日本鳗鲡脾脏抗菌肽抗菌活性检测方法的比较

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1、动物营养学报2014，26(11):3461-3468ChineseJournalofAnimalNutritiondoi:10．3969/j．issn．1006-267x．2014．11．036日本鳗鲡脾脏抗菌肽抗菌活性检测方法的比较1，21，21，2梁英黄文树关瑞章(1．集美大学水产学院，厦门361021;2．集美大学鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，厦门361021)摘要:本试验旨在建立一种在日本鳗鲡脾脏抗菌肽分离纯化过程中简便、灵敏的检测其抗菌活性的方法。试验以日本鳗鲡脾脏分子质量小于10ku的蛋白质为抗菌肽样品，选择琼脂板孔穴扩散法和微孔液

2、体培养法2种传统方法及微量液体培养法为检测方法，比较这3种方法在抗菌肽对3种鳗鲡常见致病菌株(迟钝爱德华菌、气单胞菌、嗜水气单胞菌)抗菌活性检测中的灵敏度和优缺点。结果表明:与琼脂板孔穴扩散法及微孔液体培养法相比，微量液体培养法简便、易于观察结果，具有最高的灵敏度且样品用量最少，适合在鳗鲡脾脏抗菌肽分离纯化过程中跟踪检测抗菌活性，尤其适合分离纯化后期获得微量单一样品抗菌活性的检测。由此得出，微量液体培养法适用于检测日本鳗鲡脾脏抗菌肽的抗菌活性。关键词:日本鳗鲡;脾脏;抗菌肽;抗菌活性中图分类号:Q516文献标识码:A文章编号:1006-267X(201

3、4)11-3461-08抗菌肽是普遍存在于生物体内一类广谱抗微踪目的的同时还可以初步验证单一抗菌活性组［9］生物的小分子多肽的总称，通常其分子质量小于分。这些方法都有各自的优缺点，目前尚无统10ku。抗茵肽不仅具有广谱抗细菌的能力，对真一的标准方法用于抗菌活性的检测，基于分离材菌、病毒以及寄生虫等均有杀伤作用，是先天性免料、方法和阶段的不同，关键是要选择一种简单易［1－3］［10］疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽的作用行、灵敏度高的方法。马瑜等比较了两栖类皮［11］及应用效果是有目共睹的。然而，大多数内源性肤抗菌肽抗菌活性检测技术。邬晓勇等建立了抗菌肽

4、在动物体内的含量极其微少，难以获得大一种在蛙皮抗菌肽分离纯化过程中简单、快速、灵［4］［12］量的样品。特别是在分离纯化的后期，获得的敏的检测抗菌活性的方法。齐珂珂等建立了鸡一些珍贵的单一蛋白质样品，其质量仅为微克级，白细胞中抗菌肽的分离纯化及活性鉴定方法。李［13］能用于检测抗菌活性的蛋白质的量则更少。因秀兰等研究了家蚕抗菌肽琼脂糖孔穴扩散法与此，建立微量而敏感的抑菌试验方法在内源性抗比浊法测定抗菌活性的差异及其相关性。在鱼类菌肽的开发研究中极为重要。抗菌肽的分离过程中多采用抑菌圈法和微孔液体［14］关于抗菌肽抗菌活性测定的方法有很多，其稀释法检测抗

5、菌活性。Zhang等采用抑菌圈法中扩散法是最常规的方法，目前国内外学者多采跟踪分析大黄鱼肾脏抗菌肽分离纯化过程中纯化［5－6］［1］用此方法进行抗菌肽活性的检测。96孔细胞蛋白质抗菌活性的检测。Lauth等采用微孔液培养板稀释法在检测抗菌肽最低抑菌浓度的同体稀释法检测抗菌肽moronecidin的抗菌活性。［15］时，可得到不同浓度抗菌肽对指示菌生长抑制作Fernandes等采用双层琼脂扩散法检测组蛋白［7－8］用的变化曲线。生物自显影法在达到活性跟H2A的抗菌活性。但目前专门针对鱼类抗菌肽活收稿日期:2014－05－13基金项目:福建省中青年教师教育

6、科研项目(科技B类)(FB2013003);集美大学李尚大学科建设基金(ZC2013004);鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心开放基金(ZK2013002);集美大学科研基金(ZQ2012010)作者简介:梁英(1979—)，女，福建莆田人，讲师，博士，主要从事水产动物病害防治及抗菌肽资源开发研究。E-mail:liangyingnanping@jmu．edu．cn3462动物营养学报26卷［16］［17］性检测技术比较研究的报道较少。Birkemo等储备液，蛋白质浓度测定参照Bradford的方法。采用琼脂板孔穴扩散法和微孔液体培养法2种方3种检测

7、方法均设置了60、30、20、10、7、4和2μL法检测了hipposin和pleurocidin的抗菌活性，发现7个加样体积，对应的蛋白质质量分别为Q1微孔液体培养法比琼脂板孔穴扩散法更灵敏。因(72．0μg)、Q2(36．0μg)、Q3(24．0μg)、Q4此，即使对同一种检测对象而言，检测方法不同表(12．0μg)、Q5(8．4μg)、Q6(4．8μg)和Q7现出来的抗菌活性也不尽相同。本研究以日本鳗(2．4μg)。3种方法中，上述选取的3株菌均设置54鲡脾脏小于10ku的蛋白质为抗菌肽样品，探讨了10和10CFU/mL2个细菌浓度。琼脂板孔穴扩

8、散法、微孔液体培养法及微量液体1．4．1琼脂板孔穴扩散法检测抗菌活性8培养法这3种方法用于检测