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时间:2018-08-02
《形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析【摘要】目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)的编码基因。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增弓形虫RH株的NTPase基因,克隆入pGEM-TEasy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定,并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果:PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列,测序结果表明,获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1812bp,编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗
2、原表位。结论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因,为其相关研究奠定了基础。【关键词】弓形虫核苷水解酶克隆序列分析Abstract:Objective:Tocloneandanalyzethenucleosidetriphosphatehydrolase(NTPase)geneofToxoplasmagondii.Methods:TheNTPasegenewasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)fromRHstrainofToxoplasmagondiiandclonedintopGEM-TEasyvec
3、tor.PositivecloneswerescreenedandidentifiedbyBglⅡ、HindⅢdigestionandsequenced.TheDNAsequenceanditsdeducedproteinsequencewereanalyzed.Results:9TheNTPasegenewasspecificallyamplified,DNAsequenceanalysisshowedthatthelengthofclonedgenewas1812basepair.Thehomologyofthisdeducedaminoacidsseq
4、uencewas100%tothatintheGenebank.Conclusion:TheNTPase-Ⅱgeneissuccessfullycloned,providingbasisforthefutureresearchaboutthisgene.Keywords:Toxoplasmagondii;NTPase;cloning;sequencing刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是专性细胞内寄生的机会致病性原虫,呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶(nucleosidetriphosphatehydrolase,NTPase)为分布于弓形虫速殖
5、子表面一种主要特异性抗原[1,2],其对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用[3]。目前,国内关于弓形虫病诊断和疫苗候选抗原的研究主要集中在P30(SAG1)和P22抗原[4-6],而对NTPase的研究鲜见报道。因此,我们对弓形虫RH株的NTPase基因进行扩增与克隆,为下一步的研究奠定基础。1材料和方法1.1虫株和试剂弓形虫RH株由浙江省医学科学研究院寄生虫病研究所惠赠;E.coliDH5α为本室保存;pGEM-T9Easy载体购自Promega公司。淋巴细胞分离液购自Sigma公司;限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ和基因组DNA提取试剂盒均为大
6、连宝生物产品;2×PCRMasterMix试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司;小量质粒抽提试剂盒购自宁波中鼎生物技术公司;200bpMarker及DNA凝胶回收试剂盒为上海生物工程技术有限公司产品。1.2模板DNA制备弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代,感染3d后无菌操作抽取腹水,虫体用生理盐水洗涤3次,加入与虫体混悬液等量的淋巴细胞分离液,800r/min离心8min后加速至2000r/min离心10min,收集中层虫体[7],按DNA提取试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA,用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。1.3PCR扩增根据弓形虫NTPase参考核
7、苷酸序列[8]和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果,采用PrimerDesigner引物设计软件自行设计引物,由上海基康生物技术公司合成,引物序列如下:上游引物:5'-GAAGATCTACAGACTCATCGTCACTCCG-3'(下划线为BglⅡ酶切位点),下游引物:5'-GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC-3'(下划线为HindⅢ酶切位点)。采用2×PCRMasterMix试剂盒扩增NTPase基因,PCR反应总体积为50μl:其中含有模板DNA5μl(200ng),上下游引物各1μl(终浓度为0.4μmol/L)。同时设立空白对
8、照。PCR反应参数:95℃5min×1;95℃45s
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