2009 分子生物学实验-讲义

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1、《现代生物学实验》分子生物学部分目录实验一SDS法提取植物核酸……………………………………………………2实验二CTAB法提取植物核酸……………………………………………………2实验三DNA的纯化及利用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度……………3实验四质粒DNA的提取………………………………………………………4实验五PCR技术扩增DNA………………………………………………5实验六质粒DNA酶切………………………………………………………6实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳检测及目的DNA片段的回收………………7实验八DNA片段的重组………………………………………………9实验九大肠杆菌感受态细胞制备

2、………………………………………………10实验十外源基因遗传转化……………………………………………………11实验十一转基因水稻GUS报告基因检测………………………………………12实验十二分子生物学实验设计…………………………………………………11实验一SDS法提取植物核酸一、实验目的通过本实验了解SDS法提取植物组织总核酸的原理及方法。二、实验原理利用高浓度的SDS在较高温度下(55-65度)裂解细胞,破坏蛋白质与DNA的结合,使DNA释放出来,通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等,通过RNaseA消化去除RNA,最后用乙醇沉淀DNA。该法操作简便,能满足大多数实验需要。三、材料市售新

3、鲜豆苗,菠菜等。四.仪器用品1.用具玻棒、烧杯(250毫升),离心管(100毫升)、研钵、量筒(100毫升)、分析天平、紫外分光度计,37OC水浴、离心机等。2.药品配制(1)研磨缓冲液(pH7.0):分别称取一定量的NaCl、柠檬酸三钠和EDTA三种药品,定容于1000毫升蒸馏水中(0.45mol/LNaCl,0.045mol/L柠檬酸三钠,0.1mol/LEDTA)(3×SSC),再在定容好的溶液中按1%比例加入SDS,调pH到7.0。(2)氯仿-异戊醇:按照氯仿:异戊醇=24:1比例配制。(3)溶解DNA溶液(pH7.0):即0.1×SSC溶液,含有0.015mol/LNaCl,0

4、.0015mol/L柠檬酸三钠。(4)95%或100%乙醇4°C冰箱预冷五、实验步骤1.称新鲜豆苗或菠菜嫩叶1克,放在研钵内,加入与2-3ml的体积的研磨缓冲液,充分将植物组织研磨成为浆状物。2.将750ul浆状物加入一个1.5ml离心管内,加入等体积(750ul)的氯仿—异戊醇混合液,盖上管盖,剧烈摇晃30秒钟,以脱除组织蛋白质,转移至1.5ml离心管中。3.离心管平衡后,10000转/分离心5min,形成三层,小心的吸取上层含核酸的水溶液,弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4.将收集的水溶液放入一个新的1.5ml离心管中,在72°C下继续保温3分钟(不要超过4分钟)以灭活组

5、织内的DNA酶,然后迅速取出离心管,放在冰水浴中冷却到室温。5.取0.5ml溶液转入1.5ml离心管,加等体积95%或100%预冷乙醇水溶液,玻棒取出核酸,溶于适量0.1*SSC中,以待纯化使用。7五、作业1.在本实验中所用SDS在提取核酸过程中有何作用?2.在上清液中加入95%(或100%)乙醇后,你看到出现的核酸是什么状态?实验二CTAB法提取植物核酸一、实验目的通过本实验了解CTAB法提取植物组织核酸的原理及基本操作步骤。二、实验原理植物细胞中DNA主要存在于细胞核内,称核DNA或染色体DNA,细胞质中含有少量的DNA,分布在线粒体和叶绿体内。植物细胞内的各种DNA总称为总DNA。

6、核DNA分子呈极不对称的线状结构,一条染色体为一个DNA分子。高等植物的核DNA约为109bp,如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。在DNA提取过程中,DNA分子的降解很难避免,因此提取得到的只是DNA分子的片段。植物DNA的提取常用有CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)和SDS(十二烷基硫酸钠)两种方法:CTAB是一种去垢剂,能与核酸形成复合物,这些复合物在高盐溶液(0.7mol/LNaCl)中可溶解,且能稳定存在,但如果降低盐的浓度(0.3mol/LNaCl),CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来,而大部分的蛋白质及多糖仍溶于溶液中,这样通过离心就可以去除蛋白质、多糖

7、等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。三、材料新鲜干净的菠菜叶片或豆苗四.试剂和器材(1)1MTris-HCl(pH8.0)500mL :60.57gTris,pH8.0(2)CTAB分离缓冲液2%CTAB(W/V),1.4mol/LNaCL,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCL(pH8.0),0.2%巯基乙醇共100mL:2gCTAB,8.18gNaCL,0.74gEDT

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