糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞骨保护素mrna表达的影响

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1、糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞骨保护素mRNA表达的影响作者：郭秀芳，任晓妹，魏芹，刘乃丰【摘要】目的：研究糖基化终产物(AGEs)对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）骨保护素（OPG）mRNA表达的影响。方法：体外培养VSMCs，在含10mmol·L－1β-甘油磷酸(β-GP)的培养液中加入不同浓度(0、50、100、200、400mg·L－1)的AGE-牛血清白蛋白(BSA)与VSMCs孵育不同时间(0、12、24、36、48、72h)。采用RT-PCR检测OPG的mRNA表达水平。结果：AGE-BS

2、A呈时间和剂量依赖性地增加VSMCsOPGmRNA的表达；200mg·L－1的AGE-BSA与VSMCs孵育24h，OPGmRNA表达水平达到高峰。结论：AGE-BSA能够促进大鼠VSMCsOPGmRNA的表达。【关键词】糖基化终产物；血管平滑肌细胞；钙化；骨保护素；大鼠心血管疾病是糖尿病(diabetesmellitus,DM)患者主要致死致残的原因，血管钙化是其病理生理基础［1］，是预测DM患者心血管事件的最适宜指标［2］。蛋白质非酶糖基化形成的糖基化终产物(advancedglycosylation

3、endproducts,AGEs)在介导高血糖致DM心血管疾病的过程中发挥着重要作用［3］。近来研究显示，骨保护素（osteoprotegerin,OPG）已经成为目前骨代谢和动脉钙化领域的重大发现和新课题。OPG的检测可能作为血管钙化早期诊断的指标之一［4］。本实验观察AGEs对培养的大鼠血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells,VSMCs）钙化的影响，以探讨血管钙化发生的机制。1材料和方法1.1材料牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)为BM公司产品，D

4、-葡萄糖(分析纯)为重庆北培化学试剂厂产品，SD大鼠购自东南大学医学院实验动物中心，VSMCs为SD大鼠原代培养所得，培养基DMEM、HEPES为GIBCO公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，TRIZOL为Invitrogen公司产品，RT-PCR试剂盒(Rever-tAidTMFirstStrandcDNASynthesis)购自TaKaRa公司，DNAMarker(100、200、300、400、500、600bp)购自上海申能博彩公司，OPG及3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物由上海生工

5、生物工程公司合成，琼脂糖(电泳级)购自MDBio公司，β-甘油磷酸(β-glycerophosphate,β-GP)购自Sigma公司。CO2恒温培养箱购自HaleForce公司，基因扩增仪购自Eppendorf公司，SCR-300电泳仪购自上海万达生物工程公司，GelDoc-Itimagingsystem扫描分析仪为UVP公司产品。1.2方法1.2.1AGE-BSA的制备参照2.2AGEs(200mg·L－1)干预细胞不同时间对OPGmRNA表达的影响见图2。用浓度为200mg·L－1的AGE-BSA分

6、别干预VSMCs0、12、24、36、48、72h，随着干预时间的延长，OPGmRNA的表达水平逐步升高，OPGmRNA表达在干预24h达到高峰，与GAPDH吸光度比值依次为0.484±0.027、0.644±0.039、0.927±0.036、0.805±0.020、0.639±0.041及0.519±0.030，与DMEM组（0.257±0.020）相比，有统计学差异(P＜0.01)。除72h干预组外，12、24、36、48h干预组与未干预组（0.484±0.027）相比均有统计学差异(P＜0.05)

7、。3讨论AGEs与DM血管病变的发生发展密切相关［3］。血管钙化是DM血管病变的特征性表现［1］。VSMCs向成骨样细胞表型转化在中膜钙化过程中起核心作用［6］。体外培养钙化的VSMC向成骨细胞表型转化，合成并分泌与钙化相关的碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原及非胶原性骨结合蛋白已被多个实验所证实［7］。OPG是一种属于肿瘤坏死因子受体超家族成员的分泌型蛋白,主要通过与OPG配体结合而起作用，在体内、外抑制破骨细胞形成。最近的临床研究提示，血清中OPG水平的增高与心血管病的死亡率之间有着显著相关性［4］。OP

8、G已成为骨代谢、血管疾病研究中的热点。本研究观察AGEs对培养大鼠VSMCs钙化的影响，旨在探讨AGEs在DM血管钙化发生中的可能机制。我们的研究发现，正常状态下，VSMCsOPGmRNA表达水平较低。用含10mmol·L－1β-GP的培养液培养VSMCs10d后，OPGmRNA有一定量表达，BSA对OPG表达无明显影响。AGE-BSA不同浓度梯度对VSMCs干预48h，随着AGE-BSA浓度升高，VSMCs表达OPGmRNA