弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析论文

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1、弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析论文【摘要】目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）的编码基因。方法:采用聚合酶链反应（PCR）扩增弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-TEasy载体，转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定，并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果:PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列，测序结果表明，获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1812bp，编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序

2、列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因，为其相关研究奠定了基础。【关键词】弓形虫核苷水解酶克隆序列分析Abstract:Objective:Tocloneandanalyzethenucleosidetriphosphatehydrolase(NTPase)geneofToxoplasmagondii.Methods:TheNTPasegeneplifiedbypolymerasechainreactio

3、n(PCR)fromRHstrainofToxoplasmagondiiandclonedintopGEM-TEasyvector.Positiveclonesplified,DNAsequenceanalysisshoologyofthisdeducedaminoacidssequenceagondii;NTPase;cloning;sequencing刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）是专性细胞内寄生的机会致病性原虫.freelega公司。淋巴细胞分离液购自Sigma公司；限制性

4、内切酶BglⅡ、HindⅢ和基因组DNA提取试剂盒均为大连宝生物产品；2×PCRMasterMix试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司；小量质粒抽提试剂盒购自宁波中鼎生物技术公司；200bpMarker及DNA凝胶回收试剂盒为上海生物工程技术有限公司产品。1.2模板DNA制备弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代，感染3d后无菌操作抽取腹水，虫体用生理盐水洗涤3次，加入与虫体混悬液等量的淋巴细胞分离液，800r/min离心8min后加速至2000r/min离心10min，收集中层虫体7，按DNA提取

5、试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。1.3PCR扩增根据弓形虫NTPase参考核苷酸序列8和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果，采用PrimerDesigner引物设计软件自行设计引物，由上海基康生物技术公司合成，引物序列如下：上游引物：5'-GAAGATCTACAGACTCATCGTCACTCCG-3'（下划线为BglⅡ酶切位点），下游引物：5'-GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC-3'（下划线为HindⅢ酶切位点）。采用2×PCRM

6、asterMix试剂盒扩增NTPase基因，PCR反应总体积为50μl：其中含有模板DNA5μl（200ng），上下游引物各1μl（终浓度为0.4μmol/L）。同时设立空白对照。PCR反应参数：95℃5min×1；95℃45s，58℃45s，72℃60s×30；72℃10min×1。1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收。1.4T-A克隆及测序回收的PCR产物与pGEM-TEasy载体16℃过夜连接。连接体系为10μl：纯化的PCR产物3μl，2×buffer5μl，pGEM-TEasyVec

7、tor1μl，T4DNA连接酶1μl。连接产物转化感受态E.coliDH5α，吸取200μl转化后的感受态细菌涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，筛选阳性克隆。阳性重组子经培养和提取质粒后，分别进行BglⅡ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定，并送上海基康生物技术公司测序。测序结果采用DNAMAN软件与Genebank公布的弓形虫NTPase基因9序列进行比较，并推导其编码的氨基酸序列。对获得的基因及其氨基酸序列的同源性、保守功能域、二级结构等进行生物信息学分析。2结果2.1PCR扩增结果从弓形虫RH株D

8、NA模板中扩增获得预期大小（1812bp）的目的条带（见图1）。2.2序列测定及推导的氨基酸序列的生物信息学分析2.2.1物理化学性质预测：测定的弓形虫NTPase编码区基因长1812bp，A+T含量为47.8%，G+C含量为52.2%，预测编码603个氨基酸，理论等电点为5.72，Mr为66900，其中含80个碱性氨基酸（K、R、H），78个酸性氨基酸（D、E），275个非极性疏水性氨基酸（G、A、V、L、I、F、P），170个极性氨基酸（、N、Q、T）。获得的NTPase编码基因及推导的氨基