农杆菌感受态的制备和转化

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1、农杆菌感受态的制备和转化版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1.取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。1.1.2.挑取单菌落接种于5mlYM液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12-16hr。1.1.3.取2ml菌液转接于100mlYM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。1.1.4.转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。1.1.5.加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。1.1.6.加入

2、4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。1.1.7.农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。1.2.双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200mlEHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/mlKanamycin的YM平板上。28℃培养到形成单菌落。其中YM可以用LB代替，第一次的CaCl2溶液可用溶液（

3、0.1MCaCl20.01Tris-HCl（7.0）0.01DTT）替代。版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1.挑单菌落于2mlYEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。2.取2ml过夜菌液接种于50mlYEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。3.5krpm离心5分钟。4.在10ml0.15MNaCl中悬浮细胞。5.5krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。6.加1ugDNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。7.液氮中冷冻1分

4、钟。8.37℃水浴溶化细胞。9.加1mlYEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。10.离心1分钟，悬浮细胞在100ulYEP培养基中。11.涂板，28℃培养2-3天。版本三农杆菌感受态细胞的制备1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5mlLB液体培养基(含50mg/LSTR)中，28℃、200r/mim培养过夜。2.取2ml培养物于LB液体培养基(含50mg/LSTR)中继续培养，直至OD800为0.5左右。3.将培养物置冰浴中30min，4℃、5000r/min、离心5min，弃去上清液。4.用10ml冷的0.1mol/LNaCl悬浮菌液

5、。5.4℃、5000r/min，离心5min，弃去上清液。6.用1ml冷的CaCl2(20mmol/L)悬浮，分装成50μl／管，液氮中冷冻后至-80℃保存。农杆菌感受态细胞的制备：1.试剂配制：solution1：Rbcl1.21g100mMMgCl2.4H2O1.02g50mMK-Acetate0.29g30mMCaCl2.2H2O0.15g10mMGlycerol15%15ml，定容至100ml。pH=5.8，121度，高压灭菌30min。solution2：Rbcl0.12g10mMK-Acetate0.1g10mMCaCl2.2H2O1.1

6、g75mMGlycerol15%15ml，定容至100ml。pH=5.8，121度，高压灭菌30min。2.农杆菌感受态细胞的培养：15-20ml无抗生素的LB培养基，用牙签挑取农杆菌放入小三角瓶中，28度120转震荡培养过夜。（注意牙签和小三角瓶均需灭菌）3.制备感受态农杆菌：把已培养过夜的小三角瓶中的农杆菌分装到1.5ml小离心管中，室温下，4，000g，离心10min。弃去上清，每管加0.5mlsolution1，用手指弹管底部，以使菌体悬浮。冰上放置15mim-2h。4度，4，000g，离心10min。取出后放在冰上，弃去上清，每管加0.5m

7、lsolution2，用手指弹管底部，以使菌体悬浮，冰上放置15mim。分装感受态农杆菌，每管可分装3-4管。用液氮速冻后至-80℃冰箱中保存。版本四1)从新鲜YEP（5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，10g/L酵母浸出物，10g/L琼脂，50mg/L利福平，pH7.0）平板上挑取农杆菌LBA4404的单菌落，接种于5ml液体YEP培养基（含50mg/L利福平）中，28℃200r/min振摇培养过夜。2)取1ml菌液接种于50ml液体YEP培养基（含50mg/L利福平）中扩大培养，28℃200r/min振摇培养至OD600为0.5。3)冰浴30m

8、in，4℃5000r/min离心收集菌体，重悬浮于10ml0.15mol/LNaCl溶液中。4)再次4℃50