原核表达及纯化方法

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1、原核表达及纯化-Histag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mLLB培养基中（注意抗生素抗性）。37℃，过夜摇菌。2.次日，将菌液接种到1LLB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。大量表达：收集1L诱导后全菌，4

2、℃，4500g离心15~30min。二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。根据这个结果选择纯化方法。（1）各用30μL4×SDSLoadingbuffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL1×BindingBuffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL4×SDSLoadingbuffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL4×SDSLoadingbuffer；（4）

3、将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。（5）各取10μL用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。三、小量富集实验样品制备：7取5mL诱导全菌，用500μL1×BindingBuffer（8MUrea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。2.平衡：向离心管中加200μL1×BindingBuffer（8MUrea

4、），混匀1min，700g离心1min，去上清；重复一次。3.上样：将制备的上清蛋白加到离心管中，混匀30min（混匀仪上）。700g离心1min，上清即为穿透（留样做SDS-PAGE）。4.淋洗：加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，5mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，10mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，20mM咪唑），

5、混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；5.洗脱：加50μL1×ElutionBuffer（8MUrea，50mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，3000mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；6.取少量柱料做SDS-PAGE；注：用定量工作液估计蛋白的浓度：2μL待测蛋白溶液+180μL定量工作液，根据颜色的变化可以估计蛋白的浓度。对富集过程进行监控。一、大量富集实验样品制备：用5

6、0mL1×BindingBuffer（8MUrea）溶解菌体，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）或者用高压破碎仪（推荐）。4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：将1mLNi柱料装入层析柱，7用至少三个柱体积的超纯水以工作流速（每滴/3S）压实柱料，以获得均一的柱床，同时避免带入气泡。注：以下的层析操作流速不要超过装柱流速的1.75倍。1.柱平衡：三个柱体积的1×BindingBuffer（8MUrea）平衡柱料。注：柱子挂上镍离子后，可在Bing

7、ing溶液中过夜，4℃。2.上样：视样品的多少可选用LOOP或由泵直接上样两种方式，接穿透峰以备SDS-PAGE检测。3.淋洗：去除非特异结合的蛋白质，接穿透峰以备SDS-PAGE检测。10个柱体积的1×BindingBuffer（8MUrea）；6个柱体积的WASHBuffer（分别是含有10mM咪唑，20mM咪唑的1×BindingBuffer（8MUrea））；注：也可以根据定量工作液错落估计蛋白的浓度，以确定每步的淋洗是否完全。4.洗脱：6个柱体积的1×BindingBuffer（8MUrea，50mM咪唑）；6个柱体积的

8、1×BindingBuffer（8MUrea，100mM咪唑）；6个柱体积的1×BindingBuffer（8MUrea，300mM咪唑）；留样做SDS-PAGE；注：也可以不使用含100mM咪唑的洗脱液；至于每步用多少体积的洗脱液，可根据粗略定量