分子生物学实验讲义总

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1、实验一：对虾（肌肉组织）基因组DNA的提取（下次上课时交这次课的实验报告，依此类推）一、实验目的：掌握提取动物基因组DNA的基本方法，基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。二、实验原理：利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团悬浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基

2、因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参

3、照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以对虾幼虾肌肉组织为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。三、实验材料、试剂和仪器：1.实验材料：-80℃保存的南美白对虾幼虾；（在116的超低温冰箱里，橘色盖子的冻存管中，可让研究生提前找好，每个冻存管中有2~3尾幼虾，学生做实验时，每个两人的小组取1/2或1/3尾幼虾进行研磨即可。）2.实验所需试剂：CTAB提取缓冲液、Tris-饱

4、和酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）、氯仿-异戊醇（24:1）、RNaseA、无水乙醇、75%乙醇、ddH2O（或TE）；（这3个标红色的试剂以前没用过，只用的是氯仿，RNaseA也没用过，所以提取效果很不好，所以最好让冯欣把这三个试剂赶紧订上）3.实验所需仪器及器皿：研钵、微量移液器、制冰机、高速冷冻离心机、超低温冰箱、1.5mL离心管。四、操作步骤：1.称取约0.2g对虾组织置于研钵中（研钵在上课前放入超低温冰箱中预冷），加入700μLCTAB提取缓冲液，在冰上充分研磨成匀浆后转入1.5mL离心管中；2.65℃水浴加热20min，中间

5、适当轻轻摇动；（4楼实验室的水浴锅很大，加热缓慢，去实验室后先打开水浴锅和制冰机，再开始讲课）3.（因时间关系，这个步骤可以选做）如要除去其中的RNA，可加5μLRNaseA(10μg/μL)，37℃保温30分钟；4.加入等体积（700μL）Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），轻轻振荡约10min，使两者混合均匀，4℃，9000rpm离心15min，将上清转移到一个新的离心管中；5.加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻振荡混匀，4℃，10000rpm离心5min，取约400μL上清转移到一个新离心管中；6.加入约2.5

6、倍体积（1mL）预冷的无水乙醇（无水乙醇在上课前放到超低温冰箱中），轻轻混匀，可见白色絮状DNA，-80℃沉淀约20min；7.4℃，10000rpm离心5min，弃上清；8.用75%乙醇洗涤一次，4℃，10000rpm离心5min，弃上清；9.空气干燥5~10min；10.加入50μL灭菌的ddH2O（或pH8.0的TE）溶解DNA，-20℃保存，取2μL进行电泳检测。（电泳检测由研究生代为完成，下次课前给学生看结果）  五、实验结果：1.加入预冷的乙醇后，可见核酸形成白色的絮状沉淀，离心后白色沉淀位于管底部，记录溶解状态和难易度，如果

7、难于溶解，说明混有蛋白；2.记录电泳后的条带结果。基因组DNA分子较大，经过枪头吹打后被打断成约20~40kb左右的片段，在电泳过程中迁移慢，移动距离较小；而RNA则大部分被降解，分子较小，迁移距离较大，跑在前方。六、分析与讨论：1.DNA的条带如果较弱，可能是由于部分降解所至。降解原因可能是由于对虾样本放置时间较长所至，也可能是研磨时加入的样本太多所至，导致研磨不充分，DNA没有充分释放出来。加入预冷的无水乙醇后再-80℃条件下沉淀时间较短，也可能导致DNA沉淀不充分。2.用酚仿抽提比用氯仿抽提效果好些，能很好的溶解脂类和蛋白质。3.在

8、低温条件下研磨对虾，可保持DNA结构的稳定性，减少对DNA的破坏，酚仿既可以充当有机溶剂，溶解脂类和蛋白质，又可蛋白变性剂，是蛋白变性，与DNA分离。实验二：PCR扩增目的基因（扩增河蟹高血糖