弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析

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1、弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析【摘要】目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）的编码基因。方法:采用聚合酶链反应（PCR）扩增弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-TEasy载体，转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定，并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果:PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列，测序结果表明，获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1812bp，编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结

2、论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因，为其相关研究奠定了基础。【关键词】弓形虫核苷水解酶克隆序列分析Abstract:Objective:Tocloneandanalyzethenucleosidetriphosphatehydrolase(NTPase)geneofToxoplasmagondii.Methods:TheNTPasegeneplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)fromRHstrainofToxoplasmagondiiandclonedintopGEM-TEasyvector.Positiveclon

3、esplified,DNAsequenceanalysisshoologyofthisdeducedaminoacidssequenceagondii;NTPase;cloning;sequencing刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）是专性细胞内寄生的机会致病性原虫，呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶（nucleosidetriphosphatehydrolase，NTPase）为分布于弓形虫速殖子表面一种主要特异性抗原[1，2]，其对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用[3]。目前，国内关于弓形虫病诊断和疫苗候选抗原的研究主要集中在P30（SAG1）

4、和P22抗原[4-6]，而对NTPase的研究鲜见报道。因此，我们对弓形虫RH株的NTPase基因进行扩增与克隆，为下一步的研究奠定基础。1材料和方法1.1虫株和试剂弓形虫RH株由浙江省医学科学研究院寄生虫病研究所惠赠；E.coliDH5α为本室保存；pGEM-TEasy载体购自Promega公司。淋巴细胞分离液购自Sigma公司；限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ和基因组DNA提取试剂盒均为大连宝生物产品；2×PCRMasterMix试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司；小量质粒抽提试剂盒购自宁波中鼎生物技术公司；200bpMarker及DNA凝胶回收试剂盒为上海生物工程

5、技术有限公司产品。1.2模板DNA制备弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代，感染3d后无菌操作抽取腹水，虫体用生理盐水洗涤3次，加入与虫体混悬液等量的淋巴细胞分离液，800r/min离心8min后加速至2000r/min离心10min，收集中层虫体[7]，按DNA提取试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。1.3PCR扩增根据弓形虫NTPase参考核苷酸序列[8]和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果，采用PrimerDesigner引物设计软件自行设计引物，由上海基康生物技术公司合成，引物序列如下：上游引物：5'-GAAGATCTACAG

6、ACTCATCGTCACTCCG-3'（下划线为BglⅡ酶切位点），下游引物：5'-GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC-3'（下划线为HindⅢ酶切位点）。采用2×PCRMasterMix试剂盒扩增NTPase基因，PCR反应总体积为50μl：其中含有模板DNA5μl（200ng），上下游引物各1μl（终浓度为0.4μmol/L）。同时设立空白对照。PCR反应参数：95℃5min×1；95℃45s，58℃45s，72℃60s×30；72℃10min×1。1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收。1.4T-A克隆及测序回收的PCR产物与pGEM-TE

7、asy载体16℃过夜连接。连接体系为10μl：纯化的PCR产物3μl，2×buffer5μl，pGEM-TEasyVector1μl，T4DNA连接酶1μl。连接产物转化感受态E.coliDH5α，吸取200μl转化后的感受态细菌涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，筛选阳性克隆。阳性重组子经培养和提取质粒后，分别进行BglⅡ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定，并送上海基康生物技术公司测序。测序结果采用DNAMAN软件与Genebank公布的弓形虫NTPase基因[9]序列进行比较，并推导其编码的氨基酸序列。对获得的基因及其氨基酸序列的同源性、保守