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1、水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达论文龙铟，刘家云，刘莉，王宗仁【关键词】毕赤酵母SecretoryexpressionofhirudinsinPichiapastoris【Abstract】AIM:ToconstructhirudinexpressionvectorsandobtainitssecretoryexpressioninPichiapastoris(P.pastoris).METHODS:HirudinHV2andHV2N47KgenesplifiedbyPCRandthecorrectgenesedintoP.pastorisstra
2、inGSM1168,stablemulticopyintegrantsediumcontainingincreasingconcentrationsofG418.Thenthescreenedoutclonesethanoltoexpresshirudinproteins.Thesupernatantsofexpressionproductsboticactivityinedtoo.RESULTS:Theexpressionvectorsboticactivity.CONCLUSION:Hirudinscanbeexpressedsecreto
3、rilyinP.pastoris,edicinalis）中分离出的抗凝血活性成分，是凝血酶的天然抑制剂［1］，具有高效的抗血栓形成作用和非常广阔的应用前景［2-3］.但是天然水蛭素来源匮乏，限制了其研究和临床应用，我们以水蛭素HV2,HV2N47K的氨基酸序列为对象，通过PCR扩增得到了目的基因，克隆入毕赤酵母(PichiaPastoris)表达载体pPIC9K中，构建了水蛭素酵母分泌型表达载体，转化SMD1168毕赤酵母细胞并进行诱导表达，获得了具有抗凝血酶活性的表达产物，为水蛭素的研究及临床应用奠定了基础.1材料和方法1.1材料质粒pPIC
4、9,pPIC9K,Top10F菌株及毕赤酵母菌SMD1168由本实验室保存.TaKaRaTaq酶，限制性内切酶（EcoRI,XhoI,BamHI,.freelozymTH及ECL化学发光检测试剂盒购自Roche公司，鼠抗hirudin单抗(mAb)购自AntibodyShop公司，酵母基因组DNA纯化试剂盒购自上海华舜生物工程公司.电泳仪、电转仪均为BioRad公司产品.引物合成及DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成.1.2方法1.2.1水蛭素基因的获取根据水蛭素HV2的氨基酸序列，按照文献［4］方法，采用分段合成寡核苷酸片段，互补寡核苷酸
5、片段的退火配对后，进行PCR扩增而获得HV2基因.HV2N47K是经过DNA改组和噬菌体亲和筛选获得的具有较高抗凝血酶活性的水蛭素变异体［5］，HV2N47K基因经PCR从pCANTAB5EHV2N47K载体中获取.用于PCR扩增的上游引物P1：5′CTCTCGAGAAAAGAATTACTTAC3′，引入XhoI酶切位点，下游引物P2：5′GGGAATTCCTATTGTAAATATTC3′，引入EcoRI位点.PCR扩增参数：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸50s，共进行30个循环.扩增的PCR产物于15g/L琼脂糖凝胶中进行电泳
6、鉴定.1.2.2酵母表达载体的构建将PCR产物用EcoRI和XhoI双酶切，回收目的片段，插入经相同酶切的pPIC9载体，转化宿主菌TOP10F，提取质粒，酶切鉴定含有全长HV1基因的重组子，并将其送上海生工生物工程公司测序.DNA测序正确后(命名为pPIC9HV1)，再经BamHI,SalI酶切后定向插入毕赤酵母表达载体pPIC9K，得到高拷贝表达载体pPIC9KHV2.1.2.3酵母菌的转化及高拷贝整合菌株的筛选挑取GSM1168单菌落接种于10mLYPD中，30℃振荡过夜，1%体积转接至100mLYPD中扩大培养至A600=1.0；菌液于
7、4℃，1000g离心5min，菌体依次用50mL预冷的去离子水和10mL预冷的1mol/L山梨醇洗涤，最后将细胞重悬于1.0mL预冷的山梨醇溶液中.SalI线性化的pPIC9KHV1及空载体pPIC9K各10μg分别与100μL酵母细胞混匀，加入电转杯，冰浴5min，BioRad电转仪转化，电击结束后立即加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液，混匀.取0.5mL转化物涂布于MD（13.4g/LYNB,4×10-4g/LBiotin,20g/LDextrose,20g/L琼脂，1mol/L山梨醇）选择平板上，30℃培养2~4d，观察转化子的生长
8、.再将MD平板上生长的阳性克隆依次转种至含1,2,3,4,5g/LG418的MD平板上，以在高浓度G418上正常生长的菌落为高拷贝整合菌株.挑取高拷贝
