罗培南，CIP环丙沙星，LVX左氧氟沙星，SXT复方新诺明，CHL氯霉素从表10可看出，28株产ESBLs肺炎克雷伯杆菌对头孢曲松、氨苄西林、头孢唑林、哌拉西林耐药率为100%，对头孢吡肟、头孢他啶耐药率分别为78.6%、64.3%；对β-内酰胺与酶抑制剂抗生素阿莫西林克拉维酸、氨苄西林舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦耐药率分别为35.7%、81.2%、32.1%；对氨基糖苷类阿米卡星、庆大霉素耐药率分别为14.3%、75%；对喹诺酮类环丙沙星、左氧氟沙星耐药率分别为55.6%、50%；对氨曲南、复方新诺明、氯霉素耐药率分别为67.9%、73.1%、75%；对碳青霉烯类亚胺培南、美罗培南耐药率分别为14.3%、10.7%。38株非产ESBLs菌对氨曲南、28 华中科技大学硕士学位论文阿米卡星、头孢吡肟、左氧氟沙星、头孢唑林、头孢他啶、阿莫西林克拉维酸、哌拉西林他唑巴坦无耐药菌株出现，敏感率100%；对复方新诺明、庆大霉素、环丙沙星敏感率相同，为97.4%；对氨苄西林舒巴坦、氯霉素、哌拉西林敏感率分别为95.5%、90.9%、89.7%；氨苄西林敏感率最低，为10.5%。四、59株产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌基因分型1、59株菌的PCR扩增结果使用CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25、SHV、TEM共7对ESBLs引物对59株产ESBLs菌株DNA进行PCR扩增，扩增产物片段大小与预期相符。结果如图2、3。CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-25组未扩增出产物。注:最左边为Marker，菌株编号从左至右，从上到下分别为11、12、13、14、15、16图2部分大肠埃希菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果29 华中科技大学硕士学位论文注:最左边为Marker，菌株编号从左至右，从上到下分别为28、29、30、31、32、33图3部分肺炎克雷伯杆菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果2、CTX-M、SHV、TEM基因检测及分布情况表1159株产ESBLs菌株基因型结果病原菌数量PCR扩增结果blaCTX-M检出率blaSHV检出率blaTEM检出率大肠埃希菌3120（64.51%）17（54.84%）3（9.68%）肺炎克雷伯杆菌2821（75.00%）23（82.14%）16（57.14%）合计5941（69.49%）40（67.80%）19（32.20%）3、多基因型携带情况分析表1259株产ESBLs菌株多基因型携带情况基因型组合大肠埃希菌（31株）肺炎克雷伯杆菌（28株）合计（59株）株数株数株数CTX-M+SHV6（19.35%）10（35.71%）16（27.12%）CTX-M+TEM1（3.23%）3（10.71%）5（8.47%）SHV+TEM05（17.86%）5（8.47%）CTX-M+SHV+TEM1（3.23%）7（25.00%）8（13.56%）合计8（25.81%）25（89.29%）34（57.63%）30 华中科技大学硕士学位论文4、CTX-M、SHV、TEM各基因亚型分布情况表1359株产ESBLs菌株CTX-M、SHV、TEM各基因亚型分布情况基因型亚型大肠埃希菌（31株）肺炎克雷伯杆菌（28株）合计（59株）株数/百分比株数/百分比株数/百分比CTX-M-34（12.90%）8（28.57%）12（20.34%）CTX-M-149（29.03%）8（28.57%）17（28.81%）CTX-M-277（22.58%）2（7.14%）9（15.25%）CTX-M-6503（10.71%）3（5.08%）SHV-101（3.57%）1（1.69%）SHV-201（3.57%）1（1.69%）SHV-11011（39.29%）11（18.64%）SHV-123（9.68%）2（7.14%）4（6.78%）SHV-283（9.68%）2（7.14%）5（8.47%）SHV-7710（32.26%）4（14.29%）14（23.73%）SHV-7801（3.57%）1（1.69%）SHV-811（3.23%）01（1.69%）SHV-11901（3.57%）1（1.69%）TEM-13（9.68%）13（46.43%）16(27.12%)TEM-10402(7.14%)2(3.39%)TEM-13501(3.57%)1(1.69%)从表13可以看出，59株产ESBLs菌株，共检测出4种CTX-M亚型，以CTX-M-14最多见，为28.81%；共检测出9种SHV亚型，以SHV-77最多见，为23.73%；共检测出3种TEM亚型，以TEM-1最多见，为27.12%。31株大肠埃希菌，共检测出三种CTX-M亚型，分别为CTX-M-3(12.90%)、CTX-M-14(29.03%)、CTX-M-27(22.58%)；共检测出4种SHV亚型，分别为SHV-12（9.68%）、SHV-28（9.68%）、SHV-77（32.26%）、SHV-81（3.23%）；仅检测出一种TEM亚型，为TEM-1（9.68%）。其中编号为10的大肠杆菌同时携带有SHV-77/81基因。28株肺炎克雷伯杆菌，共检测出4种CTX-M亚型，分别为CTX-M-3(28.57%)、CTX-M-14(28.57%)、CTX-M-27(7.14%)、CTX-M-65(10.71%)；共检测出8种SHV基因亚型，SHV-1(3.57%)、SHV-2(3.57%)、SHV-11(39.29%)、SHV-12(7.14%)、SHV-28(7.14%)、SHV-77(14.29%)、SHV-78(3.57%)、SHV-119（3.57%）；共检测3种TEM亚型，分别为TEM-1（46.43%）、TEM-104（7.14%）、TEM-135（3.57%）。其中编号为54的肺炎克雷伯杆菌同时携31 华中科技大学硕士学位论文带有CTX-M-3/14基因。五、59株产ESBLs大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌同源性分析1、细菌基因组重复序列PCR（Rep-PCR）指纹分析技术法对59株大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌同源性分型结果1.1大肠埃希菌Rep-PCR指纹分析分型结果注：标注碱基大小列为Marker图431株大肠埃希菌Rep-PCR指纹分析凝胶分型结果从图4可以看出，A型：1、3、6、10、13、19、20、23、27、55；B型：2；C型：4；D型：5；E型：7；F型：8、18，25；G型：9；H型：11；I型：12；J型：14；K型：15；L型：16；M型：17；N型：21；O型：22；P型：24；Q型：26；R型：56；S型：57；T型：58；共计20种类型。1.2肺炎克雷伯杆菌Rep-PCR指纹分析分型结果注：标注碱基大小列为Marker图528株肺炎克雷伯杆菌Rep-PCR指纹分析凝胶分型结果从图5可以看出，a、型：28、32、34；37、43；b型：36、42、47、50、51、59；c型：33、45、53；d型：38、39、41、44；e型：29；f型：30；g型31；h型：35；i型：40；j型：43；k型：46、l型54；m型：48；n型：49；o型:52；共计15种类型。32 华中科技大学硕士学位论文2、多位点序列分型（MLST）对59株大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌同源性分型结果2．1大肠埃希菌多位点序列分型结果图6大肠杆菌菌株间系谱进化树33 华中科技大学硕士学位论文2．2肺炎克雷伯杆菌多位点序列分型结果图7肺炎克雷伯杆菌系谱进化树34 华中科技大学硕士学位论文来自心内科的肺炎克雷伯杆菌的Phoe管家基因经过比对后发现是一种新类型，系首次报道。其序列如下：GTCGGCACCTCGTTAAGCTATGATTTCGGCGGCAGCGACTTCGCCGTCAGCGCGGCCTACACCAGCTCCGACCGTACCAACGATCAGAACCTGCTGGCCCGCGGCCAGGGTTCGAAAGCGGAAGCCTGGGCGACCGGCCTGAAATATGACGCCAACAATATCTACCTGGCGACCATGTACTCTGAAACCCGCAAGATGACCCCGATCAGCGGCGGCTTTGCCAACAAAGCGCAGAACTTTGAAGCGGTGGCGCAGTATCAGTTCGACTTCGGTCTGCGTCCGTCCCTCGGCTATGTGCTGTCGAAAGGGAAGGATATCGAAGGGGTGGGGAGTGAGGATCTGGTTAACTACATTGACGTGGGCCTGACCTACTACTTCAACAAAAACATGAACGCCTTCGTGGATTACAAAATCAACCAG图8管家基因Phoe313序列经InstitutPasteurMLST（http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/）上传数据后分配得到新的Phoe管家基因编号，为313。系国内外首次报道该管家基因新亚型。其对应的肺克MLST型为3003，为新发现的类型。六、四株耐碳青霉烯的肺炎克雷伯杆菌的相关信息6.1碳青霉烯确证实验图9改良Hodge实验（MHT）结果TMTM1：ATCC®BAA-1705阳性对照组株；2：ATCC®BAA-1706阴性对照组株；3、4、6分别代表33、45、53号阳性菌株；5：代表50号阴性菌株35 华中科技大学硕士学位论文6.2产碳青霉烯酶基因凝胶电泳图图10编号为33肺炎克雷伯杆菌产碳青霉烯酶基因部分凝胶图编号为33来源于胰腺外科的肺炎克雷伯杆菌产碳青霉烯酶基因有：KPC-1、SIM、OXA-48、OXA-51、OXA-58、IMP、VIM、NDM；编号为45来源于心外科的肺炎克雷伯杆菌产碳青霉烯酶基因有：KPC-1、SPM、SIM、OXA-48、OXA-51、GES、IMP、VIM、NDM；编号为53来源于心外科的肺炎克雷伯杆菌产碳青霉烯酶基因有：KPC-1、SPM、SIM、OXA-48、OXA-51、OXA-58、IMP、VIM、NDM相关序列已送检测序，结果未回。6.3编号为50号来源于神经外科的肺炎克雷伯杆菌药敏图此菌对亚胺培南耐药，但对美罗培南敏感图11编号为50肺炎克雷伯杆菌耐药基因凝胶图，该肺炎克雷伯杆菌携带的耐药基因有：aac（6）-Ib、qnrB、qnrD、qnrS、SIM、gyrA、Aac-6-Ib、IMP、VIM、NDM、OXA-48；其中SIM、IMP、VIM、NDM、OXA-48均为产碳青霉烯酶基因6.44株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯杆菌MLST分型MLST分型显示，33、45、53为同一株菌，属ST11型，其中33号痰标本来源于胰腺外科，45、53痰标本均来源于心外科；50痰标本来源于神经外科，属ST722型36 华中科技大学硕士学位论文七、blaCTX-M、SHV基因背景和调控序列7.1blaCTX-M、SHV基因上游序列PCR扩增情况将CTX-M基因编码序列上游引物和ISEcpup上游引物进行扩增，在所有的含CTX-M-3、CTX-M-14、CTX-M-27和CTX-M-65基因的菌株中（除去编号为1、3、4、6、8、10、13、16、18、19、20、22、24、25、26、27、36、38、39、41、42、43、46、47、50、55、56、57外）均扩增得到PCR产物片段。PCR扩增产物大小约1.5kb左右，其中菌株30、31、32的PCR产物1%凝胶电泳结果如图8所示。图12blaCTX-M、SHV上游PCR扩增产物凝胶电泳，最左边图为Marker：TIANGENDNAmarkerD20007.2blaCTX-M基因上游序列分析（1）CTX-M-14基因上游序列特点：所有blaCTX-M-14基因上游大小为1.5kb的PCR产物送北京ThermoFisherScientific公司测序，测序结果经BLAST比对发现，所有菌株扩增产物与2015年中国四川地区的blaCTX-M上游序列（KU059999）（18）和2001年中国广东地区报道的blaCTX-M上游序列（AF252622）具有99%或100%的同源性。该段序列包含插入序列ISEcp1和一段非编码序列。其中菌株编号12菌株CTX-M上游序列与KU059999序列100%相似。且与2001年报道的中国来源大肠杆菌CTX-M-14上游序列AF252622同样100%相似。除此外与该段序列相似度100%的序列还包括来自中国四川的由奇异变形杆菌携带的质粒PM14C39和PM14C21的CTX-M-14基因上游序列以及2004年报道来源于日本肠炎沙门氏菌的CTX-M-14上游ISEcp1B介导的启动子序列（GenBank号：KR337637，KR337636，37 华中科技大学硕士学位论文AB180674）。将序列KU059999和序列AF252622比对发现他们具有100%的同源性。其余菌株与KU059999比对相似度为99%，相对于序列KU059999只有少许几个核苷酸发生了突变。（2）CTX-M-3基因上游序列特点同样的，将PCR产物测序结果经BLAST比对发现，编号为7、17、32、34、35、(19)4849、51、52、54、58、59的菌株序列与2015年YasufumiMatsumura报道的来源于日本大肠杆菌KUN-9113菌株携带的CTX-M-3基因上游序列99%或100%相似（GenBank号：AB976577），CTX-M-3与ISEcp1关系见图13。其中编号为7、17、32、34、4849、51、52、54、58菌株与AB976577序列100%相似。编号为35、59的菌株与AB976577比对相似度为99%，相对序列AB976577只有1-3核苷酸发生突变。在YasufumiMatsumura报道中，携带该段序列的菌株为大肠埃希菌ST131，本实验对应的大肠埃希菌属于ST7、361。图13CTX-M-3所含启动子及示意图在本课题研究中，用ISEcp1上游引物扩增，携带CTX-M-27、CTX-M-65的菌株质粒DNA为模板未得到任何产物，说明携带CTX-M-27基因编号为1、3、16、20、24、42、46、56、57的菌株和携带CTX-M-65基因编号为33、45、53的菌株与插入序列ISEcp1关系不大。编号为1、3、20为大肠埃希菌，属于ST131，而编号为16、24、56、57分属于ST6756、ST4060、ST1193和ST69；编号为42的肺炎克雷伯杆菌属于ST2965，为新发现的类型；编号为46的肺炎克雷伯杆菌属于ST37。CTX-M-65的肺炎克雷伯杆菌编号为33、45、53同属于MLST分型中的ST11型。38 华中科技大学硕士学位论文7.3SHV基因背景和调控序列（1）SHV基因背景的一般特点以RECF-F和IS26为引物做PCR扩增，在大部分SHV耐药基因的上游均扩增出阳性产物，产物大小约1.0kb。经PCR产物测序和序列比对分析发现，该段序列包括编码序列和一段非编码序列。（2）IS26与SHV耐药基因用插入序列IS26和SHV-12基因序列作为模板设计引物，在菌株1、11、18、19、45、50、52、56、58、59扩增出大小约为1.0kb的产物，该段序列BLAST在线比对发现，1、11、18、45、52、56扩增产物之间100%相同，其中编号为1、（20）11、18、56的大肠杆菌与2017年捷克报道的来源于大肠杆菌质粒pEc1675序列（GenBank号：MG516909）的第26118位核苷酸至第26937位核苷酸序列相似度100%,其中IS26与SHV关系见图14。此外，编号11的大肠杆菌IS26插入序列（21）还与2010年报道来自日本的铜绿假单胞菌（GenBank号：GU592828）的IS26插入序列相似度100%。编号为45、52肺炎克雷伯杆菌与2014年来源于法国报道的肺炎克雷伯杆菌kps77菌株的携带的pkps77质粒序列（GenBank号：KF954150）第23588位核苷酸至第24407位核苷酸序列相似度100%。而编号为50的肺炎克雷伯杆菌相识度为99%，第842位的碱基缺失。编号为19、58、59的菌株未匹配上任何序列，有可能其它序列参与了SHV基因的调控，但也不排除出现新的序列可能，有待进一步研究。图14质粒pEc1675携带SHV基因与IS26关系示意图39 华中科技大学硕士学位论文图15编号为50的肺炎克雷伯杆菌的在PUBMED上BLAST比对部分结果图为编号为50的肺炎克雷伯杆菌与KF954150在PUBMED上在线比对结果示缺失碱基。40 华中科技大学硕士学位论文讨论一：CAP、HAP、VAP三种类型肺部感染的产ESBLs菌株检出率CAP、HAP、VAP是常见的肺部感染类型，其中医院获得性肺炎（HAP）和呼吸机相关性肺炎(VAP)是医院内常见的重症感染性疾病，具有很高的发病率和死亡率。北美(22-23)报道，HAP的发病率在0.5%-1%，特别是在ICU内，感染率更高，达到25%;我（24）国的HAP发病率在1.3%-3.4%。HAP病死率在30%-70%之间，是导致临床疾病治（25）（24）疗失败的重要原。刘又宁等对中国13家教学医院调查发现，肺炎克雷伯杆菌和大肠杆菌分别位于医院获得性肺炎(HAP)中致病菌的第四位和第七位，占9.7%和3.1%、；在亚洲地区，肺炎克雷伯杆菌占社区获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎致（26-27）病菌的第二位，分别为15.4%、23%。近年来，随着抗生素的滥用，特别是在三代头孢菌素的选择性压力作用下，耐药菌呈现逐年上升趋势，其中以产ESBLs的大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌尤为突出。据报道在亚洲地区，产ESBL肺炎克雷伯杆（28）菌占22.4%，产ESBL大肠杆菌的比率为12%。中国大陆各地区分布如下：广州地区产ESBLs菌株总体检出率55.78%、其中大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌分别为（29）69.4%、33.6%；福建地区产ESBLs菌株总体检出率43.23%，其中大肠杆菌、肺（30）炎克雷伯杆菌分别为42.9%、43.5%。黑龙江佳木斯地区，产ESBLs菌株总体检（31）出率41.48%，其中大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌分别为39.7%、43.5%；新疆地区地区产ESBLs菌株总体检出率33.59%，其中大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌分别为（32）53.1%、14.4%。广西地区产ESBLs菌株总体检出率47.45%，其中大肠杆菌、肺（33）（34）炎克雷伯杆菌分别为57.59%、31.85%；河南地区大肠杆菌检出率高达73.6%，本研究中，产ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌检出率分别为77.5%、42.42%，总体检出率为55.66%，其中VAP、HAP、CAP所占比分别为56%、22%、22%；CAP检出率明显偏高，是否提示社区存在ESBLs菌株流行，有待进一步研究。总体检出率与广州地区相当，但高于全国大部分地区，产ESBLs大肠杆菌检出率与河南地区持平，高于全国各地报道。这种检出率的差异可能与不同地区、医院，以及使用第三代头孢菌素的种类、数量，用药时间长短不同而造成对ESBLs细菌的筛选及诱导不同有41 华中科技大学硕士学位论文关。二、ESBLs菌株各科室分布情况本研究中，ESBLs检出率最高的科室分别为胸外科、重症医学科、心外科，而与国（35）外报道的以内科、急诊科为主有明显差别，这可能与本院外科系统三代头孢菌素的广泛使用密切相关。内科系统里，以综合内科、呼吸科为主，总体检出率明显偏高。三、菌株耐药情况分析ESBLs是由质粒介导的一类β-内酰胺酶，编码此类酶的基因常由含多种耐药基因的质粒携带，表现出多重耐药，而且质粒还可以在菌株间水平传播。本研究中，产ESBLs菌对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑林100%耐药，同时对氨曲南、头孢他啶、头孢吡肟耐药率高于60%。其中，产ESBLs的大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素头孢吡肟、氨曲南；喹诺酮类抗生素环丙沙星、左氧氟沙星均高度耐药，耐药率大于70%；对于阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦敏感率均大于90%；而产ESBLs的肺炎克雷伯杆菌和大肠杆菌耐药情况大致一样，主要对头孢唑林、头孢吡肟、氨苄西林、氨苄西林舒巴坦、氨曲南高度耐药，但对于喹诺酮类抗生素耐药率明显低于大肠杆菌，但两种（36）ESBLs菌株对亚胺培南、美罗培南均高度敏感。这与2012年亚太地区SMART报道的ESBLs菌株对以环丙沙星、左氧氟沙星为代表的喹诺酮类抗生素、磺胺类、大部分β-内酰胺类抗生素均表现为高度耐药，对美罗培南、亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦高度敏感；特别是亚胺培南、美罗培南敏感的情况是吻合的。产ESBL细菌β-内酰胺、喹诺酮类、磺胺类高度耐药除了细菌外膜蛋白通透性的降低外，最主要的还可能与质粒上携带有包括喹诺酮、磺胺类抗生素的多重耐药基因有关（37-38）。ESBLs对碳青霉烯抗生素高度敏感可能与西司他丁钠抑制脱氢肽酶的产生而（39）使亚胺培南免于水解，起到稳定杀菌，不诱导耐药菌株产生有关。因此，对于临床上ESBLs菌的感染，特别是严重、复杂的感染，碳青霉烯类抗生素可以作为第一选择，同时阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦在适时也可以作为替代或者联合用药方案，不建议使用喹诺酮类、β内酰胺类抗生素。42 华中科技大学硕士学位论文四、菌株基因分型1、ESBLs基因型流行特点产ESBLs基因主要见于肠杆菌科细菌，尤以大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌常见。本研究中，本院最主要的ESBLs基因型为CTX-M型，占69.49%；其次为SHV型，67.80%，大肠杆菌常见基因型为CTX-M型，占64.51%；其次为SHV，占54.84%；肺炎克雷伯杆菌常见基因型为SHV型，占82.14%；其次为CTX-M型，占75%。TEM型基因型常见于肺炎克雷伯杆菌，占57.14%。不同地区流行的ESBLs基因型不一样，TEM、SHV见于头孢他啶使用较多的地区，如欧美，而CTX-M见于头孢噻肟、头孢曲松使用为主的区域，如亚洲地区。这是因为在不同种β-内酰胺抗生素选择性压力下，细菌通过质粒获得了对相应抗生素水解效率更高的超广谱β-内酰胺酶。头孢他啶、头孢曲松在本院使用较普遍，但本院ESBLs菌对头孢他啶耐药性程度中等，这说明除了抗生素的筛选和诱导作用外，质粒介导的ESBLs基因的在细菌间水平转移应该起了主要作用，推测本院ESBLs流行情况是两者共同引起。2、基因型对表型的影响不同ESBLs基因水解的底物不尽相同，TEM型主要以头孢他啶为主，SHV则对头孢他啶和氨曲南水解能力更强，CTX-M型主要水解头孢噻肟、头孢曲松，而且对头孢吡肟也有很强的水解能力。本研究药敏分析结果示大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌对头孢他啶耐药率分别为54.8%、64.3%，而对头孢曲松耐药率高达100%，耐药基因检测显示我院大肠和肺克菌株主要携带CTX-M、SHV型，说明耐药基因检测结果与药敏结果一致。提示我院头孢他啶、头孢曲松用量大。3、多基因携带情况ESBLs基因由可接合性大质粒携带，往往含有多种耐药基因，使得ESBLs菌株耐药机制显得更多样和复杂。国外一份研究显示携带多个ESBLs耐药基因的概率达36.5%，以CTX-M+TEM最多见，占17.3%，而CTX-M、SHV、TEM三个基因同时携带的（40）概率为11.5%。而国内研究调查显示，携带两个耐药基因的ESBLs占10.8%，同（41）时携带三个耐药基因的概率为0.6%。本研究显示，携带2个或3个ESBLs耐药基因的概率为57.63%，同时携带3个耐药基因占13.56%，CTX-M、SHV为最常见的43 华中科技大学硕士学位论文携带2个耐药基因的情况，占27.12%。不同的ESBLs基因类型对应不同的底物水解普，多种酶的产生不仅增加产酶量，同时也拓宽了底物水解范围。最终使得耐药细菌的耐药性更强，治疗更加棘手。五、菌株同源性的分析一、REP-PCR、MLST在菌株流行病学分析中的比较REP-PCR，全称为细菌基因组重复序列PCR(repetitiveextragenicpalindromicPCR，Rep—PCR)是由国外学者于1991年描述的通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列来鉴定细菌同源性的一种基因组指纹分析方法。优点是快速、易于操作、重复性好。缺点是易于受标本、引物、酶的影响。MLST，全称多位点序列分型（multilocussequencetyping,MLST）是一种通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列的细菌分型方法。优点是分辨率高,结果稳定可靠便于不同实验室的比较，缺点是工作较为繁琐、费时、花费较大。两种方法目前在不同领域已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究。二、大肠杆菌菌株间的关系1、总体情况本研究结果显示，31株大肠杆菌中28株分属于18种不同ST型，3株新类型。最主要的ST型为ST131（9株），ST405(3株)，其余均属于不同类型。在日本ST405(42)(43)主要携带CTX-M-14、CTX-M-15，与韩国、加拿大的报道一致，而且也表现出对喹诺酮类抗生素的高度耐药。这也与本研究中产ESBLs大肠杆菌对喹诺酮类高度耐药是相符合的。2、9株ST131大肠杆菌流行病学分析三、ST131型大肠杆菌于2002年首次在英国被报道，区别于其它亚型大肠杆菌，ST131型大肠杆菌具有基因背景复杂多样、多种毒力因子并存、耐药性强、易于传（44）播特性，是所有大肠杆菌亚型中最易发展成泛耐药菌形成超级细菌的类型。从2002年首次报道，不到十年时间ST131型大肠杆菌迅速在全球广泛传播。Johnson（45）（46）报道ST131型大肠杆菌在美国已经成为泛耐药菌大肠杆菌主要来源；Johann报道ST131型大肠杆菌是加拿大社区获得性感染特别是菌血症的主要致病类型；44 华中科技大学硕士学位论文（47）YasufumiMatsumura等研究显示，ST131已经在全世界范围内广泛流行。本研究中，共计发现9株ST131大肠杆菌，占29.03%；分别来源于重症医学科（1株）、心内科（1株）、骨科（1株）、胸外科（1株）、神内科（1株）、神经外科（4株）。其中有6例病人来自武汉，其余3例来自武汉周边城市；9例病人中，6例病人合并呼吸衰竭。因此，从本研究得出结论，高致病性、高毒力、易传播的超级细菌ST型大肠杆菌在我院甚至在武汉周边城市有爆发流行趋势，值得广大医务人员注意。四、肺炎克雷伯杆菌菌株间关系本次研究收集的28株肺炎克雷伯杆菌分属于20种不同ST型，3种新类型，分别为ST2965、ST2966、ST3003，最主要的ST型为ST11（5株）、ST23（4株）、ST37（48）（2株）。KwanSooKo等研究显示，在韩国，产ESBLs的肺炎克雷伯杆菌中最常见的为ST11型，占57.4%，其对应的主要ESBLs基因型为SHV-12，其次是SHV-31，在CTX-M型中最常见的为CTX-M-15。既往研究显示ST23型肺炎克雷伯杆菌属于非（49）（50-51）致病菌，对大多数抗生素敏感，但是很少报道有ST23型产ESBLs，一份亚（52）洲地区的调查发现，ST23型肺炎克雷伯杆菌携带最主要的ESBLs基因型为CTX-M-15，且由质粒转移介导传播。本研究中，ST23分属于编号为38、39、40、41菌株，其中39、41菌株来源神经外科，38来源于心外科，40来源于重症医学科，这说明ST23菌株在本院各科室水平传播。新发现的三种ST型中，ST3003肺炎克雷伯杆菌的Phoe管家基因为新发现类型，编号为phoe313,属于第一次报道。四、REP-PCR与MLST对菌株同源性分析的比较1、对肺炎克雷伯杆菌的同源性分析REP-PCR分析中，根据凝胶上条带数量、大小，编号33、45、53为同一菌株，34、37为同一菌株，38、39、41为同一株菌，这与MLST的结果大致相同。两者比较，REP-PCR与MLST符合率为60%2、对大肠杆菌的同源性分析同样的，根据凝胶上条带数量、大小，编号为1、3、6、10、13、19、20、23、27、55为同一株菌，而编号为8、18为同一株菌，这与MLST的结果高度一致。两者比45 华中科技大学硕士学位论文较，REP-PCR与MLST符合率达90%本实验中，以MLST为金标准，REP-PCR对检测大肠杆菌符合率高于肺炎克雷伯杆菌，这其中可能与DNA提取后浓度、试剂、酶、PCR反应条件有关。国外有研究对flaA-RFLP、MLST、PFGE、REP-PCR四种检测方法进行比较，发现MLST、PFGE优于（53）其它两种，准确率高，受影响小，特别是两者联合使用对菌株同源性预测最准确。但是，REP-PCR操作简单，快速，成本低，在样本量大、经费不足、院内感染菌株初筛条件下可作为一种优先选择。六、同时携带ESBLs基因与碳青霉烯酶基因菌株分析1、总体情况前面已经分析过，目前对于ESBLs菌株的治疗首选碳青霉烯类抗生素，但是目前全世界范围内存在同时产ESBLs和碳青霉烯酶的菌株，这种超级细菌对绝大部分抗生（54）素耐药，耐药性强，致死率高，给临床治疗带来了巨大困难。国内一份研究显示，中部地区同时产ESBLs和碳青霉烯酶的肺炎克雷伯杆菌菌株检出率达29.4%，携带碳青霉烯酶基因包括OXA-48、OXA-181、KPC、IMP、VIM、PMQR等，本实验中，共有4株产ESBLs肺炎克雷伯杆菌表型为碳青霉烯酶耐药，经过改良Hodge实验确证后剩余三株菌为产碳青霉烯酶菌株，其中编号为50的肺炎克雷伯杆菌，药敏表现为对亚胺培南耐药，但对美罗培南敏感，其碳青霉烯酶基因为：SIM、IMP、VIM、NDM、OXA-48。剩余三株菌共有的碳青霉烯基因包括：KPC、SIM、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、NDM，MLST分型显示编号为50的肺炎克雷伯杆菌属于ST722，而另外三株均属于ST11。2、3株ST11型肺炎克雷伯杆菌杆菌流行病学分析耐药肺炎克雷伯杆菌引起重症肺部感染近年来正引起广大研究者的注意，这其中高致病性ST11型肺炎克雷伯杆菌又是其中的热点。区别于其它普通类型，高致病性ST11型肺炎克雷伯杆菌兼具有高毒力和多药耐药特性，其可同时携带含多个毒力基因和耐药基因的质粒，使得对包括头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、碳青霉烯（55）（56）类出现耐药，甚至出现对替加环素和多粘菌素耐药的全耐药菌。国内一份调查显示，在中国中东部五个省份，ST11是产KPC酶肺炎克雷伯杆菌主要类型，在韩国，46 华中科技大学硕士学位论文（57）（58）情况类似。邓子新等研究发现高致病性ST11型肺炎克雷伯杆菌HS11286基因组对该型肺炎克雷伯杆菌耐药特性具有强化作用，并阐明了包括转座子、插入序列等可移动遗传元件对多种耐药基因的水平转移有重要贡献。2018年1月份在中国（59）浙江地区发现的高致病性的ST11型肺炎克雷伯杆菌携带有含多种耐药基因的质粒，如pVirCR-HvKP4rmpA2而且极易在菌株间转移，此外，此类肺炎克雷伯杆菌菌毛、外膜脂蛋白生物膜的形成使得ST11型菌株呈现广泛耐药和高致病性的特征，这些因素导致临床致死性感染。本研究中，产碳青霉烯酶的菌株都是ST11型，而且携带有NDM耐药基因，表明本院存在高致病性产碳青霉烯酶肺炎克雷伯杆菌流行的可能性。编号为50的肺炎克雷伯杆菌，虽确证试验为阴性，但是检测出碳青霉烯酶基因，而且对亚胺培南耐药，我们猜测这是否与酶的表达种类和量有关，具体有待进一步探索。七、插入序列与ESBL关系分析1、ISEcp1与CTX-Ms关系插入序列是最简单的转座元件，国内外研究发现，ISEcp1或ISEcp1-like插入序列被发现在blaCTX-M编码区上游几十到几百个碱基范围之间，不同的CTX-M亚型，（60）ISEcp1与编码序列的间隔也不同。ISEcp1可以通过基因转座、转移下游DNA序（61）列等方式来介导菌株间的水平转移和调节blaCTX-M基因的表达。本研究发现，大部分CTX-M型基因上游存在ISEcp1插入序列，在ISEcp1与CTX-M编码区序列之（62）间还有大小不等的非编码序列，LingMa等研究发现，肺炎克雷伯杆菌ISEcp1与CTX-M之间存在的一段大小42bp的序列可以提高CTX-M表达，由此推测，ISEcp1不仅在ESBL广泛流行中扮演重要角色，且参与调控ESBL表达，是产ESBL细菌对β-内酰胺类抗生素高度耐药的重要原因之一（1）ISEcp1与CTX-M-14本实验中，大部分携带CTX-M-14的菌株上游均发现ISEcp1插入序列，两者间间隔非编码序列大小不等，表明CTX-M-14耐药基因来源多样。ST分型也证实属于不同（63）类型。在欧洲国家如德国、英国、法国等也报道了ISEcp1与CTX-M-14的关系。由此说明ISEcp1插入序列通过促使ESBLs耐药基因在菌株间水平转移以及促进下47 华中科技大学硕士学位论文游CTX-M-14基因表达等方式使得CTX-M-14基因在全球流行传播。（2）ISEcp1与CTX-M-3ISEcp1与CTX-M-3编码序列之间被大小为127bp序列所隔断。本实验中，表达（19）CTX-M-3的12株菌中有10株菌上游序列与2015年日本报的大肠杆菌KUN-9113携带的序列一致，除在上游被127bp碱基打断外，在ISEcp1第403碱基位置处被一段大小为768bp的IS1-like插入序列打断，但并未影响启动子区。ISEcp1不仅参与CTX-M-3表达，还提供CTX-M-3表达所需的启动子序列。2、IS26与SHVs关系（64-66）目前很多研究都有报道IS26与ESBLs中的SHV型基因在全世界范围内广泛传播相关。本实验发现，携带SHV-12编号为11的大肠杆菌，45的肺炎克雷伯杆菌；携带SHV-77编号为1、56的大肠杆菌，50的肺炎克雷伯杆菌；携带SHV-28编号为18的大肠杆菌以及携带SHV-11编号为52的肺炎克雷伯杆菌，在其SHV基因编码区（67）上游均发现IS26插入序列。Chih-MingChen等发现，IS26可以促进SHV耐药基（68）（69）因在菌株间转移；Turner等、Hammond等则研究发现，IS26相关SHV耐药基因由强启动子所调控，且IS26影响SHV耐药基因表达，协助细菌获得ESBL阳性表型。本实验发现大肠杆菌与肺炎克雷伯杆菌携带SHV基因上游序列具有100%同源性，说明IS26促使SHV耐药基因在菌株间传播。48 华中科技大学硕士学位论文结论1、我院肺部感染产ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌检出率高，以呼吸机相关性肺炎占主要，主要集中在外科、重症医学科。2、产ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌总体耐药率高，特别是对三、四代头孢、氨曲南、喹诺酮类抗生素耐药率高，虽存在耐碳青霉烯抗生素肺炎克雷伯杆菌，但总体对碳青霉烯类抗生素敏感。此外，对阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦敏感度高，可作为替代或者联合用药。3、CTX-M型是我院产ESBLs菌株主要类型，其中以CTX-M-14占比最高。大肠杆菌以CTX-M型为主，肺炎克雷伯杆菌以SHV基因型为主。多基因携带情况多见。4、致病力、强耐药性及传播力强的的超级细菌ST131型大肠杆菌以及高毒力、携带多种耐药质粒高致病性的ST11型肺炎克雷伯杆菌在我院肺部感染患者中流行，值得我们高度警惕。5、本实验只发现有肺炎克雷伯杆菌同时携带产碳青霉烯酶和超广谱β-内酰胺酶耐药基因其携带的碳青霉烯酶基因包括NDM基因。(6)ISEcp1和IS26分别作为CTX-M型、SHV型ESBLs基因上游序列，参与了CTX-M型、SHV型传播，且参与了促进了耐药基因的表达，是ESBL广泛流行的重要原因。49 华中科技大学硕士学位论文第二部分武汉协和医院泛耐药铜绿假单胞菌分子流行病学特征前言铜绿假单胞菌也称绿脓杆菌，是一种在自然界广泛分布的革兰氏阴性菌，铜绿假单胞菌适宜在潮湿环境中生长，其中以医院水池、空调、呼吸机氧气湿化瓶、医疗器械等为主要污染源，易造成医院内感染暴发流行。近年来，随着抗生素的滥用，（70）耐药铜绿假单胞菌检出率逐年升高，甚至出现多耐药和泛耐药铜绿假单胞菌，使得铜绿假单胞菌的感染变得越来越棘手。2005-2014年全国细菌耐药性监测网的数据显示泛耐药的铜绿假单胞菌检出率为1.7%，多数菌株为克隆传播，分离自ICU（71）（72）（73）。国外一份研究报道也证实了这一现象。但是2017湖南地区一份的调查发现，来自9家医院的泛耐药铜绿假单胞菌基因背景呈现多样性，说明泛耐药铜绿假单胞菌传播方式存在多样性，并不仅仅局限克隆性传播。泛耐药铜绿假单胞菌常因其复杂的耐药机制，如耐药基因的突变、外排泵的高表达，改变药物作用靶点、（74）产生多种类型灭活酶、药物渗透障碍以及生物被膜形成使得抗生素的选择范围（75）变得越来越窄，使得由此导致的病死率显著升高，而国内对于泛耐药的铜绿假单胞菌的研究报道较少，鉴于此种类型菌株的高致病性，高致死率，对于其的耐药机制及流行病学研究变得尤为重要。50 华中科技大学硕士学位论文材料与方法一、材料1、菌株和病例来源收集2016.1.1-2017.6.30华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科检测出非重复病例对应铜绿假单胞菌株816株，根据药敏结果，最终有7株符合标准。7株菌除对多粘菌素B敏感外，对其余抗生素均耐药。同时收集菌株标本对应病例信息，显示7例病例分别来自呼吸内科（2例）、重症医学科（2例）、肝胆外科（1例）、介入科（1例）、综合内科（1例）。二、仪器与试剂2.1血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、M—H水解酪蛋白胨(北京天坛生物技术研究所产品)。2.2PCR试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、TaqDNA聚和酶、dNTPs、DNAMaker(D2000)均为北京天根生化科技有限公司产品，引物为上海英潍捷基技术有限公司合成，琼脂糖凝胶(美国sigma公司产品)。2.3质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853，2.4生化培养箱SPX-250BIII（天津市泰斯特仪器有限公司）、CO2Incubator(美国TMSheldon公司)、phoenix100全自动微生物鉴定仪(美国Becton,Dickinson公司)、PCR扩增仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)、BioDoc-It220凝胶成像分析系统(美国UVP公司)、恒温摇床（美国Crystal公司）、高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）。三、方法1、细菌分离与鉴定将菌种接种于血琼脂平板和麦康凯琼脂平板两种培养基，置于35℃细菌培养箱孵育24小时后进行疑似病原菌的分离及在phoenix100自动微生物鉴定仪上鉴定。2、药敏试验51 华中科技大学硕士学位论文TM根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的标准，采用Phoenix100全自动微生物分析仪对上述菌株进行菌株鉴定及微量稀释法做药敏实验。药敏实验包括以下药物：阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林他唑巴坦、头孢哌酮舒巴坦、氨曲南、多粘菌素B。质控菌株：铜绿假单胞菌ATCC278533、耐药基因分型3.1仅对多粘菌素敏感铜绿假单胞菌质粒DNA的提取：通过细菌基因组DNA提取试剂盒(蛋白酶K消化法)制备收集的7株泛耐药铜绿假单胞菌的质粒DNA作为扩增模板3.2PCR扩增耐药基因引物依据PUBMED数据库提供的耐药基因序列，由上海英潍捷基生物公司合成，见表1。按照试剂盒说明进行菌株质粒DNA提取。PCR的反应体系:DNA混合酶10ul,引物1（10μM）1.5μl，引物2（10μM）1.5μl，待测模板DNA1μl,加双蒸水至25μl。反应条件:预变性94℃5min,变性94℃30S,退火30S,退伙温度55℃，延伸72℃1min,共32个循环,最后72℃延伸10min，4℃保存。产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,按10000:1比例加入GelRed染色剂,在紫外灯凝胶成像分析系统下观察并记录结果。PCR产物送北京赛默飞生物技术有限责任公司行正反测序,序列拼接后。结果在PUBMED比对查询。表14PCR扩增的引物序列、片段长度和设计引物的序列号注:F:上游引物；R:下游引物基因型引物碱基序列扩增片段长度（bp）参考文献KPCFTGTCACTGTATCGCCGTC88276RCTCAGTGCTCTACAGAAAACCSMEFCCTGAGGGGATGACTAAA88577RGTTATGCACTACGAAGGCNMC-AFCAGAGCAAATGAACGATTTC87978RTGGTACGCTAGCACGAATACaac(6,)-IbFTTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA4827952 华中科技大学硕士学位论文RCTCGAATGCCTGGCGTGTTTqnrAFATTTCTCACGCCAGGATTTG51680RGATCGGCAAAGGTTAGGTCAqnrBFGATCGTGAAAGCCAGAAAGG47680RATGAGCAACGATGCCTGGTAqnrCFGGGTTGTACATTTATTGAATCG30780RCACCTACCCATTTATTTTCAqnrDFCGAGATCAATTTACGGGGAATA56581RAACAAGCTGAAGCGCCTGqnrSFGCAAGTTCATTGAACAGGGT42880RTCTAAACCGTCGAGTTCGGCGqepAFAACTGCTTGAGCCCGTAGAT59680RGTCTACGCCATGGACCTCACblaSPMFCTAAATCGAGAGCCCTGCTTG79882RCCTTTTCCGCGACCTTGATCblaGIMFTCAATTAGCTCTTGGGCTGAC7282RCGGAACGACCATTTGAATGGblaSIMFGTACAAGGGATTCGGCATCG56982RTGGCCTGTTCCCATGTGAGgyrAFGACGGCCTGAAGCCGGTGCAC41783RGCCCACGGCGATACCGCTGGAparCFCGAGCAGGCCTATCTGAACTAT18683RGAAGGACTTGGGATCGTCCGGAOXA-23FGATCGGATTGGAGAACCAGA50184RATTTCTGACCGCATTTCCATOXA-24FGGTTAGTTGGCCCCCTTAAA24684RAGTTGAGCGAAAAGGGGATT53 华中科技大学硕士学位论文OXA-48FGTGGGATGGACAGACGCG79885RCCACACATTATCATCAAGTTCOXA-51FTAATGCTTTGATCGGCCTTG35384RTGGATTGCACTTCATCTTGGOXA-58FAAGTATTGGGGCTTGTGCTG59984RCCCCTCTGCGCTCTACATACOXA-181FCCTAGATTCTACGTCAGTAC79886RCTCTCTAGTCGGACAACACCISAbaFCACGAATGCAGAAGTTG54987RCGACGAATACTATGACACGESFATGCGCTTCATTCACGCAC86388RCTATTTGTCCGTGCTCAGGAVEBFATTTCCCGATGCAAAGCGT54288RTTATTCCGGAAGTCCCTGTPERFATGAATGTCATCACAAAATG92789RTCAATCCGGACTCACTAac-3-IaFATGGGCATCATTCGCACA48490RTCTCGGCTTGAACGAATTGTAac-6-IbFATGACTGAGCATGACCTTG52490RAAGGGTTAGGCAACACTGIMPFCATGGTTTGGTGGTTCTTGT48891RATAATTTGGCGGACTTTGGCVIMFATTGGTCTATTTGACCGCGTC78091RTGCTACTCAACGACTGAGCGNDM-1FGAGATTGCCGAGCGACTTG49792RCGAATGTCTGGCAGCACACTT54 华中科技大学硕士学位论文4、菌株同源性分析4.1对7株仅对多粘菌素敏感的铜绿假单胞菌进行细菌基因组重复序列PCR同源性分析。4.1.1提取细菌基因组DNA-使用北京天根生化科技有限公司产品柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒制备。所提取DNA置入4℃冰箱内保存。4.1.2以此DNA为模板，上海英潍捷基生物技术有限公司合成的Rep-PCR为随机引物，其序列为ERIC1R(5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3')和ERIC2(5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3')。PCR的反应体系:DNA混合酶12.5ul,ERIC1R（10μM）1μl，ERIC2（10μM）1μl，待测DNA模板2μl,加双蒸水至25μl。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性1min,42℃退火1min,65℃延伸8min,循环35次;最后65℃延伸16min;4℃保存.产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,电压选用100V，电泳时间约为25-40分钟,按10000:1比例加入GelRed染色剂,在凝胶成像分析系统下观察分析结果。紫外灯下观察并拍照，记录结果。4..2对7株仅对多粘菌素敏感的铜绿假单胞菌进行多位点序列分型（MLST）同源性分析。4.2.1提取细菌基因组DNA-使用北京天根生化科技有限公司产品柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒制备。所提取DNA置入4℃冰箱内保存。4.2.2依据PUBMED推荐的方法进行，选取七个管家基因包括“acsA，aroE，guaA，mutL，nuoD，ppsA，trpE”进行分析。引物序列如表2所示，PCR的反应体系:DNA混合酶12.5ul,引物1（10μM）1μl，引物2（10μM）1μl，待测模板DNA1μl,加双蒸水至25μl。反应条件:95℃预变性5min;95℃变性1min,50℃-60℃退火1min,72℃延伸1min,循环30次;最后72℃延伸5min;4℃保存.产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,电压选用100V，电泳时间约为25-40分钟,按10000:1比例加入GelRed染色剂，在凝胶成像分析系统下观察分析结果。紫外灯下观察并拍照，记录结果。取5μ55 华中科技大学硕士学位论文lPCR产物于1.5%凝胶电泳检测，剩余PCR产物直接送公司测序。对获得的等位基因序列信息进行处理、分析，并通过PUBMEDMLST数据库确定分型。表15铜绿假单胞菌MLST分型基因型引物碱基序列扩增片段长度（bp）acsAFACCTGGTGTACGCCTCGCTGAC390RGACATAGATGCCCTGCCCCTTGATaroEFTGGGGCTATGACTGGAAACC498RTAACCCGGTTTTGTGATTCCTACAguaAFCGGCCTCGACGTGTGGATGA373RGAACGCCTGGCTGGTCTTGTGGTAmutLFCCAGATCGCCGCCGGTGAGGTG442RCAGGGTGCCATAGAGGAAGTCnuoDFACCGCCACCCGTACTG366RTCTCGCCCATCTTGACCAppsAFGGTCGCTCGGTCAAGGTAGTGG370RGGGTTCTCTTCTTCCGGCTCGTAGtrpEFGCGGCCCAGGGTCGTGAG443RCCCGGCGCTTGTTGATGGTT56 华中科技大学硕士学位论文结果一、仅对多粘菌素敏感铜绿假单胞菌检出率为0.86%（7/816），7株菌种来源于痰标本的有3株，来源于胆汁的有2株，来源于血和尿的分别有1株。菌株对应的病例来源有：呼吸科（2株）、重症医学科（2株）、肝胆外科（1株）、介入科（1株）、综合内科（1株）。二、耐药基因使用30对耐药基因引物对7株产泛耐药铜绿假单胞菌菌株DNA进行PCR扩增，扩增产物片段大小与预期相符。其中一株来源于呼吸内科的菌株耐药基因凝胶图如图所示图15M表示Marker，数字编号表示相对应的耐药基因名称4：aac(6)-IB8：QNRD14：GYRA19：OXA-5825：AAC-6-IB26：IMP27：VIM28：NDM29：OXA-48三、菌株同源性分析3.1细菌基因组重复序列PCR（Rep-PCR）指纹分析技术法对7株铜绿假单胞菌同源性分型结果图16M：Marker,R1-2:呼吸科；H：肝胆外科；IVR：介入科；ICU1-2：重症医学科；G：综合内科57 华中科技大学硕士学位论文3.2多位点序列分型（MLST）法对7株铜绿假单胞菌同源性分型结果图17铜绿假单胞菌系谱进化树58 华中科技大学硕士学位论文讨论一、7株仅对多粘菌素敏感的铜绿假单胞菌的流行病学分析（93）本实验显示，我院泛耐药铜绿假单胞菌检出率明显低于张稀博等报道的全国平均水平，7株菌种以呼吸科（2株）、重症医学科（2株）为主，痰标本来源最多，共计3株，呼吸科（1株）、重症医学科（2株），痰标本来源病人均有明显肺部感染。其次为来源于胆汁，共计2株，肝胆外科（1株）、介入科（1株）。整个菌株检出以呼吸科、重症医学科最多，我们推测这与抗生素的过度使用以及重症医学科的环境有关，肺部感染、重症医学科住院时间长短是产生泛耐药铜绿假单胞菌（94）（95）的独立危险因素。德国一项基于1764份胆汁培养阳性大样本调查显示，假单胞菌属细菌占所有菌的第四位，其中以铜绿假单胞菌常见。而其中一家教学医院检测出泛耐药铜绿假单胞菌感染的病例高达4.8%，明显高于国内水平。胆管支架植入术可使胆系感染泛耐药菌株形成概率增加3-4倍，究其原因，可能与支架的频繁更换引起相关性感染，三代头孢菌素不合理使用有关。本研究中，2例胆汁培养出泛耐药铜绿假单胞菌病人均有胆管损伤及感染，都有过多种抗生素使用、侵入性操作检查高危因素，推测这可能是产生泛耐药菌的因素之一。有趣的是，两例病例均有或正在行支架植入术，这可能也是其产生泛耐药铜绿假单胞菌的独立危险因素。支架植入术由于其阻隔作用影响抗生素充分曝露于组织，进一步引起耐药菌产生，是临床治疗中需要引起关注的一个问题。也正是如此，它可作为入院前一项评估泛（96）耐药菌产生可能性大小的指标。从而给临床医生用药提供方向。二、耐药基因分析7株菌经过PCR扩增后，凝胶图显示均发现有多种耐药基因的情况，包括β-内酰胺基因（OXA、PER、GES、IMP、VIM、NDM、SPM、和KPC）、喹诺酮类耐药基因（qnrA、qnrB、qnrD、qnrS、gyrA、parC）、氨基糖苷类耐药基因（Aac-6-Ib）。其中部分测序结果反馈示，6株菌均含有qnrB2、gyrA、aacA4、Aac-6-Ib。来自肝胆外科的菌株耐药基因检测显示KPC-2、parC；剩余1株来自呼吸科的铜绿假单胞菌携带有aacA4、Aac-6-Ib、IMP-9，其余正在重复测序中。7株菌中大部分携带有喹诺59 华中科技大学硕士学位论文酮类基因，既包括染色体介导的喹诺酮耐药决定区（QRDRS）的DNA回旋酶、拓扑（97）异构酶IV,，如gyrA、parC，还包括质粒介导的喹诺酮类药物决定簇（PMQR）如qnrB-2;以及以变异体形式存在的氨基糖苷乙酰转移酶基因aac（6’）-Ib-cr，（98）通过修饰喹诺酮类抗生素而增强染色体突变的选择。氨基糖苷酶则只有aacA4这一种类型。携带金属酶KPC-2、IMP-9情况只发现于分别来自肝胆外科、呼吸科的两株菌。aac（6’）-Ib-cr、qnrB-2介导的喹诺酮类基因背景如图18所示。图18aac（6’）-Ib-cr、qnrB-2介导喹诺酮耐药基因背景示意图及相对应的质粒在PUBMED上序列号A(pcJF729198)、B(pcJF775515)、C（SalmonellaAM234698）60 华中科技大学硕士学位论文三、菌株间MLST分析本实验中，7株菌有6种ST型，分别是ST274（2株，呼吸科、肝胆外科）ST767（1株，介入科）、ST1403（1株，重症医学科）、ST1701（1株，重症医学科）、ST2546（1株，呼吸内科）、ST3001（1株，综合内科）。其中ST2546、ST3001为新发现的类型。欧美研究显示，ST274型常发现于慢性肺部感染特别是囊性肺纤维（99-101）化的患者中，此种类型的铜绿假单胞菌易于在医院内水平传播，而且极易产生突变系，使得耐药特性发生改变，让铜绿假单胞菌感染的囊性肺纤维化治疗变得（102）（103）更加复杂和棘手。Clark等对1例诊断为囊性肺纤维化，ST274型铜绿假单胞菌感染的患者为期近一年的痰标本研究发现，该型铜绿假单胞菌在同一个病人不同时间段或者同时段内每个子代间的生物形态及营养代谢呈现出多样性，这种特性具有不确定性，随着时间而改变，每个子代发生适应性耐药的几率也大不相同，形成异质性耐药。国内多中心大样本研究调查显示，在我国，ST274型多耐药铜绿假单胞菌覆盖范围最广，在22个大陆地区（省、直辖市）中有16个地区检出ST274型铜绿假单胞菌，药敏检测除多粘菌素高度敏感外，对其余11种抗生素敏感性均（104）小于73%。无论是在国内还是在国外，也无论是基于基因水平还是基因水平之外的表观因素，ST274型铜绿假单胞菌以其耐药性强，易于流行传播的特性已经对全球人民的生命健康构成威胁。本实验中，虽然未发现患者有囊性肺纤维化的病史，但是该菌已经在我院院内发生水平传播，值得临床医生的警惕。61 华中科技大学硕士学位论文结论1、我院仅对多粘菌素敏感的铜绿假单胞菌检出率低于全国水平。从科室分布来看，内科系统检出率高于外科系统，其中以呼吸科、重症医学科为主。从标本类型来看，痰、胆汁明显多于血、尿标本。仅对多粘菌素敏感的铜绿假单胞菌引起肺部感染、胆系特别是对有胆管支架植入术感染在我院仍不容乐观。2、从已有的数据来看，仅对多粘菌素敏感的铜绿假单胞菌均有多基因携带情况，其中喹诺酮类耐药基因兼具染色体和质粒介导的多种类型，机制颇为复杂。3、ST274型铜绿假单胞菌在我院已经存在水平传播，该型铜绿假单胞菌易于形成突变系，再加上泛耐药的特性，给我们控制该菌株引起的感染带来了极大的挑战。62 华中科技大学硕士学位论文第三部分产ESBLs细菌异质性耐药机制初步研究前言细菌的耐药存在多种机制，以往对细菌耐药认识都是基于基因水平，从细菌群体角度研究细菌的耐药特性，而忽略了个体间差异。研究表明，基因背景相同的单克隆细菌基因表达存在明显的细胞间差异，而这种差异是细菌为在各种不利外界压力下（105）（106）如抗生素压力下提高生存能力的必然选择，研究证实，单细胞水平核酸序列完全相同的携带ESBL基因（CTX-M-14）单克隆来源细菌表达存在明显的细胞间差异。菌株繁殖时不均等分裂导致子代菌体遗传物质以及基因水平外的表观因素不近相同可能是单克隆来源的细菌子代间存在异质性耐药现象的因素之一。前期我们了解到，产ESBL单克隆来源的大肠杆菌其子代间存在ESBL差异性表达，而这种表达的差异与细菌的生长速率有显著性关系，更为有趣的是高表达组的细胞也是不稳定的，随着时间推移，细胞本身会发生变化，这很可能就是细胞不均等分裂产生新旧两种类型结果。本研究拟进一步探索单克隆来源产ESBL大肠杆菌高低表达亚群耐药异质性耐药机制异。63 华中科技大学硕士学位论文材料与方法一、实验菌株1.1前期我们通过载体质粒pUA66已经构建好ESBL(CTX-M-14)/绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白表达载体，此表达载体具有很高的灵敏度，可以准确反映启动子的活性和状态。1.2大肠杆菌DH5α由于其表现对外源DNA的免疫缺乏可作为理想的表达载体宿主细菌。二、仪器与试剂2.1血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、M—H水解酪蛋白胨(北京天坛生物技术研究所产品)。2.2头孢曲松钠（罗氏公司，瑞士）2.3生化培养箱SPX-250BIII（天津市泰斯特仪器有限公司）、恒温摇床（美国Crystal公司）、荧光显微镜型号（ZEISSHAL100，欧蒙公司，德国）、流式细胞检测与分选仪（Becton-DickinsonFACSCalibur，美国）三、方法3.1挑取含荧光蛋白菌落于10ml含头孢曲松钠250µg/ml的LB培养液中37℃，200rpm，恒温振荡培养16-18小时，第二天取稀释细菌悬液10μl于载玻片中，经亚甲基蓝染色处理后，立即于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况3.2挑取含荧光蛋白菌落于10ml含头孢曲松钠250µg/ml的LB培养液中37℃，200rpm，恒温振荡培养16-18小时，10000rpm常温离心10min，弃上清，用直径0.22µm过滤器过滤后的无菌LB重悬细菌。流式细胞分选仪分选出高低荧光蛋白表达亚群。3.3用E-test纸片法检测分选出来的高低亚群细菌对头孢曲松的耐药性。64 华中科技大学硕士学位论文结果一、荧光显微镜下菌群间荧光蛋白表达情况荧光显微镜下可以看见，细菌间荧光强度存在明显差异，荧光强度高的细菌其对应的体积明显偏大。结果如下图图19携带荧光蛋白大肠杆菌荧光显微镜图，可看间细菌间存在荧光强度和体积的明显差异65 华中科技大学硕士学位论文二、流式分选及检测高低荧光蛋白表达亚群图20实验菌荧光蛋白表达情况：横坐标FI，荧光强度；纵坐标：细胞个数P1：低表达亚群；P2：高表达亚群图21高低表达亚群流式检测指标值，H：高表达亚群；L：低表达亚群；FSC-A：前向散射光；SSC-A：侧向散射光；GFP-A：荧光蛋白强度图22高低表达亚群对头孢曲松的最低抑菌浓度（MIC），L：低表达亚群；H：高表达亚群66 华中科技大学硕士学位论文讨论细菌的异质性耐药通常是来源于临床的单一分离株单克隆菌子代表现出对抗菌药物耐药水平不同的现象称为细菌的异质性耐药，这群单克隆子代中既有敏感亚群，低耐药亚群，还有少部分高水平耐药亚群，这一细菌样本或分离株中的耐药性（107-108）不同的亚群可以被称为某种抗菌药物的异质耐药菌。目前临床上根据体外药敏实验经足量、足疗程抗生素治疗相关菌株感染后发现并无显著疗效，有时甚至是治疗失败，这与细菌异质性耐药密切相关。异质性耐药是细菌抵抗抗生素压力，发展为全耐药细菌的重要中间过程。大量研究显示，结核分枝杆菌的异质性耐药是产（109-112）生多耐药甚至广泛耐药结核的主要原因。除了结核分枝杆菌对抗结核药物产（113）生异质性耐药外，大肠杆菌对四代头孢菌素、铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生（114）（115）素、鲍曼不动杆菌对多粘菌素类、碳青霉烯类抗生素、金黄色葡萄球菌对（116）糖肽类抗生素均存在异质性耐药现象。可见异质性耐药在自然界中普遍存在。本研究中，以CTX-M-14型产ESBLs大肠埃希菌为实验菌，发现基因背景相同的大肠杆菌子代间存在明显的耐药性差异，这种差异主要表现在基因水平外的表观因素上，其中以与细菌生长速率关系颇密切，生长快的细菌耐药性表现更强，我们推测这其中可能与某种物质的调控有关，有待进一步研究。67 华中科技大学硕士学位论文结论1、单克隆来源的大肠埃希菌菌株间存在耐药水平的显著差异。2、这种耐药水平的差异可能于某种物质调控细菌生长速率有关。68 华中科技大学硕士学位论文参考文献[1]HawkeyPM.Thegrowingburdenofantimicrobialresistance[J].JAntimicrobChemother.2008,62Suppl1:i1-i9.[2]MoltonJS,TambyahPA,AngBS,etal.Theglobalspreadofhealthcare-associatedmultidrug-resistantbacteria:aperspectivefromAsia[J].ClinInfectDis.2013,56(9):1310-1318.[3]KimYK,PaiH,LeeHJ,etal.Bloodstreaminfectionsbyextended-spectrumbeta-lactamase-producingEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniaeinchildren:epidemiologyandclinicaloutcome[J].AntimicrobAgentsChemother.2002,46(5):1481-1491.[4]汪复.2005中国CHINET细菌耐药性监测结果[J].中国感染与化疗杂志.2006,6(5):289-295.[5]汪复.2006年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志.2008,8(1):1-9.[6]汪复，朱德妹，胡付品，等.2007年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志.2008,8(5):325-333.[7]汪复，朱德妹，胡付品，等.2008年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志.2009,9(5):321-329.[8]汪复，朱德妹，胡付品，等.2009年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志.2010,10(5):325-334.[9]朱德妹，汪复，胡付品，等.2010年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志.2011,11(5):321-329.[10]卢文波，何立忠，汪一萍.肠杆菌科细菌ESBLs和AmpC酶检测及耐药性分析[J].中国卫生检验杂志.2010(2):361-362.[11]杨启文，王辉，徐英春，等.2009年中国13家教学医院院内感染病原菌的抗生素耐药性监测[J].中华检验医学杂志，2011，34：422-430[12]杨春霞，陈山，杨勇，等.北京地区社区获得性单纯性泌尿系感染病原菌对常用抗菌药物的体外活性分析[J].中华泌尿外科杂志，2012，33：132-137[13]吴多荣，陈垂婉.845例尿路感染患者菌群分布及耐药性分析[J].国际检验医学杂志，2012,33：1974-1975,1977[14]AndradeLN,MinariniLA,Pitondo-SilvaA,etal.Determinantsofbeta-lactamresistanceinmeningitis-causingEnterobacteriaceaeinBrazil[J].CanJMicrobiol.2010,56(5):399-407.[15]WirthT,FalushD,LanR,etal.SexandvirulenceinEscherichiacoli:anevolutionaryperspective[J].MolMicrobiol.2006,60(5):1136-1151.[16]DiancourtL,PassetV,VerhoefJ,etal.MultilocussequencetypingofKlebsiellapneumoniaenosocomialisolates[J].JClinMicrobiol.2005,43(8):4178-4182.[17].Diestra,K.,etal.,CharacterizationofplasmidsencodingblaESBLandsurroundinggenesinSpanishclinicalisolatesofEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniae.JAntimicrobChemother,2009.63(1):p.60-6.69 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华中科技大学硕士学位论文超广谱β-内酰胺酶流行现状及耐药机制研究进展文献综述上世纪80年代，超广谱β-内酰胺酶首次被发现，随着抗生素的滥用，ESBLs便在世界范围内广泛流行，给人类的生命安全带来了极大地挑战，同时也造成了巨大的经济负担。超广谱β内酰胺酶是一类由质粒介导，通过质粒复制、转座子转座插入、接合、转化、转导等方式在细菌之间传播流行的一类β-内酰胺酶，分为2be、2ber、2de、2e四类，可以水解灭活青霉素类抗生素、头孢菌素（一、二、三代头孢，主要为第三代头孢菌素，如头孢他啶、头孢噻肟等）和单环β-内酰胺类抗生素；其活性能够被β内酰胺酶抑制剂所抑制，是细菌对β内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一。产生ESBLs的细菌种类很多，常见于临床分离的革兰阴性肠杆菌科细菌，其中以大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌为代表，其他包括产气肠杆菌、阴沟肠杆（1）菌、产酸克雷伯菌等。目前ESBLs基因型已经达300多种，主要是CTX-M型、TEM型、SHV型、OXA型以及其他（http://www.1ahey.org/studies/web.htm）。大多数ESBLs是由TEM-1、（2）SHV-1、TEM-2酶活性中性的一个或多个氨基酸突变衍生而来。不同国家和地区ESBLs菌检出率、耐药性和基因型也不同，即使在同一个国家的不同地区，由于使用抗生素的差异，流行的基因型也不同，呈现显著的地区特点。在亚洲，日本肠杆科菌ESBLs检出率最低，为6.2%，CTX-M为其主要ESBLs基因型，其中又以CTX-M-14，（3-4）CTX-M-27为主；在韩国检出率为18.3%，常见基因型为CTX-M、SHV；其中以（5）CTX-M-15、SHV-12最多见；在东南亚，泰国检出率为41.4%；常见基因类型为（6-7）CTX-M、TEM，其中以CTX-M-14/3,TEM-1为主要类型；在新加坡，ESBLs检出率(8-9)15.7%，其常见类型为CTX-M-15；中国大陆地区，ESBL的检出率较高并成逐年增长的趋势。根据北京大学刘湘军等对中国大陆地区近10年的流行病学调查示，2005年至2014年间大肠埃希菌ESBL检出率从38.9%逐渐上升至58.4%；产ESBLs克雷伯菌属检出率从2005年的39.1%上升至2014年的43.0%；在大陆地区，最多见的（10）ESBLs类型仍然是CTX-M，以CTX-M-14最多见。而在中国香港、台湾检出率分78 华中科技大学硕士学位论文别为29.5%、23.4%，香港和台湾地区常见基因型为CTX-M，其中CTX-M-14为主要（11-13）类型；整个亚太地区，ESBLs检出率为11.2%，常见基因型为CTX-M、SHV，其（14）中以CTX-M-15、CTX-M-14、SHV-12为主要类型。中东地区，伊朗ESBLs检出率（15）为23.6%，常见基因型为CTX-M-15.在非洲地区，埃及、南非检出率分别为11%-42.9%、8.8-15.6%,埃及地区最常见的还是CTX-M类型，以CTX-M-15居多，南（16）非以TEM型居多.直到1990s末期，欧洲地区流行的ESBLS基因型以TEM、SHV为主，产ESBLs的肺炎克雷伯杆菌多于大肠埃希菌，但随着抗生素全球滥用及耐药（17-18）基因快速的传播，情况发生了显著变化。21世纪初，整个欧洲地区的ESBLs达到了8.6%，其中土耳其（28.9%）以色列（19.4%）、希腊（19.3%）、意大利（15.6%）、（19）葡萄牙（12.6%），意大利（15.6%），德国和英国分别为3.2%、4.8%。基因型在欧洲流行情况随各个国家不同而不同。但是不同于上世纪，CTX-M型已经成为主要类型；西班牙主要是CTX-M-9组，英国主要是CTX-M-9/1组，法国主要是CTX-M-2（18）组；欧洲地区CTX-M-15为最常见类型。在美国，肠杆菌科细菌ESBL的检出率（20-21）为0～25%，最常见的还是CTX-M-15。在拉丁美洲地区，肠杆菌科细菌ESBL的（22）检出率为41.2%,常见基因型为CTX-M-15、CTX-M-2、SHV-12。全世界7大洲，由于地理位置，抗生素使用情况各异，肠杆菌科细菌ESBLs检出率各不相同，ESBLs基因虽可通过各种渠道在世界范围内流行，但各地区ESBLs类型仍具有显著性差异，总体来讲最常见的仍然是CTX-M基因，以CTX-M-1组中的15最多见，其次是SHV组，以SHV-12为主要基因型。各大洲之间又有区别；除北美洲外，其他各大洲CTX-M-1组为肠杆菌科ESBLs最主要基因型。亚洲（27.8%）、欧洲（17%）、拉丁美洲（14.7%），在北美洲，SHV基因型为其ESBLs主要类型,（23）占3%。从上述可以看出，整个欧洲地区ESBLs检出率除了高于日本外，明显低于拉丁美洲、非洲、亚洲大部分地区，拉丁美洲ESBLs检出率最高，其次是非洲和亚洲地区，除了人种易感性不同外，这其中可以看出，越是贫穷的地区检出率越高，这其中可能与贫穷地区经济、卫生条件差，医疗资源缺乏、抗生素滥用及缺乏规范用（24）药管理有关。79 华中科技大学硕士学位论文细菌耐药是全球性的问题，给人类的健康产生严重的威胁，而ESBLs细菌因其表现对抗菌药物的多重耐药性，耐药性强，又极易通过质粒在同种和不同菌株间传播造成暴发流行，导致院内交叉感染和耐药菌扩散，现已成为继耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)后的医院感染主要致病菌，给临床防治带来了巨大困难。因此对于ESBLs耐药机制的研究变得刻不容缓。肠杆菌科细菌对于β-内酰胺耐药存在多种机制，这其中最主要的是产生β-内酰胺酶，包括超广谱β内酰胺酶(ESBLs)、头孢菌素酶(AmpC)、金属酶等。ESBLs是由质粒介导的一类β-内酰胺酶，编码此类酶的基因常由含多种耐药基因的（25-26）可接合性大质粒携带，可以在菌株间水平传播。本文前部分已述，ESBLs大多（2）源于是由TEM-1、SHV-1、TEM-2突变，近年来又陆续发现CTX-M、OXA等多种类型ESBL，这些新型超广谱β内酰胺酶的产生归咎于结构基因的单点或多点突变。其次，以启动子和调节子为代表的结构基因区域外的突变使得结构基因表达出现异常，产酶量大幅增加从而导致耐药。这种结构基因上的突变，不仅催化了酶的活化腔的空间，使得三代头孢菌素的侧链取代基能够顺利进入，而且还提高了酶对三代（27-28）头孢菌素的亲和力，使得头孢菌素更容易被水解。整合子与ESBLs基因关系已经引起了国内外专家的关注，研究证明，整合子，（29）特别是I类整合子在介导耐药基因水平传播中扮演重要角色。整合子具有同时整合和表达多种耐药基因的特性，在抗生素选择压力下，整合子可通过捕获、整合不同的耐药基因，同时通过转化、转导、接合在异种或同种菌属间传递耐药基因。更有趣的是，有些ESBLs编码基因甚至就位于整合子内部。整合子通过捕获串联排列的多个基因盒，然后借助于启动子使得多种耐药基因同时高表达，最终让携带有（30-32）整合子的ESBLs菌株更容易扩散，导致多重耐药菌的迅速发展。在所有的β-内酰胺酶中，ESBLs与AmpC两者引起临床的广泛关注。AmpC酶分为质粒介导和染色体介导两类，它与ESBLs最主要的表型区别是耐药谱的扩大且不被克拉维酸抑制，且对各种β-内酰胺类抗菌药物及β-内酰胺酶抑制剂耐药，只对碳青霉烯类和四代头孢敏感。常见于肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、假单胞菌属等。质粒介导的AmpC酶多见于无或只有不健全AmpC染色体的细菌种属中如克雷伯菌80 华中科技大学硕士学位论文属，而且广谱抗菌素还能将突变株筛选出来，因此AmpC酶在克雷伯菌属耐药机制（33）中的地位显得越来越重要。鉴于两者都可以借助质粒传播，一旦超超光谱β内酰胺酶（SSBL）产生，即ESBLs基因与AmpC基因同时出现在质粒上，就使得阻止耐药基因的传播以及临床治疗变得更加困难。ESBLs是全球性的问题，影响产ESBLs菌的危险因素有侵袭性操作、住院时（16）间、β内酰胺抗生素的使用等，目前国内外普遍认为β内酰胺类抗生素尤其是三代头孢菌素的广泛使用所产生的选择性压力是导致ESBLs革兰阴性杆菌增加的主要因素。因此了解各地区ESBLs流行的情况，规范使用抗生素变得尤为重要。81 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华中科技大学硕士学位论文致谢感谢导师张劲农教授的知遇之恩；感谢王小溶师姐这三年来孜孜不倦的教诲，无论是试验还是工作、亦或是做人方面，师姐给与了莫大的帮助，亦师亦友的关系让我收获颇多，感谢杜帅先老师、刘诗涵师妹协助实验；感谢急诊科韩继媛主任、樊红主任、程向东老师在临床工作中的指导；感谢向莉护士长、冯霞护士长、邓先锋护士长、李华老师在工作中给予的关心；感谢刘本德教授、孙鹏教授、笪邦红老师，吴红军老师、温宇英老师及急诊科的各位老师，给予我的帮助和引导。感谢贺新良师兄，李诗师姐，陈丹丹师姐，周长治师兄，汪娜娜师姐，朱小玲师姐、袁珊师妹、董清华师弟对我的支持与鼓励。感谢武汉协和医院提供给我学习平台。85