农杆菌感受态的制备及电击转化.doc

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1、农杆菌感受态的制备及电击转化（1）将农杆菌EHA105菌株在含有50mg/l利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48h；（2）挑取单克隆，于10ml含50mg/l利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；（3）当OD600达到0.5~0.7时，6000r/min4℃离心10min收集菌体；（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用；（5）取重组质粒（pROK2-LbDREB）1μl，加入100μlEHA105感受态细胞，混匀后冰上放置；（6）将混合液放入预冷的电击杯中，1800V电击；（

2、7）电击完成后迅速取出，加入500μlLB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1h复苏；（8）取适量菌液涂布于含50mg/l卡那、50mg/l利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48h；①农杆菌感受态细胞制备a.在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7；b.取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min；c.去除上清，用1ml10%无菌甘油重悬菌体，6000r/m

3、in离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基；d.向洗好的菌体用100μl20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。②根癌农杆菌的电击转化a.取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中；b.1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μlLB液体培养基，迅速吸打混匀；c.尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h；d.取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h

4、。农杆菌感受态制备准备工作：（能灭菌的都灭菌）菌种：EHA105GV310110%甘油100ml、20%甘油10ml、LB液体培养基100ml、利福平、冰100ml三角瓶、1.5ml离心管、各型号枪头、4℃离心机步骤：1、农杆菌于LB(或YEB)含利福平50mg/L，28℃，220rpm振荡培养至OD600达到0.6-0.7为宜。2、取1.5ml无菌离心管，每管分装1.5ml菌液，6000rpm，10min。3、去上层培养基，用10%无菌甘油洗3次。4、向洗好的菌体沉淀中加100ul20%无菌甘油，-80℃保存备用。v电击转化农杆菌准备工作：（能灭菌的都灭菌）

5、电击杯、1.5ml离心管、感受态农杆菌、LB固体液体培养基、卡那、利福平步骤：5、电激转化：电击杯冰上放置5min预冷，质粒100ng加入100ul感受态农杆菌中，吸打混匀后移到预冷的电击杯中，1800V电压（上下键同时按来选择电压），双击pulse2X键，约5-6s，听到蜂鸣声，屏幕显示CH9，迅速取出，加入500ul不含抗生素的LB（或SOC）液体培养基，迅速吸打混匀。6、摇菌复苏：尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移到无菌1.5ml离心管中，28℃培养1h复苏菌体。7、涂平板；铺制LB固体培养基平板，含Rif50mg/L及相应抗生素，取适量菌液（100-2

6、00ul）涂布。8、28℃培养约48h。注：电击杯冰上预冷至少5min，用完浸于75%乙醇。利福平（Rif）可先用4MNaOH3-4滴溶解，再用水定容，也可用几滴甲醇溶解再定容。配成10或20mg/ml即可。