中国水仙凝集素在毕赤酵母中分泌表达的研究

《中国水仙凝集素在毕赤酵母中分泌表达的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、北京化工大学硕士学位论文北京化工大学硕士学位论文北京化工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：丝蛐碰日期：墟f2：：<：．1：关于论文使用授权的说明学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大学

2、。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在土年解密后适用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。作者签名：盈艘醴导师签名：五互岔垂日期：型!兰：!!三北京化工大学硕士学位论文北京化工大学硕士学位论文学位论文数据集中图分类号o,7学科分类号

3、黾o．⋯y论文编号t∞

4、Dh(2l≥≯密级学位授予单位代码10010学位授予单位名称北京化工大学

5、作者姓名张朋朋学号2009001230获学位专业名称化学工程与技术获学位专业代码OgJ7o；课题来源实验室自主立题研究方向蛋白表达论文题目中国水仙凝集素在毕赤酵母中的表达研究关键词重组凝集素，分泌表达，中国水仙，甘露糖结合，毕赤酵母论文答辩日期阳f2．，习论文类型聋张砑痕学位论文评阅及答辩委员会情况姓名职称工作单位学科专长指导教师王文雅副教授北京化工大学生物评阅人1郑国钧教授北京化工大学制药评阕人2李强副教授清华大学生物化工评阅人3评阅人4评阅人5答辩委员会主席豫劲蠢聪枝撇2女争彪鼢答辩委员1鄹国钧数缓t矽未位z舻铆兹答辩委员2瑙晶裹

6、旌托讹2天≯咎《落答辩委员3醚良别数姣托未化z1∈》别巍答辩委员4z呼把未亿2，天扩崆靴乙答辩委员5北京化工大学硕士学位论文V北京化工大学硕士学位论文中国水仙凝集素在毕赤酵母中的表达研究摘要凝集素表现出很多的活性，包括抗肿瘤，免疫调节，抗真菌，HIV-I逆转录酶抑制，和抗虫的性质等，有些还显示出抗菌和抗线虫的性质，在实际中有很大的应用前景。但是从原材料中提取纯化耗时费力，受原材料来源的限制，产量不高。使用大肠杆菌表达中国水仙凝集素的结果表明，重组蛋白较大一部分是以包涵体形式存在的，所以本论文研究了中国水仙凝集素在巴斯德毕赤酵母中的分泌

7、表达。本研究首先将中国水仙凝集素基因克隆到pPIC9K—T载体(本实验室构建)上，成功构建了毕赤酵母GSll5pPIC9K—NTL，但是SDS—PAGE电泳没有检测到明显的蛋白表达。通过对稀有密码子的检查，检查结果发现有使用频率为10—20％的密码子17个，使用频率为10％密码子18个，因此利用DNAWorks等软件合成了偏好于毕赤酵母的新凝集素基因(NTL-opt)。将优化后的水仙凝集素基因NTL—opt与pPIC9K—T载体连接，成功构建进毕赤酵母中，使用MD缺陷型培养基筛选，再使用PCR的方法进行验证酵母基因组，结果显示6个转化

8、子中有3个为阳性，成功得到重组毕赤酵母GSll5(pPIC9K—NTL—opt)。挑取一株单克隆重组毕赤酵母GSll5(pPIC9K—NTL—opt)，使用BMGY／BMMY有机培养基进行表达，SDS—PAGE和Westernblotting结果显示蛋白得到了成功表达。简单对比了有机培养基和无机培养基、，北京化工大学硕士学位论文的表达，蛋白产量并没有明显差异，因此选用无机盐培养基作为后期上罐发酵的培养基。使用bandscan等软件计算得到目标蛋白占总蛋白含量的80％以上。重组凝集素的性质研究显示，与天然凝集素凝集活性4．76相比，重组

9、水仙凝集素凝集活性为4．39，凝集活性相近；使用圆二色谱的方法分别测定天然和重组凝集素的二级结构，结果显示二者二级结构相似；对重组凝集素进行去糖基化研究，结果显示重组蛋白没有明显的糖基化作用。以上结论表明，重组水仙凝集素与天然水仙凝集素性质相似。在重组水仙凝集素毕赤酵母菌株构建成功及蛋白初步表达成功的基础上，使用5L的发酵罐进行了简单的发酵表达，发酵的基本条件为pH5．6，温度28。C，转速600rpm。研究了发酵过程中菌浓度，甘油浓度，铵离子浓度的变化。菌体在甘油为碳源的条件下生长迅速，加入甲醇进行诱导表达后生长较缓慢，菌浓度在发酵

10、罐中可以达到OD。∞为290。初始甘油浓度为309／L，在20h急速下降，40h时基本耗尽，也是此时开始加入甲醇进行诱导。中国水仙凝集素在此次表达中达到了较高的表达量，发酵液中的总蛋白含量最高可达到1000mg／L。关键