calphostin c 逆转人肾癌内源性阿霉素耐药作用的机制

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1、CalphostinC逆转人肾癌内源性阿霉素耐药作用的机制【摘要】　　目的探讨蛋白激酶Calpha抑制剂对肾癌细胞多药耐药（MDR）逆转作用的机制。方法应用荧光显色法、RTPCR检测PKCα基因的表达情况及PKCαcDNA转染肾癌7860细胞前后细胞中MDR1表达的变化；采用〔14C〕ADM标记法检测PKCα激动剂CalphostinC、抑制剂PMA作用PKCα/7860细胞系内阿霉素（ADM）浓度变化；测定PKC激动剂以及与PKC抑制剂对肾癌细胞细胞生长抑制率；分别测定ADM与PKC激动剂以及与PKC抑制剂协同作用后,7860细胞和肾癌转染细胞系PKC

2、α/7860耐药性的变化。结果肾癌转染细胞系PKCα/7860的MDR1表达水平高于肾癌7860细胞。CalphostinC、PMA作用后MDR1基因表达分别出现升高和降低。CalphostinC协同ADM对肾癌细胞具有较强的抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖关系。ADM与PKC抑制剂协同作用的PKCα/7860细胞系耐药性明显降低。结论PKCαcDNA的转染可以提高7860细胞的耐药性，而PKCα的选择性激动剂和选择性抑制剂则分别可以增加和逆转肾癌细胞对ADM的耐药性，其途径可能是通过促使肾癌细胞内源性ADM耐药发生变化进而影响细胞内化疗药物的浓度来实现

3、的。【关键词】蛋白激酶C；多药耐药；肾癌　　在众多肿瘤组织中，肾癌细胞存在许多独特的特征，包括出现多药耐药（MDR）、对放疗效果不佳等。肾癌细胞内源性耐药表型的出现，使其对多种化疗药物失效。蛋白激酶C（PKC)作为一类钙磷脂依赖性磷酸化酶，广泛存在于机体内并分布在几乎所有的组织和器官中。不典型PKC(aPKC)包括PKCμ，ι和ζ三种亚型〔1〕。本研究前期工作已经证明肾癌组织中PKCα含量异常增高〔2〕。近期研究提示PKCα伴随MDR表型而呈现高表达现象〔3〕，提示PKCα抑制剂可能有助于提高抗癌药物发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。　　1材料与方法　　1.1材料　　

4、7860人肾癌细胞，购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。PKCα要cDNA全长开放阅读框架(ORF)、羧基端融合绿色荧光蛋白(CterminalfusiontogreenfluorescentprotEin)的表达载体pcDNADEST47、ScriptFirststrandSynthesisForRTPCR试剂盒、脂质体Lipofectamine2000plus、Trizol试剂、Gateemix购自Invitrogen公司；G418购自GibercolBRL公司；PKC抑制剂CalphostinC、PKC激动剂佛波醇酯（PMA）和A

5、driamycin购自Sigma公司；〔14C〕Adriamycin购自GEHealthcareLifeSciences公司。PyrobestDNA聚合酶购自Takara公司。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养　　细胞置于37℃培养，RPMI1640培养基中，加入10％胎牛血清（FBS），2mmol/L谷氨酰胺及25mmol/LHEPEs,置入湿润的5％CO2培养箱中培养细胞。每2～3d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。1.2.2质粒构建人PKCαcDNA采用Gateine2000plus,加入无血清RPMI1640培养液至反应终体积为500μl，吸取

6、孔内培养液，加入转染液37℃孵育3～5h，换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃孵育24h，Fluovie，吸收波长为510nm。以FITC过滤观察绿色荧光蛋白的即时表达，观察转染效率同时观察荧光在细胞内亚细胞区域的分布变化。转染48h后，加入G418进行筛选,浓度为400ng/ml。培养2ol/LPMA或100nmol/LCalphostinC作用PKCα/7860细胞，RTPCR检测PKCα激动剂、抑制剂作用前后细胞内MDR1表达（引物见表1）。表1各PCR引物及产物长度（略）　　1.2.5细胞内霉素（ADM）浓度的测定　　取对数生长期的PK

7、Cα/7860细胞,分别计数1×105个细胞接种于24孔板中,加入RPMI1640培养24h,待细胞贴壁后，以100nmol/LPMA或100nmol/LCalphostinC预作用PKCα/7860细胞，弃去培养液，更换终浓度为0.5μmol/L的〔14C〕ADM无血清培养液,5%CO2,37℃温育1.5h，使其到达稳定期,离心弃去含药培养液,用冷PBS将细胞洗3次。将细胞在含0.5%SDS的PBS0.2ml中重悬,裂解,液体闪烁计数仪测定其放射性，重复3次。　　1.2.6PKCα激动剂、抑制剂对肾癌细胞生长抑制影响　　以MTT法，将PKCα/7860细

8、胞接种96孔细胞培养板，