荧光实时定量PCR 技术初探

《荧光实时定量PCR 技术初探》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences荧光实时定量PCR技术初探张鋆（责任编辑：xmale）摘要：少量的DNA序列的准确定量曾经是一件很难很累的事情，不过realtimePCR的出现把它变为和普通PCR差不多一样容易。原理是利用能特异标记PCR产物的荧光物质，显示PCR产物的动态累积，得到S型的扩增曲线；假设该曲线的前期PCR符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的基础上，通过比较产物积累的速度（时间）来间接比较（进而确定）初始模板的分子数。我们试验了标准曲线的制作，以及

2、对免疫相关的目的基因IL-4转录水平的定量，而且用HPRT持家基因对IL-4进行归一化。结果与RT-PCR相近。灵敏度，误差降低，可重复性有望更上一层楼。关键词：realtimePCR定量荧光SYBR扩增曲线标准曲线cDNAAbstract:IthadbeendifficultandtiringtoquantitateasmallamountofDNAuntiltheinventionofrealtimePCRtechnique,whichisaseasyasregularPCR.Itproducesandd

3、isplaysthekineticaccumulationofPCRproduct(oramplicon)----calledamplificationcurve.Assumingthatampliconsareamplifiedxexponentiallyduringtheearliercycles,wemakeuseofthesimpleequationy=atocomparethestartcopynumberofageneindifferentsamples,bymeasuringthethresho

4、ldcycle(Ct).Andwithsomestandard,copynumberofagenecanbequantified.Inthisexperimentwetriedmakingsomestandardcurves.ThenwequantifiedIL-4cDNAin3subsetsofThelpercell,normalizedbyHPRThousekeepinggene.TheresultcorrelateswithRT-PCR.However,sensitivity,deviationandp

5、recisionstillneedtobeimproved.Keyword:realtimePCRquantitationfluorescenceSYBRGreenIamplificationcurvestandardcurvecDNA收稿日期：2003-10-10；接受日期：2003-10-15作者简介：张鋆，生物技术专家。1生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences1前言1.1发明荧光实时定量PCR，由美国应用生物系统公司（AppliedBiosystems）在199

6、6年发明。除了realtime(quantitative)PCR，有人也称它为kineticPCR。顾名思义，它不单指数性扩增（已知部分序列的目的）DNA，而且通过检测每个循环PCR产物的总累积量（借助荧光标志），可以达到很好的定量结果。图1：ABIGeneAmp5700全套设备。组成：热循环仪，荧光检测器，电脑。1.2原理（1）PCR：Polymerasechainreaction.是体外模拟生物的DNA复制。需要DNA聚合酶，DNA模板，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs(dATP,ACTP,dGTP,dTT

7、P),以及适当的缓冲体系。NPCR产物的增长形式为２(如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N是循环数)。实际中，扩增效率不为100％。RealtimePCR是定量PCR的一种，当然是在PCR的基础上发展出来的。（普通）PCR包含很多因素，属性，如：试剂，温度，循环数，程序，PCR产物（扩增子，amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线），掺错率，扩增子长度。一般来说，人们关心的是扩增子的量。而realtimePCR主要利用的是扩增曲线（amplificationcurve）,循环数；扩增子长度，扩增效率

8、，扩增子多少，也加以考虑。普通PCR是在扩增完以后，（无论多少个循环），进行电泳，染色。对于判断目的DNA有没有，是出色的。但对于检测目的DNA有多少分子（初始的时候），则勉为其难。因为PCR的理想和实际仍相差一段距离。理论界普遍认为，PCR的起始若干循环内，由于原料，酶的充足，抑制子（抑制PCR的因素，如2生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciencesdNTPs分