calphostin c 逆转人肾癌内源性阿霉素耐药作用的机制

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1、CalphostinC逆转人肾癌内源性阿霉素耐药作用的机制【摘要】　　目的探讨蛋白激酶Calpha抑制剂对肾癌细胞多药耐药（MDR）逆转作用的机制。方法应用荧光显色法、RTPCR检测PKCα基因的表达情况及PKCαcDNA转染肾癌7860细胞前后细胞中MDR1表达的变化；采用〔14C〕ADM标记法检测PKCα激动剂CalphostinC、抑制剂PMA作用PKCα/7860细胞系内阿霉素（ADM）浓度变化；测定PKC激动剂以及与PKC抑制剂对肾癌细胞细胞生长抑制率；分别测定ADM与PKC激动剂以及与PKC抑制剂协同作用后,7860细胞和肾

2、癌转染细胞系PKCα/7860耐药性的变化。结果肾癌转染细胞系PKCα/7860的MDR1表达水平高于肾癌7860细胞。CalphostinC、PMA作用后MDR1基因表达分别出现升高和降低。CalphostinC协同ADM对肾癌细胞具有较强的抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖关系。ADM与PKC抑制剂协同作用的PKCα/7860细胞系耐药性明显降低。结论PKCαcDNA的转染可以提高7860细胞的耐药性，而PKCα的选择性激动剂和选择性抑制剂则分别可以增加和逆转肾癌细胞对ADM的耐药性，其途径可能是通过促使肾癌细胞内源性ADM耐药发生变

3、化进而影响细胞内化疗药物的浓度来实现的。【关键词】蛋白激酶C；多药耐药；肾癌12　　在众多肿瘤组织中，肾癌细胞存在许多独特的特征，包括出现多药耐药（MDR）、对放疗效果不佳等。肾癌细胞内源性耐药表型的出现，使其对多种化疗药物失效。蛋白激酶C（PKC)作为一类钙磷脂依赖性磷酸化酶，广泛存在于机体内并分布在几乎所有的组织和器官中。不典型PKC(aPKC)包括PKCμ，ι和ζ三种亚型〔1〕。本研究前期工作已经证明肾癌组织中PKCα含量异常增高〔2〕。近期研究提示PKCα伴随MDR表型而呈现高表达现象〔3〕，提示PKCα抑制剂可能有助于提高抗癌药物发挥

4、抑制肿瘤细胞生长的作用。　　1材料与方法　　1.1材料　　7860人肾癌细胞，购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。PKCα要cDNA全长开放阅读框架(ORF)、羧基端融合绿色荧光蛋白(Cterminalfusiontogreenfluorescentprotein)的表达载体pcDNADEST47、ScriptFirststrandSynthesisForRTPCR试剂盒、脂质体Lipofectamine2000plus、Trizol试剂、GatewayBP和LRClonaseTMenzymemix购自Invitro

5、gen公司；G418购自GibercolBRL公司；PKC抑制剂CalphostinC、PKC激动剂佛波醇酯（PMA）和Adriamycin购自Sigma公司；〔14C〕Adriamycin购自GEHealthcareLifeSciences公司。PyrobestDNA聚合酶购自Takara公司。12　　1.2方法　　1.2.1细胞培养　　细胞置于37℃培养，RPMI1640培养基中，加入10％胎牛血清（FBS），2mmol/L谷氨酰胺及25mmol/LHEPEs,置入湿润的5％CO2培养箱中培养细胞。每2～3d传代1次，取对数生长期的细胞进

6、行实验。1.2.2质粒构建人PKCαcDNA采用GatewayTM技术、BP反应技术和LR反应重组技术及PyrobestDNA聚合酶，创建羧基端融合绿色荧光蛋白表达PKCα的pcDNADEST47PKCαGFP表达载体。扩增引物：5′ATGGCTGACGTTTTCCCGGGCAA3′；5′CATACTGCACTCTGTAAGATGGGG3′。扩增片段度为2245bp。　　1.2.3基因转染及鉴定　　取对数生长期7860细胞，以4×105/每孔接种12孔板，待完全贴壁后开始转染。以pcDNADEST47PKCαGFP表达载体

7、作为目的基因，按以下方法进行脂质体转染：0.6μgDNA，2μlplus,2μlLipofectamine2000plus,加入无血清RPMI1640培养液至反应终体积为500μl，吸取孔内培养液，加入转染液37℃孵育3～512h，换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃孵育24h，Fluoview共焦激光扫描显微镜下，激发波长为480nm，吸收波长为510nm。以FITC过滤观察绿色荧光蛋白的即时表达，观察转染效率同时观察荧光在细胞内亚细胞区域的分布变化。转染48h后，加入G418进行筛选,浓度为400ng/ml。培养2w,部分细

8、胞仍能表达GFP,但表达程度不一。约4w后，产生阳性克隆，传代扩增，命名为PKCα/7860细胞。然后用Trizol提取PKCα/7860细胞株总