2009 分子生物学实验-讲义

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1、《现代生物学实验》分子生物学部分目录实验一SDS法提取植物核酸……………………………………………………2实验二CTAB法提取植物核酸……………………………………………………2实验三DNA的纯化及利用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度……………3实验四质粒DNA的提取………………………………………………………4实验五PCR技术扩增DNA………………………………………………5实验六质粒DNA酶切………………………………………………………6实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳检测及目的DNA片段的回收………………7实验八DNA片段的重组………………………………………………9实验九大肠杆菌感受态细胞

2、制备………………………………………………10实验十外源基因遗传转化……………………………………………………11实验十一转基因水稻GUS报告基因检测………………………………………12实验十二分子生物学实验设计…………………………………………………11实验一SDS法提取植物核酸一、实验目的通过本实验了解SDS法提取植物组织总核酸的原理及方法。二、实验原理利用高浓度的SDS在较高温度下（55-65度）裂解细胞，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等，通过RNaseA消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。该法操作简便，能满足大多数实验需要。三、材

3、料市售新鲜豆苗，菠菜等。四．仪器用品1．用具玻棒、烧杯（250毫升），离心管（100毫升）、研钵、量筒（100毫升）、分析天平、紫外分光度计，37OC水浴、离心机等。2．药品配制（1）研磨缓冲液（pH7.0）：分别称取一定量的NaCl、柠檬酸三钠和EDTA三种药品，定容于1000毫升蒸馏水中（0.45mol/LNaCl，0.045mol/L柠檬酸三钠，0.1mol/LEDTA）（3×SSC），再在定容好的溶液中按1%比例加入SDS，调pH到7.0。（2）氯仿-异戊醇：按照氯仿：异戊醇=24：1比例配制。（3）溶解DNA溶液（pH7.0）：即0.1×SSC溶液，含有0.015mol/L

4、NaCl，0.0015mol/L柠檬酸三钠。（4）95%或100%乙醇4°C冰箱预冷五、实验步骤1.称新鲜豆苗或菠菜嫩叶1克，放在研钵内，加入与2-3ml的体积的研磨缓冲液，充分将植物组织研磨成为浆状物。2.将750ul浆状物加入一个1.5ml离心管内，加入等体积（750ul）的氯仿—异戊醇混合液，盖上管盖，剧烈摇晃30秒钟，以脱除组织蛋白质，转移至1.5ml离心管中。3.离心管平衡后，10000转/分离心5min，形成三层，小心的吸取上层含核酸的水溶液，弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4.将收集的水溶液放入一个新的1.5ml离心管中，在72°C下继续保温3分钟（不要超过

5、4分钟）以灭活组织内的DNA酶，然后迅速取出离心管，放在冰水浴中冷却到室温。5.取0.5ml溶液转入1.5ml离心管，加等体积95%或100%预冷乙醇水溶液，玻棒取出核酸，溶于适量0.1*SSC中，以待纯化使用。7五、作业1.在本实验中所用SDS在提取核酸过程中有何作用？2.在上清液中加入95%（或100%）乙醇后，你看到出现的核酸是什么状态？实验二CTAB法提取植物核酸一、实验目的通过本实验了解CTAB法提取植物组织核酸的原理及基本操作步骤。二、实验原理植物细胞中DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或染色体DNA，细胞质中含有少量的DNA，分布在线粒体和叶绿体内。植物细胞内的各种D

6、NA总称为总DNA。核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DNA分子。高等植物的核DNA约为109bp，如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。在DNA提取过程中，DNA分子的降解很难避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。植物DNA的提取常用有CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）和SDS（十二烷基硫酸钠）两种方法：CTAB是一种去垢剂，能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7mol/LNaCl）中可溶解，且能稳定存在，但如果降低盐的浓度（0.3mol/LNaCl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大部分的蛋白质及多糖仍溶于溶液中，这样通过离

7、心就可以去除蛋白质、多糖等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。三、材料新鲜干净的菠菜叶片或豆苗四．试剂和器材(1)1MTris-HCl(pH8.0)500mL :60.57gTris,pH8.0(2)CTAB分离缓冲液2%CTAB(W/V),1.4mol/LNaCL,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCL(pH8.0),0.2%巯基乙醇共100mL：2gCTAB,8.18gNaCL,0.74gEDT